专利名称：治疗骨质疏松的ep4受体选择性激动剂的制作方法
背景技术：
本发明涉及包含前列腺素激动剂的方法和药物组合物，在脊椎动物、特别是哺乳动物、包括人类中可用于预防骨损失、恢复或增加骨质量和提高骨愈合，包括治疗呈现低骨质量和/或骨缺损的疾病。本发明具体涉及包含EP4受体选择性前列腺素激动剂的方法和药物组合物。
骨质疏松是一种全身性骨骼疾病，以低骨质量和骨组织衰退为特征，结果是骨脆性和骨折敏感性增加。在美国，该疾病波及两千五百万人以上，每年导致一百三十万人骨折，包括500,000例脊柱、250,000例髋部和240,000例腕骨折。髋部骨折是骨质疏松最为严重的后果，其中5-20％患者在一年内死亡，50％以上的幸存者丧失能力。
老年人面临最大的骨质疏松危险，因此预期随着人口的老化，这个问题日益突出。世界范围的骨折意外据预测在今后60年内增加三倍，一项研究估计在2050年世界上将有四百五十万例髋部骨折。
女性比男性面临更大的骨质疏松危险。女性在绝经后五年内经历骨损失的急剧加速。其他增加该危险的因素包括吸烟、酒精滥用、久坐的生活方式和低钙摄取量。
骨质疏松的治疗目前存在两种主要的药物疗法。第一种是使用抗吸收性化合物来减少骨组织的吸收。
雌激素是抗吸收剂的一个实例。已知雌激素减少骨折。另外，Black等在EP 0605193A1报道了雌激素、特别是当口服给药时降低血浆LDL水平，升高有益的血浆高密度脂蛋白(HDL)水平。不过，雌激素不能在既定的骨质疏松骨骼中恢复骨回到青壮年水平。此外，长期雌激素疗法已经牵涉各种疾病，包括子宫癌、子宫内膜癌和可能的乳腺癌的危险增加，导致很多女性回避这种治疗。显著不可取的与雌激素疗法有关的后果支持了对开发可供替代的骨质疏松疗法的需求，它们应当对血清LDL具有可取的效果，但是不会导致不可取的后果。
第二种类型的骨质疏松药物疗法是使用同化剂来促进骨生成，增加骨质量。这类药物预期恢复骨至既定的骨质疏松骨骼。
某些前列腺素激动剂公开在GB 1478281、GB 1479156和美国专利4,175,203、4,055,596、4,175,203、3,987,091与3,991,106中，它们例如可用作肾血管舒张药。
美国专利4,033,996公开了某些8-氮杂-9-氧代(与二氧代)-硫杂-11，12-seco前列腺素作为肾血管舒张药，可用于预防血栓生成、诱导生长激素释放和用作免疫应答调节剂。
法国专利897,566公开了某些氨基酸衍生物，用于治疗神经病学、精神或心血管疾病。
J.Org.Chem.(有机化学杂志)26，1961，1437公开了N-乙酰基-N-苄基-对氨基苯基巯基乙酸。
美国专利4,761,430公开了作为降脂剂的某些芳基苯磺酰胺化合物。
美国专利4,443,477公开了作为降脂剂的某些磺酰氨基苯基羧酸。
美国专利3,528,961公开了作为染剂的某些ε-己内酰胺衍生物。
美国专利3,780,095公开了作为利胆剂的某些酰化苯胺基羧酸。
美国专利4,243,678公开了某些酰基烃基氨基链烷酸，它们在胃溃疡的治疗中具有实用性，是皮脂腺分泌抑制剂，用于对抗皮肤炎症。
美国专利4,386,031公开了某些N-苯甲酰基-ω-苯胺基链烷羧酸，它们是抗变态反应剂、血栓形成性聚集抑制剂、抗炎剂和降脂剂。
除了骨质疏松以外，仅美国每年就有大约两千万至两千五百万女性和越来越多的男性因骨质量减少而患有可检测的椎骨骨折，另有250,000例髋部骨折见诸报道。与后者情况有关的是，在前两年内的死亡率为12％，有30％的患者在骨折后需要家庭护理。不仅如此，由于这些骨折愈合缓慢或不良，恢复期的经济与医学后果预期因总人口老化而增加。
雌激素已经显示(Bolander等，38th Annual Meeting OrthopedicResearch Society(第38届矫形研究学会年会)，1992)改善四肢骨折愈合的质量。因此，雌激素替代疗法应当是-种有效的骨折恢复的治疗方法。不过，患者对雌激素疗法的顺应性是相对较差的，这是由于它的副作用，包括月经的恢复、乳房痛、子宫癌的危险增加、乳腺癌的感知危险增加和孕激素的伴随使用。另外，男性可能反对使用雌激素治疗。对有益于患有衰弱性骨折的患者并且增加患者顺应性的疗法存在需求。
已经证明，前列腺素E2(PGE2)在切除卵巢的(OVX)大鼠模型中能够恢复损失的骨，这是-种绝经后骨质疏松的模型。Ke，H.Z.等，Bone(骨)，23249-255，1998。不过，存在与PGE2有关的严重副作用。Jee，W.S.S.和Ma，Y.F.Bone(骨)，21297-304，1997。
尽管存在各种骨质疏松疗法，在可供替代的骨质疏松疗法领域仍然存在持续的需求和持续的研究。另外，对骨折愈合疗法也存在需求。而且，对能够促进骨向存在缺损的骨骼区重新生长的疗法存在需求，这些缺损例如是由骨肿瘤所导致或产生的。进而，对能够促进骨向适用骨移植物的骨骼区重新生长的疗法存在需求。
发明概述本发明涉及治疗哺乳动物呈现低骨质量的疾病的方法，包含对所述哺乳动物给以EP4受体选择性激动剂、其前体药物或所述EP4受体选择性激动剂或所述前体药物的药学上可接受的盐。
本发明特别涉及这样的方法，其中所述疾病是骨质疏松、虚弱、骨质疏松性骨折、骨缺损、儿童自发性骨损失、牙槽骨损失、下颌骨损失、骨折、骨切开术、与牙周炎有关的骨损失或假体向内生长。在优选的本发明方法中，EP4受体选择性激动剂是全身给药的，例如口服、皮下、肌内或经由气雾剂。在其他优选的本发明方法中，EP4激动剂是局部给药的。
本发明的方法尤其可用于虚弱。
本发明的方法还尤其可用于骨质疏松。
本发明的方法还尤其可用于骨折或骨质疏松性骨折。
优选用在本发明方法中的EP4选择性激动剂包括式I化合物 其前体药物和所述化合物或所述前体药物的药学上可接受的盐，其中Q是COOR3、CONHR4或四唑-5-基；A是单键或顺式双键；B是单键或反式双键；U是 或 R2是α-噻吩基、苯基、苯氧基、单取代的苯基和单取代的苯氧基，所述取代基是氯、氟、苯基、甲氧基、三氟甲基或(C1-C3)烷基；R3是氢、(C1-C5)烷基、苯基或对-联苯基；R4是COR5或SO2R5；R5是苯基或(C1-C5)烷基。
优选用在本发明方法中的-组式I EP4受体选择性激动剂是其中Q是5-四唑基和U是 的那些式I化合物，构成式IA化合物。 在这组内特别优选的化合物包括5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮；5S-(3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮；5R-(3S-羟基-4-苯基-丁-1-烯基)-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮；和5S-(3R-羟基-4-苯基-丁基)-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。
优选用在本发明方法中的另一组式I EP4受体选择性激动剂是其中Q是COOH的那些式I化合物。在这组内特别优选的化合物包括7-{2S-[3R-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；7-(2S-(3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸；7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；7-(2S-(3R-羟基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸；和7-[2R-(3S-羟基-4-苯基-丁-1-烯基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸。
优选地治疗绝经后的女性和60岁以上的男性。还优选的是与年龄无关的个体，他们的骨质量显著减少，也就是在年龄的正常水平之下大于或等于1.5个标准偏差。
在本发明的方法中，呈现低骨质量的疾病例如包括骨质疏松、儿童自发性骨损失、牙槽骨损失、下颌骨损失、骨折、骨切开术、与牙周炎有关的骨损失和假体向内生长。
用于治疗“继发性骨质疏松”的方法也包括在本发明的方法内。“继发性骨质疏松”包括脊椎动物、例如哺乳动物(包括人类)的糖皮质激素诱发的骨质疏松、甲状腺机能亢进诱发的骨质疏松、固定术诱发的骨质疏松、肝素诱发的骨质疏松和免疫抑制诱发的骨质疏松。这些方法是这样进行的，对所述脊椎动物、例如哺乳动物给以“继发性骨质疏松”治疗量的EP4受体选择性前列腺素激动剂、其前体药物或所述EP4受体选择性前列腺素激动剂或所述前体药物的药学上可接受的盐。
本发明还有一个方面涉及用于在脊椎动物、例如哺乳动物(包括人类)面部重建、上颌骨重建和/或下颌骨重建之后加强骨移植物、诱导椎骨骨性结合、提高长骨延长、提高骨愈合的方法，包含对所述已经经历面部重建、上颌骨重建和/或下颌骨重建的脊椎动物、例如哺乳动物给以骨提高量的EP4受体选择性前列腺素激动剂、其前体药物或所述EP4受体选择性前列腺素激动剂或所述前体药物的药学上可接受的盐。本发明的活性EP4受体选择性前列腺素激动剂可以局部应用于骨重建的部位或者可以全身给药。
优选的剂量是约0.001至约100mg/kg/天的EP4受体选择性激动剂、其前体药物或所述化合物或所述前体药物的药学上可接受的盐。尤其优选的剂量是约0.01至约10mg/kg/天的EP4受体选择性激动剂、其前体药物或所述化合物或所述前体药物的药学上可接受的盐。
措辞“呈现低骨质量的疾病”指这样一种疾病，其中骨质量的水平低于因年龄而异的正常标准，这是由世界卫生组织″Assessment ofFracture Risk and its Application to Screening for PostmenopausalOsteoporosis(骨折危险度评估及其在筛选绝经后骨质疏松中的应用)(1994)。Report of a World Health Organization Study Group(国际卫生组织研究组报告)。World Health Organization Technical Series843″所定义的。包括在“呈现低骨质量的疾病”中的是原发性与继发性骨质疏松，如上所述。还包括牙周疾病、牙槽骨损失、骨切开术后和儿童自发性骨损失。措辞“呈现低骨质量的疾病”还包括骨质疏松的长期并发症，例如脊柱弯曲、高度减少和假体手术。
措辞“呈现低骨质量的疾病”还指脊椎动物、例如哺乳动物已知发展为上述疾病、包括骨质疏松的机会显著高于平均水平(例如绝经后的女性、50岁以上的男性)。其他骨质量增加或提高用途包括骨恢复、增加骨折愈合速度、完全代替骨移植手术、提高骨移植的成功率、面部重建或上颌骨重建或下颌骨重建之后的骨愈合、假体向内生长、椎骨骨性结合或长骨延长。
本发明的方法还可以与矫形装置联合使用，例如脊柱融合支架、脊柱融合硬件、内部与外部骨固定装置、螺钉和钉子。
本领域技术人员将认可，术语骨质量实际上指每单位面积的骨质量，有时(尽管严格上不准确)称为骨矿物质密度。
本文所用的术语“治疗”包括防止(例如预防)、减轻和治愈性治疗。
“药学上可接受的”表示载体、稀释剂、赋形剂和/或盐必须与制剂的其他成分是相容的，并且对其受药者无害。
表达方式“前体药物”指药物的前体化合物，它们在给药之后体内经由一定的化学或生理学过程释放药物(例如前体药物在生理学pH下或者通过酶的作用转化为所需的药物形式)。示范性前体药物在裂解后释放对应的药物化合物。
表达方式“药学上可接受的盐”指含有阴离子的无毒阴离子盐，例如(但不限于)氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、草酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、甲磺酸盐和4-甲苯磺酸盐。该表达方式还指无毒的阳离子盐，例如(但不限于)钠、钾、钙、镁、铵或质子化的苯乍生(N，N’-二苄基乙二胺)、胆碱、乙醇胺、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、苄乙胺(N-苄基苯乙胺)、哌嗪或氨丁三醇(2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇)。
本发明的方法导致骨生成，导致骨折率减少。本发明对本领域的重大贡献在于提供增加骨生成的方法，导致骨质疏松和有关骨障碍的预防、阻滞和/或消退。
本发明还涉及化合物，选自7-{2S-[3R-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮；7-(2S-(3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸；7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；和5S-(3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮。
本发明还特别涉及7-{2S-[3R-羟基-4-(3-苯氧基苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
本发明还特别涉及5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮。
本发明还特别涉及7-(2S-(3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸。
本发明还特别涉及7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
本发明还特别涉及5S-(3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮。
其他特征和优点将因描述发明的说明书和权利要求书而显而易见。
本发明的详细描述任何EP4受体选择性激动剂都可以用作本发明的EP4受体选择性激动剂。EP4选择性激动剂是这样的化合物，它们对EP1、EP2和EP3受体的IC50比对EP4受体亚型的IC50至少大10倍。例如，7-(2-(3-羟基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸是-种EP4受体选择性PGE2激动剂，它的EP4受体结合IC50为16nM。对所有其他EP受体亚型、包括EP1、EP2和EP3受体亚型来说，关于7-(2-(3-羟基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸的IC50大于3200nM。
式I化合物可以按照U.S.4,177,346所公开的方法制备，引用在此作为参考文献。
用在本发明方法中的EP4受体选择性激动剂全部是适合于治疗用途的活性剂，它们在脊椎动物、例如哺乳动物、特别是人类中刺激骨生成和增加骨质量。由于骨生成与骨质疏松和与骨有关的障碍的发展密切相关，用在本发明方法中的激动剂凭借它们对骨的作用预防、阻止和/或消退骨质疏松。
在本发明方法中用作脊椎动物、例如哺乳动物(尤其是人，特别是女性)呈现低骨质量的疾病(例如骨质疏松)治疗药物的EP4选择性激动剂的实用性在常规测定法中得到这些激动剂活性的证明，包括受体结合测定法、环AMP测定法、体内测定法和骨折愈合测定法，均如下所述。这类测定法还提供这样一种手段，由此能够比较EP4选择性激动剂彼此和与其他已知化合物和组合物的活性。这些比较的结果可用于确定用于治疗脊椎动物、例如哺乳动物、包括人的这类疾病的剂量水平。
体内测定法骨同化剂在刺激骨生成和增加骨质量中的活性可以在未受损伤的雄性或雌性大鼠、性激素缺陷型雄性(睾丸切除术)或雌性(卵巢切除术)大鼠中加以试验。
在该研究中可以使用不同年龄(例如3个月龄)的雄性或雌性大鼠。大鼠是未受损伤的或阉割的(切除卵巢或切除睾丸的)，对其皮下注射或管饲不同剂量(例如1、3或10mg/kg/天)的前列腺素激动剂达30天。在阉割大鼠中，治疗开始于手术后的第二天(目的是防止骨损失)或骨损失已经发生之时(目的是恢复骨质量)。在研究期间，所有大鼠可以自由接近水和含有1.46％钙、0.99％磷和4.96IU/g维生素D3的粒状商品饲料(Teklad啮齿动物饲料#8064，Harlan Teklad，Madison，WI)。在处死前12天和2天对所有大鼠皮下注射10mg/kg钙黄绿素。处死大鼠。测定下列终点股骨矿物质测量在尸体解剖时摘除每只大鼠的右股骨，利用双能量X-射线吸光分析(DXA，QDR 1000/W，Hologic Inc.，Waltham，MA)扫描，其中安装有″Regional High Resolution Scan″软件(Hologic Inc.，Waltham，MA)。扫描场大小为5.08×1.902cm，分辨率为0.0254×0.0127cm，扫描速度为7.25mm/秒。分析股骨扫描图象，测定全股骨(WF)、远侧股骨干骺端(DFM)、股骨干(FS)和近侧股骨(PF)的骨面积、骨矿物质含量(BMC)和骨矿物质密度(BMD)。
胫骨组织形态测定法分析在尸体解剖时摘除右胫骨，除去肌肉，切成三部分。将近侧胫骨和胫骨干固定在70％乙醇中，在逐级浓度的乙醇中脱水，在丙酮中脱脂，然后包埋在甲基丙烯酸甲酯(Eastman Organic Chemicals，Rochester，NY)中。
利用Reichert-Jung Polycut S切片机切制近侧胫骨干骺端的冠状切片，厚度为4和10μm。将4μm切片用改进的Masson氏三色染剂染色，而10μm切片保持未染色。每只大鼠的一份4μm切片和一份10μm切片用于骨松质的组织形态测定。
利用Reichert-Jung Polycut S切片机切制胫骨干的横切片，厚度为10μm。这些切片用于骨密质的组织形态测定。
骨松质的组织形态测定Bioquant OS/2组织形态测定系统(R&M Biometrics，Inc.，Nashville，TN)用于近侧胫骨干骺端次生松质距离生长板-骺接点1.2与3.6mm之间的静态与动态组织形态测定法测量。胫骨干骺端区的前1.2mm需要省略，目的是使测量限制在次生松质。4μm切片用于测定与骨体积、骨结构和骨吸收有关的指数，而10μm切片用于测定与骨生成和骨转换有关的指数。
I)与小梁骨体积和结构有关的测量和计算(1)总干骺端面积(TV，mm2)距离生长板-骺接点1.2与3.6mm之间的干骺端面积；(2)小梁骨面积(BV，mm2)TV内小梁骨的总面积；(3)小梁骨周长(BS，mm)小梁总周界的长度；(4)小梁骨体积(BV/TV，％)BV/TV×100；(5)小梁骨数量(TBN，#/mm)1.199/2×BS/TV；(6)小梁骨厚度(TBT，μm)(2000/1.199)×(BV/BS)；(7)小梁骨分离(TBS，μm)(2000×1.199)×(TV-BV)。
II)与骨吸收有关的测量和计算(1)破骨细胞数量(OCN，#)总干骺端面积内的破骨细胞总数；(2)破骨细胞周长(OCP，mm)被破骨细胞覆盖的小梁周界的长度；(3)破骨细胞数量/mm(OCN/mm，#/mm)OCN/BS；(4)破骨细胞周长百分率(％OCP，％)OCP/BS×100。
III)与骨生成和转换有关的测量和计算(1)单-钙黄绿素标记的周长(SLS，mm)用一种钙黄绿素标记物标记的小梁周界的总长度；(2)双-钙黄绿素标记的周长(DLS，mm)用两种钙黄绿素标记物标记的小梁周界的总长度；(3)标记间宽度(ILW，μm)两种钙黄绿素标记物之间的平均距离；(4)矿质化周长百分率(PMS，％)(SLS/2+DLS)/BS×100；(5)矿物质外积率(MAR，μm/天)ILW/标记间隔；(6)骨生成率/表面反射(BFR/BS，μm/d/μm)(SLS/2+DLS)×MAR/BS；(7)骨转换率(BTR，％/y)(SLS/2+DLS)×MAR/BV×100。
骨密质的组织形态测定Bioquant OS/2组织形态测定系统(R&M Biometrics，Inc.，Nashville，TN)用于胫骨干骨密质的静态与动态组织形态测定法测量。在骨膜与内密质表面上测量总组织面积、骨髓腔面积、骨膜周长、内密质周长、单标记的周长、双标记的周长和标记间宽度，计算骨密质面积(总组织面积-骨髓腔面积)、骨密质面积百分率(密质面积/总组织面积×100)、骨髓面积百分率(骨髓腔面积/总组织面积×100)、骨膜与内密质的标记周长百分率((单标记周长/2+双标记周长)/总周长×100)、矿物质外积率(标记间宽度/间隔)和骨生成率(矿物质外积率×[(单标记周长/2+双标记周长)/总周长])。
统计学利用StatView 4.0软件包(Abacus Concepts，Inc.，Berkeley，CA)可以进行统计学计算。差异性分析(ANOVA)试验和随后的Fisher’sPLSD(Stat View，Abacus Concepts Inc.，1918 Bonita Ave，Berkeley，CA 94704-1014)用于比较组间差异。
稳定过度表达重组人EP4受体的293-S细胞系中cAMP升高的测定使用基于所公开的序列(1)的寡核苷酸引物和来自原代人肺细胞的RNA(EP4)作为模板，通过逆转录酶聚合酶链反应生成代表人EP4受体的全部可译框架的cDNA。将cDNA克隆到pcDNA3(Invitrogen Corporation，3985B Sorrento Valley Blvd.，San Diego，CA 92121)的多个克隆部位，用于经由磷酸钙共沉淀法转染293-S人胚胎肾细胞。扩展G418-耐受性集落，试验特异性[3H]PGE2结合。证明高水平特异性[3H]PGE2结合的转染体进一步经过Scatchard分析法鉴定，以测定对PGE2的Bmax和Kd。选择用于化合物筛选的细胞系每个细胞具有大约256,400个受体，对PGE2(EP4)的Kd＝2.9nM。母代293-S细胞中受体的组成型表达可以忽略不计。在补充有胎牛血清(最终10％)和G418(最终700μg/ml)的RPMI中供养细胞。
293-S/EP4细胞系中的cAMP应答是这样测定的，经由剧烈重击从培养烧瓶内分离细胞到1ml Ca++与Mg++缺陷型PBS中，加入不含血清的RPMI至终浓度为1×10细胞/ml，加入3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)至终浓度为1mM。将一毫升细胞悬液立即等分到2ml带螺帽的微量离心机内，在37℃、5％CO2、95％相对湿度下敞口保温10分钟。然后按1∶100稀释比向细胞加入所要试验的化合物，以便最终的DMSO或乙醇浓度为1％。加入化合物后立即盖住试管，颠倒两次混和，在37℃下保温12分钟。然后在100℃下保温10分钟使样本溶解，立即在冰上冷却5分钟。以1000×g离心5分钟，使细胞碎屑形成粒状沉淀，将澄清的溶胞产物转移到新的试管内。利用商业上可得到的cAMP放射免疫测定试剂盒RIA(NEK-033，DuPont/NEN Research Products，549 Albany St.，Boston，MA 02118)，将澄清的溶胞产物按1∶10稀释在cAMP RIA测定缓冲液(包括在该试剂盒内)中后，测定cAMP浓度。通常，将细胞用6-8种浓度所要试验的化合物处理，浓度增量为1 log。利用剂量应答曲线直线部分的线性回归分析，在计算器上进行EC50计算。
参考文献1.Regan，J.W.Bailey，T.J.Pepperl，D.J.Pierce，K.L.Bogardus，A.M.Donello，J.E.Fairbairn，C.E.Kedzie，K.M.Woodward，D.F.和Gil，D.W.1994，克隆特征为药理学定义的EP2亚型的新的人前列腺素受体(Cloning of a Novel Human ProstaglandinReceptor with Characteristics of the Pharmaclogically DefinedEP2 Subtype).Mol.Pharmacology(分子药理学)46213-220.
与前列腺素E2受体结合的测定膜的制备所有操作均是在4℃下进行的。收获表达前列腺素E21型(EP1)、2型(EP2)、3型(EP3)或4型(EP4)受体的转染细胞，悬浮在A缓冲液(50mMTris-HCI(pH7.4)，10mM MgCl2，1mM EDTA，1mM Pefabloc肽，(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，IN)，10μM膦酰二肽，(Sigma，St.Louis，MO)，1μM抑胃酶肽A，(Sigma，St.Louis，MO)，10μM抑弹性蛋白酶肽，(Sigma，St.Louis，MO)，100μM抗蛋白酶肽，(Sigma，St.Louis，MO))中达2百万细胞每ml。在2个十五秒的爆发集落中用Branson Sonifier(Model#250，Branson UltrasonicsCorporation，Danbury，CT)进行声波处理，使细胞溶解。以100×g离心10分钟除去未溶解的细胞和碎屑。然后以45,000×g离心30分钟，收获膜。将膜的粒状沉淀再次悬浮达3-10mg蛋白质每ml A缓冲液，蛋白质的浓度是通过Bradford的方法(Bradford，M.，Anal.Biochem.(分析生物化学)，72，248(1976))测定的。然后将再次悬浮的膜贮存在-80℃下备用。
结合测定使如上制备的冷冻膜融化，稀释在上述A缓冲液中达0.5mg/ml(对大鼠EP2来说)或0.3mg/ml(对大鼠EP4来说)。将一体积膜制备物与0.05体积供试化合物或缓冲液和一体积3nM3H-前列腺素E2(#TRK 431，Amersham，Arlington Heights，IL)合并在A缓冲液中。将混合物(总体积为205μL)在25℃下保温1小时。然后利用Tomtec收获器(ModelMach II/96，Tomtec，Orange，CT)，通过GF/C型玻璃纤维滤器(#1205-401，Wallac，Gaithersburg，MD)过滤回收膜。通过滤器捕获结合有3H-前列腺素E2的膜，而缓冲液和未结合的3H-前列腺素E2通过滤器进入废液。然后将每份样本用3ml 50mM Tris-HCl(pH7.4)，10mMMgCl2，1mM EDTA洗涤3次。然后将滤器在微波炉内加热干燥。为了测定与膜结合的3H-前列腺素量，将干燥过的滤器放置在含有闪烁流体的塑料袋内，在LKB 1205 Betaplate读数器(Wallac，Gaithersburg，MD)中计数。从代替50％特异性结合的3H-前列腺素E2所需要供试化合物的浓度测定IC50。
按照本领域技术人员已知的方法生成表达大鼠EP2或EP4前列腺素E2受体的293S细胞。通常，按照上面公开的熟知方法制备相当于所公开的全长受体5’与3’末端的PCR(聚合酶链反应)引物，在利用来自大鼠肾的总RNA的RT-PCR反应中用于EP2和EP4受体。
关于大鼠EP2受体的全长编码序列是按照Nemoto等，Prostaglandins(前列腺素)，1997，54，713-725所公开的方法制备的。关于大鼠EP4受体的全长编码序列是按照Sando等，Biochem.Biophys.Res.Comm.(生物化学与生物物理学研究通讯)，1994，200，1329-1333所公开的方法制备的。这些全长受体用于制备表达EP2和EP4受体的293S细胞。
关于EP1受体的全长编码序列是按照Funk等，Journal ofBiological Chemistry(生物化学杂志)，1993，268，26767-26772所公开的方法制备的。关于EP2受体的全长编码序列是按照Regan等，Molecular Pharmacology(分子药理学)，1994，46，213-220所公开的方法制备的。关于EP3受体的全长编码序列是按照Regan等，BritishJournal of Pharmacology(英国药理学杂志)，1994，112，377-385所公开的方法制备的。关于EP4受体的全长编码序列是按照Bastien，Journal of Biological Chemistry(生物化学杂志)，1994，269，11873-11877所公开的方法制备的。这些全长受体用于制备表达EP1、EP2、EP3和EP4受体的293S细胞。
按照本领域技术人员已知的方法生成表达人EP1、EP2、EP3或EP4前列腺素E2受体的293S细胞。通常，按照上面公开的熟知方法制备相当于所公开的全长受体5’与3’末端的PCR(聚合酶链反应)引物，用在利用来自人肾(对EP1来说)、人肺(对EP2来说)、人肺(对EP3来说)或人淋巴细胞(对EP4来说)的总RNA作为来源的RT-PCR反应中。通过TA悬突法将PCR产物克隆到pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，通过DNA测序确认所克隆的受体的同一性。
通过电穿孔法将293S细胞(Mayo，Dept.of Biochemistry，Northwestern Univ.)用所克隆的受体转染在pcDNA3中。在选择被G418转染的细胞之后，建立表达该受体的稳定细胞系。
使用未标记的PGE2作为竞争剂，在全细胞3H-PGE2结合测定之后选择表达最大数量受体的克隆细胞系。
骨折愈合测定法全身给药后对骨折愈合的效果测定骨折技术将3月龄Sprage-Dawley大鼠用氯胺酮麻醉。在右胫骨或股骨近侧的前正中面上切1cm切口。下面描述胫骨手术技术。使切口进行至骨处，在距离胫骨粗隆远侧4mm和前脊内侧2mm处钻1mm洞。利用0.8mm不锈钢管进行髓内插钉术(最大负载36.3N，最大刚度61.8N/mm，在与骨相同的条件下试验)。没有进行髓管的纹孔。利用带有钝爪的特殊设计的可调钳进行三点弯曲，在胫腓接点上2mm处产生标准化的闭合骨折。为了减少软组织损伤，注意不使骨折移位。用单丝尼龙缝合线缝合皮肤。手术是在无菌条件下进行的。在插钉术后立即拍摄放射照片，排除骨折位于指定骨干区之外或者插钉移位的大鼠。将其余动物随机分为下列几组，在每个时间点每个小组有10-12只动物，试验骨折的愈合。第一组每日接受载体(水∶100％乙醇＝95∶5)管饲1ml/大鼠，而其他组每日接受0.01至100mg/kg/天供试化合物管饲(1ml/大鼠)达10、20、40和80天。
在10、20、40和80天，将每组的10-12只大鼠用氯胺酮麻醉，通过驱血法处死。解剖摘除两侧胫腓骨，剥离所有软组织。将来自每组5-6只大鼠的骨贮存在70％乙醇中进行组织学分析，将来自每组另外5-6只大鼠的骨贮存在Ringer氏缓冲溶液(+4℃，pH 7.4)中进行放射照相和生物力学试验。
组织学分析骨折骨的组织学分析方法以前已经为Mosekilde和Bak所公开(TheEffects of Growth Hormone on Fracture Healing in RatsAHistological Description(生长激素对大鼠骨折愈合的影响组织学描述).Bone(骨)，1419-27，1993)。简而言之，将骨折部位锯开8mm至骨折线的每一侧，未脱钙地包埋在甲基丙烯酸甲酯中，在Reichert-Jung Polycut切片机上切8μm厚的冠状切片。使用Masson三色染剂染色的中-冠状切片(包括胫骨和腓骨)造影观察经过和没经过治疗的细胞和组织对骨折愈合的响应。粘胶纤维红染色的切片用于证明骨痂结构特征和区分骨折部位上的网状骨与板状骨。进行下列测量(1)骨折间隙——测量骨折中骨密质两端之间的最短距离，(2)骨痂长度和骨痂直径，(3)骨痂的总骨体面积，(4)骨痂区内每组织面积的骨组织，(5)骨痂中的纤维组织，和(6)骨痂中的软骨面积。
生物力学分析
生物力学分析方法以前已经为Bak和Andreassen所公开(TheEffects of Aging on Fracture Healing in Rats(年龄对大鼠骨折愈合的作用)，Calcif Tissue Int 45292-297，1989)。简而言之，在生物力学试验之前拍摄所有骨折的放射照片。通过破坏性三点或四点弯曲工艺分析愈合中的骨折的力学性质。测定最大负载、刚度、最大负载下的能量、最大负载下的偏转和最大应力。
局部给药后对骨折愈合的效果测定骨折技术在该研究中使用处于麻醉下的大约2年龄的雌性或雄性beagle狗。通过缓慢连续的三点弯曲负载产生横向桡骨骨折，如Lenehan等所述(Lenehan，T.M.；Balligand，M.；Nunamaker，D.M.；Wood，F.E.Effects of EHDP on Fracture Healing in Dogs(EHDP对狗骨折愈合的影响).J Orthop Res(矫形研究杂志)3499-507；1985)。拉一条线穿过骨折部位，以确保完全的解剖学上的骨裂。此后，通过缓慢释放粒状沉淀或者以适合的制剂给药达10、15或20周，例如糊剂、凝胶剂溶液或悬液，进行化合物的缓慢释放，实现前列腺素激动剂向骨折部位的局部释放。
组织学分析骨折骨的组织学分析方法以前已经为Peter等(Peter，C.P.；Cook，W.O.；Nunamaker，D.M.；Provost，M.T.；Seedor，J.G.；Rodan，G.A.Effects of alendronate on fracture healing and bone remodelingin dogs.J.Orthop.Res.(矫形研究杂志)1474-70，1996)和Mosekilde与Bak(The Effects of Growth Hormone on FractureHealing in RatsA Histological Description.Bone(骨)，1419-27，1993)所公开。简而言之，在处死后，将骨折部位锯开3cm至骨折线的每一侧，未脱钙地包埋在甲基丙烯酸甲酯中，在Reichert-Jung Polycut切片机上切8μm厚的冠状切片。使用Masson三色染剂染色的中-冠状切片(包括胫骨和腓骨)造影观察经过和没经过治疗的细胞和组织对骨折愈合的响应。粘胶纤维红染色的切片用于证明骨痂结构特征和区分骨折部位上的网状骨与板状骨。进行下列测量(1)骨折间隙——测量骨折中骨密质两端之间的最短距离，(2)骨痂长度和骨痂直径，(3)骨痂的总骨体面积，(4)骨痂区内每组织面积的骨组织，(5)骨痂中的纤维组织，和(6)骨痂中的软骨面积。
生物力学分析生物力学分析方法以前已经为Bak和Andreassen(The Effects ofAging on Fracture Healing in Rats.Calcif Tissue Int 45292-297，1989)和Peter等(Peter，C.P.；Cook，W.O.；Nunamaker，D.M.；Provost，M.T.；Seedor，J.G.；Rodan，G.A.Effects of AlendronateOn Fracture Healing And Bone Remodeling In Dogs.J.Orthop.Res.(矫形研究杂志)1474-70，1996)所公开。简而言之，在生物力学试验之前拍摄所有骨折的放射照片。通过破坏性三点或四点弯曲技术分析愈合中的骨折的力学性质。测定最大负载、刚度、最大负载下的能量、最大负载下的偏转和最大应力。
按照本发明的方法，EP4受体选择性激动剂的给药可以经由任意全身和/或局部释放EP4受体选择性激动剂的方式(例如在骨折、骨切开术或矫形手术的部位)。这些方法包括口服、肠胃外或十二指肠内途径等。一般来说，本发明的化合物是口服给药的，但是也可以采用肠胃外给药(例如静脉内、肌内、透皮、皮下、直肠或骨髓内)，例如口服给药对靶来说是不适合的或者患者不能摄入药物。
通过EP4受体选择性激动剂的局部用药(例如至骨切开术的骨折部位)，本发明的方法用于治疗和促进骨折和骨切开术的愈合。将本发明的EP4受体选择性激动剂施用于骨折或骨切开术的部位，例如将在适合溶剂(例如油性溶剂，如花生油)中的化合物注射到软骨生长板，或者在开放手术的情况下，向那里局部施用在适合载体或稀释剂中的化合物，例如骨蜡、软化骨粉、聚合的骨粘固粉、骨密封胶等。作为替代选择，局部用药可以这样实现，将化合物在适合载体或稀释剂中的溶液或分散系涂抹在矫形手术常用的固体或半固体植入物表面或者结合在其内部，例如涤纶网、凝胶泡沫与kiel骨或假体。
无论如何，化合物的给药量与时机当然将取决于所治疗的受药者、疾患的严重性、给药的方式和主治医师的判断。因而，由于患者之间的差异性，本文给出的剂量是指导性的，医师可以斟酌其认为适合于患者的、实现疗效(例如骨质量增加)的药物化合物剂量。在考虑所需治疗的程度时，医师必须平衡各种因素，例如骨质量起始水平、患者的年龄、先前存在的疾病以及其他疾病的存在(例如心血管疾病)。
一般来说，EP4受体选择性激动剂的用量足以增加骨质量至骨折域值(如本文前面所引用的World Health Organization Study所述)以上的水平。
用在本发明方法中的EP4受体选择性激动剂化合物一般是以药物组合物的形式给药的，其中包含至少一种本发明的化合物以及药学上可接受的载体或稀释剂。因而，EP4受体选择性激动剂可以以任意常规的口服、鼻内、肠胃外、直肠或透皮剂型单独给药。
关于口服给药，药物组合物可以采取溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂等剂型。可以采用片剂，其中含有各种赋形剂，例如柠檬酸钠、碳酸钙和磷酸钙，以及各种崩解剂，例如淀粉、优选为马铃薯或木薯淀粉和某些复合硅酸盐，以及粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外，出于制片目的，润滑剂也经常是非常有用的，例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石。也可以采用相似类型的固体组合物作为明胶软与硬胶囊中的填充剂；这方面优选的材料还包括乳糖或奶糖以及高分子聚乙二醇。若口服给药需要水悬液和/或酏剂，本发明的组合物可以与各种甜味、矫味剂、着色剂、乳化剂和/或悬浮剂结合，以及与稀释剂结合，例如水、乙醇、丙二醇、甘油和它们的各种组合。
出于肠胃外给药的目的，可以采用在芝麻油或花生油中的溶液或者在丙二醇水溶液，以及相应水溶性盐的无菌水溶液。如果必要的话，这类水溶液可以被适当缓冲，液体稀释剂首先被足量盐水或葡萄糖赋予等渗性。这些水溶液尤其适合域静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射的目的。在这方面，所用无菌水性介质都可以通过本领域技术人员熟知的标准工艺获得。
出于透皮(例如局部)给药的目的，制备稀的、无菌的、含水或部分含水的溶液(浓度通常约0.1％至5％)或者类似于上述的肠胃外溶液。
制备含有一定量活性成分的各种药物组合物的方法本领域技术人员来说是已知的或者鉴于本文的公开将是显而易见的。关于制备药物组合物的方法实例，参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington药物科学)，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，第19版(1995)。
研究方案本研究的目的是测定EP4受体选择性激动剂、具体为7-(2-(3-羟基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸在OVX大鼠模型中是否能够恢复骨质量。
将Sprague-Dawley雄性大鼠在3.5月龄时切除卵巢(OVX)。OVX后十个月，向大鼠皮下按30mg/kg/天注射载体或7-(2-(3-羟基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸达28天进行处理。解剖大鼠的尸体。在尸体解剖时摘除每只大鼠的右股骨，利用双能量X-射线吸光分析(DEXA，QDR 1000/W，Hologic Inc.，Waltham，MA)扫描，其中安装有″Regional High Resolution Scan″软件(Hologic Inc.，Waltham，MA)。扫描场大小为5.08×1.902cm，分辨率为0.0254×0.0127cm，扫描速度为7.25mm/秒。分析股骨扫描图象。按照H.Z.Ke等，Droloxifene，a New Estrogen Antagonist/Agonist，Prevents Bone Loss inOvariectomized Rats.ENDOCRINOLOGY(内分泌学)136；2435-2441，1995所述方法，测定全股骨(WF)、远侧股骨干骺端(DFM)、股骨干(FS)和近侧股骨(PF)的骨矿物质含量(BMC)和骨矿物质密度(BMD)。
研究结果和讨论与用载体处理的OVX大鼠相比，用7-(2-(3-羟基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸处理的OVX大鼠显示总股骨BMC增加了17％，总股骨BMD增加了13％，远侧股骨BMC增加了8％，远侧股骨BMI增加了8％，股骨干BMC增加了20％，股骨干BMD增加了18％。在用7-(2-(3-羟基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸处理的大鼠中没有见到PGE2样副作用。
该数据显示，EP4受体选择性PGE2激动剂7-(2-(3-羟基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸在已建立的骨质稀少OVX大鼠中刺激骨生成和恢复骨。
一般实验工艺在约23℃下，按400MHz在Varian Unity 400分光计(Varian Co.，Palo Alto，California)上记录质子NMR光谱。化学漂移以百万分之份数表示。峰形表示如下s单峰；d双峰；t三重峰；q四重峰；m多重峰；bs宽的单峰。在Fisons Platform II分光计上得到大气压化学电离(APCI)质谱。若描述含氯或溴离子的强度，则观测预期的强度比(对于含35Cl/37Cl离子大约为3∶1，对于含79Br/81Br离子大约为1∶1)，仅给出较低质量离子的强度。
在氮压力下利用Biotage纯化系统(Biotage，Dyax Corporation，Charlottesville，Virginia)进行中压色谱法。在低氮压力下，在玻璃柱中，利用Baker硅胶(40m)(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)或硅胶60(EM Sciences，Gibbstown，N.J.)进行快速色谱法。利用Chromatotron(model 7924T，Harrison Research)进行径向色谱法。利用Analtech Uniplates硅胶GF(20×20cm)(Ahaltech，Inc.Newark，DE)进行制备色谱法。用作反应溶剂的二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)和二氯甲烷(CH2Cl2)是无水级的，由Aldrich Chemical Company(Milwaukee，Wisconsin)提供。术语“浓缩”指在旋转蒸发器上、在水抽吸压力下除去溶剂。缩写“h”代表小时。术语“TBAF”指氟化四丁基铵。术语“DMAP”指二甲氨基吡啶。术语“二氯甲烷”和“亚甲基氯”是同义词，在本说明书和实施例与制备例中可互换使用。
实施例17-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸 步骤A7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。在0℃下，向[3-(3-氯-苯基)-2-氧代-丙基]-膦酸二甲酯(2.66g，9.63mmol)的THF(35ml)溶液中分批加入NaH(60重量％油悬液，426mg，10.7mmol)。将反应混合物在室温下搅拌40分钟。将反应混合物冷却至0℃，加入7-(2R-甲酰基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯(假定10.6mmol，按照制备例7所述方法制备，但是使用不同量的试剂)的THF溶液，将反应系搅拌18小时。加入AcOH，反应混合物用EtOAc稀释。有机溶液连续用饱和NaHCO3溶液(2x)、水(1x)和盐水(1x)洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。残余物经过中压色谱法纯化，用含有15％丙酮的甲苯洗脱，得到7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(2.26g)。1H NMR(CDCl3)δ7.27-7.15(m，3H)，7.08(m，1H)，6.66(dd，1H)，6.20(d，1H)，4.17(m，1H)，4.11(q，2H)，3.82(s，2H)，3.55(m，1H)，2.72(m，1H)，2.46-2.23(m，5H)，1.79(m，1H)，1.58(m，2H)，1.47-1.20(m，9H)；MS 420.2(M+1)，418.2(M-1).
步骤B7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3S-羟基-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。向7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(2.1g，5.0mmol)的无水CH2Cl2(200ml)溶液中加入(R)-2-甲基-CBS-氧氮杂borolidine(1M甲苯溶液，5ml，5mmol)，将溶液冷却至-45℃。将反应混合物搅拌20分钟，加入儿茶酚硼烷(1M THF溶液，15ml，15mmol)。将反应混合物在-45℃下搅拌18小时。加入HCl水溶液(1N，100ml)，将反应混合物在室温下搅拌18小时。分离酸性含水层，有机溶液用冰冷的1N NaOH(2x)、再用盐水(1x)洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化(1∶1 EtOAc∶己烷至含有80％EtOAc的己烷)，得到7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3S-羟基-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(800mg)，1H NMR鉴定为3S∶3R醇非对映体的大约6∶1混合物。1H NMR(CDCl3)δ7.23-7.17(m，3H)，7.06(m，1H)，5.67(dd，1H)，5.46(dd，1H)，4.37(m，1H)，4.08(q，2H)，4.00(m，1H)，3.44(m，1H)，2.80(m，2H)，2.67(m，1H)，2.41-2.12(m，5H)，1.70-1.20(m，13H)；MS 422.3(M+1).
步骤C7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。向7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3S-羟基-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(800mg，1.90mmol)的EtOH(50ml)溶液中加入10％披钯碳(80mg)。将反应混合物在45psi Parr摇动器上氢化4.5小时。借助EtOH通过C盐TM过滤除去催化剂。经过中压色谱法纯化(1∶1己烷∶EtOAc至4∶1 EtOAc∶己烷)，得到7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(625mg)。
1H NMR(CDCl3)δ7.27-7.21(m，3H)，7.09(m，1H)，4.10(m，2H)，3.84(m，1H)，3.61(m，2H)，2.90(m，1H)，2.78(dd，1H)，2.68(m，1H)，2.47-2.25(m，4H)，2.12(m，1H)，1.92-1.22(m，17H)；MS424.3(M+1).
步骤D7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。向7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(595mg，1.40mmol)的EtOH(25ml)溶液中加入2NNaOH(6ml)。将反应系在室温下搅拌24小时，在真空中浓缩至约原体积的3/4。加入1N HCl水溶液，得到pH约为2。水溶液用亚甲基氯洗涤(3x)。合并有机层，用水、再用盐水洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到实施例1的标题化合物(500mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.26-7.18(m，3H)，7.08(m，1H)，3.84(m，1H)，3.58(m，2H)，2.90(m，1H)，2.77(dd，1H)，2.68(m，1H)，2.43-2.28(m，4H)，2.10(m，1H)，1.78(m，1H)，1.66-1.22(m，13H)；MS 396.2(M+1)，394.2(M-1).
实施例27-{2S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸 步骤A7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。遵循实施例1步骤A所述工艺，使从[2-氧代-3-(3-三氟甲基-苯基)-丙基]-膦酸二甲酯(4.16g，13.40mmol)和NaH(60％油悬液，590mg，14.7mmol)衍生的阴离子与7-(2R-甲酰基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯(假定14.74mmol)反应24小时。经过中压色谱法纯化(溶剂梯度含有20％EtOAc的己烷至EtOAc)，得到7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(4.29g)。1H NMR(CDCl3)δ7.52(d，1H)，7.44(m，2H)，7.37(d，1H)，6.67(dd，1H)，6.22(d，1H)，4.80(m，1H)，4.08(q，2H)，3.90(s，2H)，3.54(m，1H)，2.70(m，1H)，2.37(m，2H)，2.24(m，3H)，1.78(m，1H)，1.56(m，2H)，1.44-1.20(m，9H)；MS 454.2(M+1)，452.2(M-1).
步骤B7-{2R-[3S-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯。在-45℃下，向7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-三氟甲基苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(1.5g，3.31mmol)与(R)-2-甲基-CBS-氧氮杂borolidine(1M甲苯溶液，0.5ml，0.5mmol)的CH2Cl2(100ml)溶液中滴加儿茶酚硼烷(1M THF溶液，9.9ml，9.9mmol)。将溶液在-45℃下搅拌24小时，加入1N HCl。将反应混合物在室温下搅拌1小时，分离各层。水溶液用CH2Cl2洗涤(2x)，合并有机层，连续用冰冷的0.5N NaOH和盐水洗涤(两次)。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化(含有50％EtOAc的己烷至含有60％EtOAc的己烷至含有80％EtOAc的己烷至EtOAc至含有5％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2R-[3S-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(1.23g)，HPLC分析鉴定为3S∶3R醇非对映体的大约5.5∶1混合物。
1H NMR(CDCl3)δ7.51-7.35(m，4H)，5.72(dd，1H)，5.50(dd，1H)，4.44(m，1H)，4.09(q，2H)，4.01(m，1H)，3.44(m，1H)，2.90(d，2H)，2.71(m，1H)，2.37-2.12(m，5H)，1.70-1.21(m，13H)；MS 456.3(M+1)，454.3(M-1).
步骤C7-{2S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。遵循实施例1步骤C所述工艺，在10％披钯碳(120mg)的存在下，将7-{2R-[3S-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(1.18g，2.59mmol)的EtOH(50ml)溶液在40-45psi Parr摇动器上氢化24小时。经过中压色谱法纯化(含有50％EtOAc的己烷至EtOAc至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有3％MeOH的CH2Cl2至含有5％MeOH的CH2Cl2至含有10％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(1.08g)。
1H NMR(CDCl3)δ7.51-7.39(m，4H)，4.09(q，2H)，3.86(m，1H)，3.60(m，2H)，2.89(m，2H)，2.76(m，1H)，2.33(m，4H)，2.11(m，1H)，1.80(m，1H)，1.68-1.21(m，16H).
步骤D7-{2S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。遵循实施例1步骤D所述工艺，将7-{2S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(1.93g，4.22mmol)用6N NaOH(26ml)的EtOH(52ml)溶液水解24小时。经过中压色谱法纯化(EtOAc至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有3％MeOH的CH2Cl2至含有5％MeOH的CH2Cl2至含有10％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸(1.66g)。1H NMR(CDCl3)δ7.51-7.39(m，4H)，3.88(m，1H)，3.58(m，2H)，2.84(m，3H)，2.34(m，4H)，2.10(m，1H)，1.80(m，1H)，1.67-1.26(m，13H)；MS430.4(M+1).
步骤E7-{2S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸的钠盐。向7-{2S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸(1.66g，3.87mmol)的EtOH(16ml)溶液中加入NaHCO3(325mg，3.87mmol)的水(3ml)溶液。将反应混合物搅拌5小时，在真空中浓缩。使残余物与CH2Cl2共沸(3x)，得到实施例2的标题化合物的钠盐(1.698g)。
1H NMR(CD3OD)δ7.48(m，4H)，3.80(m，1H)，3.69(m，1H)，3.52(m，1H)，2.94(m，1H)，2.81(m，2H)，2.32(m，2H)，2.13(m，3H)，1.81(m，1H)，1.69-1.26(m，13H)；MS 430.3(M-Na+1)，428.2(M-Na-1).
实施例35S-[4-(3-氯-苯基)-3-羟基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮 步骤A7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循实施例1步骤A所述工艺，使从[3-(3-氯-苯基)-2-氧代-丙基]-膦酸二甲酯(3.35g，12.12mmol)和NaH(60％油悬液，533mg，13.3mmol)衍生的阴离子与7-(2R-甲酰基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚腈(假定13.3mmol)反应18小时。经过中压色谱法纯化(含有20％EtOAc的己烷至含有80％EtOAc的己烷)，得到7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(1.52g)。
1H NMR(CDCl3)δ7.24(m，2H)，7.17(s，1H)，7.06(m，1H)，6.64(dd，1H)，6.20(d，1H)，4.15(m，1H)，3.80(s，2H)，3.50(m，1H)，2.72(m，1H)，2.46-2.20(m，5H)，1.78(m，1H)，1.59(m，2H)，1.40(m，4H)，1.24(m，2H).
步骤B7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循实施例1步骤C所述工艺，在10％披钯碳(86mg)的存在下，将7-{2R-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(860mg，2.31mmol)的MeOH(40ml)溶液氢化1小时。经过径向色谱法纯化(己烷至含有20％EtOAc的己烷至含有70％EtOAc的己烷)，得到7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(730mg)。
步骤C7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。在0℃下，向7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3-氧代-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(730mg，1.87mmol)的MeOH(30ml)溶液中加入NaBH4(35mg，0.921mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌45分钟，加入水。在真空中除去挥发物，其余水溶液用亚甲基氯稀释。将有机溶液用水、再用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有3％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2S-[4-(3-氯苯基)-3-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(730mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.22(m，3H)，7.07(d，1H)，3.80(m，1H)，3.57(m，2H)，2.88(m，1H)，2.78(m，1H)，2.64(m，1H)，2.31(m，4H)，2.10(m，1H)，1.65-1.22(m，14H)；MS 377.3(M+1).
步骤D5S-[4-(3-氯-苯基)-3-羟基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。将7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(730mg，1.94mmol)、三甲基叠氮化硅(0.63ml，0.475mmol)与氧化二丁锡(96mg，3.87mmol)的甲苯(30ml)溶液在回流下加热18小时。在真空中除去挥发物，残余物用CH2Cl2稀释。有机溶液用1N HCl、再用盐水洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。残余物经过中压色谱法纯化，用EtOAc至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有7％MeOH的CH2Cl2洗脱，得到TMS配合物。残余物用MeOH稀释，加入2N HCl，将溶液搅拌40分钟。溶液用CH2Cl2稀释，有机层用水、再用盐水洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。残余物经过中压色谱法纯化，用EtOAc至含有7％MeOH的CH2Cl2洗脱，得到5S-[4-(3-氯-苯基)-3-羟基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮(521mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.23(m，3H)，7.09(d，1H)，3.85(m，1H)，3.66(m，1H)，3.53(m，1H)，2.96(m，3H)，2.81(m，1H)，2.70(m，1H)，2.44(m，2H)，2.18(m，1H)，1.88-1.27(m，14H)；MS 420.2(M+1)，418.3(M-1).
实施例45S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮 步骤A7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循实施例1步骤A所述工艺，使从[2-氧代-3-(3-三氟甲基-苯基)-丙基]-膦酸二甲酯(2.68g，8.64mmol)和NaH(60％油悬液，400mg，10mmol)衍生的阴离子与7-(2R-甲酰基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚腈(假定10mmol)反应18小时。经过中压色谱法纯化(含有30％EtOAc的己烷至含有80％EtOAc的己烷)，得到7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基)-庚腈(1.2g)。1H NMR(CDCl3)δ7.52(m，1H)，7.45(m，2H)，7.37(m，1H)，6.67(dd，1H)，6.23(d，1H)，4.18(m，1H)，3.90(s，2H)，3.53(m，1H)，2.73(m，1H)，2.45-2.23(m，5H)，1.79(m，1H)，1.60(m，2H)，1.41(m，4H)，1.24(m，2H)；MS 407.2(M+1)，405.3(M-1).
步骤B7-{2R-[3S-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。在-45℃下，向7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚腈(1.14g，2.81mmol)与(R)-2-甲基-CBS-氧氮杂borolidine(1M甲苯溶液，0.42ml，0.42mmol)的CH2Cl2(112ml)溶液中滴加儿茶酚硼烷(1M THF溶液，8.4ml，8.4mmol)。将反应混合物在-45℃下搅拌18小时，加入1N HCl。将反应混合物在室温下搅拌40分钟，分离各层。有机溶液用冷1N NaOH洗涤(3次)。将有机溶液先后用1N HCl、水和盐水洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化(1∶1己烷∶EtOAc至含有80％EtOAc的己烷)，得到7-{2R-[3S-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(820mg)，1H NMR鉴定为大约2.5∶1的3S∶3R醇非对映体。1H NMR.1H NMR(CDCl3)δ7.51-7.38(m，4H)，5.72(dd，1H)，5.49(dd，1H)，4.45(m，1H)，4.02(m，1H)，3.47(m，1H)，2.90(m，2H)，2.71(m，1H)，2.34(m，4H)，2.18(m，1H)，1.66(m，4H)，1.44(m，4H)，1.27(m，2H)；MS409.2(M+1).
步骤C7-{2S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循实施例1步骤C所述工艺，在10％披钯碳(100mg)的存在下，将7-{2R-[3S-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(810mg)的MeOH(40ml)溶液在50psi Parr摇动器上氢化18小时。经过中压色谱法纯化(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有3％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(720mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.44(m，4H)，3.84(m，1H)，3.58(m，2H)，2.88(m，2H)，2.73(m，1H)，2.32(m，4H)，2.11(m，1H)，1.78(m，1H)，1.65-1.37(m，11H)，1.30(m，2H)；MS 411.2(M+1).
步骤D5S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。遵循实施例3步骤D所述工艺，使7-{2S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(710mg，1.73mmol)与叠氮基三甲基硅烷(399mg，3.46mmol)和氧化二丁锡(43mg，1.7mmol)在甲苯(25ml)中反应，在回流下加热18小时。在真空中除去挥发物，残余物用CH2Cl2稀释。有机溶液连续用1N HCl(2次)、水(1次)和盐水(1次)洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。残余物经过中压色谱法纯化，用EtOAc至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有8％MeOH的CH2Cl2洗脱，得到5S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮(450mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.44(m，4H)，3.87(m，1H)，3.65(m，1H)，3.50(m，1H)，3.01-2.73(m，5H)，2.42(m，2H)，2.16(m，1H)，1.86-1.23(m，14H)；MS 454.4(M+1)，452.4(M-1).
步骤E5S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮的钠盐。遵循实施例2步骤E所述工艺，将5S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮(428mg，0.944mmol)用NaHCO3(79mg，0.94mmol)处理，得到钠盐(430mg)。1H NMR(CD3OD)δ7.48(m，4H)，3.79(m，1H)，3.67(m，1H)，3.51(m，1H)，2.86(m，5H)，2.30(m，2H)，2.12(m，1H)，1.84-1.27(m，14H)；MS 454.4(M-Na+1)，452.4(M-Na-1).
实施例55-[4-(4-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮 步骤A7-{2-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。将5-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(150mg，0.41mmol)的DMF(5ml)溶液加入到NaH(60重量％油悬液，16mg，0.41mmol)的DMF(10ml)溶液中。1.5小时后，加入7-溴庚腈(78mg，0.41mmol)的DMF(5ml)溶液，将反应混合物在90C下搅拌2.5小时。加入水(20ml)，水溶液用EtOAc洗涤(4×15ml)。合并有机溶液，用水洗涤(2×15ml)，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。残余物经过中压色谱法纯化(1∶1己烷∶EtOAc)，得到7-{2-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(161mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.09(m，2H)，6.95(m，2H)，3.81(m，1H)，3.54(m，2H)，2.86(m，1H)，2.68(m，2H)，2.29(m，4H)，2.06(m，1H)，1.74-1.23(m，13H)，0.85(s，9H)，0.04(m，3H)，0.19(m，3H)；MS475.1(M+1).
步骤B7-{2-[4-(4-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。在0℃下，向7-{2-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(158mg，0.333mmol)的THF(20ml)溶液中加入TBAF(1M THF溶液，0.50ml，0.50mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时，加入饱和NaHCO3水溶液。在真空中除去挥发物。其余水溶液用CHCl3洗涤(4×5ml)，合并有机溶液，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。残余物经过中压色谱法纯化(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc)，得到7-{2-[4-(4-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(82mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.15(m，2H)，7.00(m，2H)，3.77(m，1H)，3.58(m，2H)，2.89(m，1H)，2.79(m，1H)，2.64(m，1H)，2.34(m，4H)，2.12(m，1H)，1.68-1.24(m，14H)；MS 361.2(M+1).
步骤C5-[4-(4-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。遵循实施例3步骤D所述工艺，使7-{2-[4-(4-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(71mg，0.197mmol)与叠氮基三甲基硅烷(45mg，0.394mmol)和氧化二丁锡(5mg，0.02mmol)在甲苯(10ml)中反应，在回流下加热16小时。加入另外的叠氮基三甲基硅烷(200mg)和氧化二丁锡(50mg)，将反应混合物在回流下加热5小时。反应混合物用1N HCl(5ml)酸化至pH＝2，水溶液用EtOAc洗涤(4×10ml)。合并有机溶液，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化(EtOAc至39∶1 EtOAc∶MeOH至19∶1 EtOAc∶MeOH)，得到实施例5A的标题化合物(39mg)。
1H NMR(CDCl3)δ7.16(m，2H)，7.00(m，2H)，3.81(m，1H)，3.68(m，1H)，3.53(m，1H)，2.99(m，3H)，2.80(m，1H)，2.68(m，1H)，2.47(m，2H)，2.20(m，1H)，1.88-1.22(m，14H)；MS 404.3(M+1)；402.3(M-1).
实施例65-(4-联苯-3-基-3-羟基-丁基)-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮 步骤A7-{2-(4-联苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循实施例5步骤A所述工艺，在70℃下，将从5-[4-联苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(239.1mg，0.564mmol)和NaHMDS(1M THF溶液，0.67ml，0.67mmol)衍生的阴离子用7-溴庚腈(118mg，0.620mmol)烷基化24小时。经过中压色谱法纯化(CH2Cl2至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有4％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2-[4-联苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(187mg)。MS 533.3(M+1)。
步骤B7-[2-(4-联苯-3-基-3-羟基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚腈。遵循实施例5步骤B所述工艺，将7-{2-[4-联苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(187mg，0.351mmol)用TBAF(1M THF溶液，0.53ml，0.53mmol)去保护。加入是在0℃下进行的，将反应混合物在室温下搅拌24小时。经过中压色谱法纯化(CH2Cl2至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有6％MeOH的CH2Cl2至含有10％MeOH的CH2Cl2)，得到7-[2-(4-联苯-3-基-3-羟基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚腈(85mg)。
1H NMR(CDCl3)δ7.58(m，1H)，7.51-7.33(m，4H)，7.21-7.12(m，4H)，3.85(m，1H)，3.60(m，2H)，2.90(m，1H)，2.83-2.60(m，2H)，2.45-2.30(m，4H)，2.14(m，1H)，1.73-1.25(m，14H).
步骤C5-(4-联苯-3-基-3-羟基-丁基)-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。遵循实施例3步骤D所述工艺，使7-[2-(4-联苯-3-基-3-羟基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚腈(109mg，0.260mmol)与叠氮基三甲基硅烷(0.69ml，0.52mmol)和氧化二丁锡(11mg，0.044mmol)在甲苯(5.3ml)中反应，在回流下加热72小时。将反应混合物冷却，加入水。混合物用1N HCl酸化至pH＝2，水溶液用含有5％MeOH的CH2Cl2洗涤(3次)。合并有机溶液，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有4％MeOH的CH2Cl2至含有8％MeOH的CH2Cl2)，得到实施例6的标题化合物(107mg)。
1H NMR(CDCl3)δ7.57(m，1H)，7.51-7.32(m，4H)，7.25-7.13(m，4H)，3.91(m，1H)，3.74-3.50(m，2H)，2.96(m，3H)，2.77(m，1H)，2.50(m，2H)，2.22(m，1H)，2.07(m，1H)，1.90-1.22(m，14H)；MS 462.2(M+1)，460.1(M-1).
实施例75-[4-(3-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮
步骤A7-{2-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循实施例5步骤A所述工艺，在70℃下，将从5-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(250mg，0.684mmol)和NaHMDS(1M THF溶液，0.80ml，0.80mmol)衍生的阴离子用7-溴庚腈(142mg，0.748mmol)烷基化72小时。经过中压色谱法纯化(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有5％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚腈(261.7mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.26(m，1H)，6.92(m，3H)，3.89(m，1H)，3.59(m，2H)，2.89(m，1H)，2.75(m，2H)，2.36(m，4H)，2.11(m，1H)， 1.72-1.26(m，13H)，0.89(s，9H)，0.09(s，6H)；MS 475.3(M+1).
步骤B7-{2-[4-(3-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循实施例5步骤B所述工艺，将7-{2-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(261.7mg，0.551mmol)用TBAF(1M THF溶液，0.83ml，0.83mmol)去保护。加入是在0℃下进行的，将反应混合物在室温下搅拌24小时。经过中压色谱法纯化(CH2Cl2至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有4％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2-[4-(3-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(141mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.32(m，1H)，6.98(m，3H)，3.86(m，1H)，3.64(m，2H)，2.99-2.80(m，2H)，2.71(m，1H)，2.38(m，4H)，2.16(m，1H)，1.74-1.29(m，14H)；MS 361.3(M+1).
步骤C5-[4-(3-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。遵循实施例6步骤C所述工艺，使7-{2-[4-(3-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(141.3mg，0.392mmol)与叠氮基三甲基硅烷(0.210ml，1.57mmol)和氧化二丁锡(29mg，0.116mmol)在甲苯(8ml)中反应，在回流下加热72小时。经过中压色谱法纯化(CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有4％MeOH的CH2Cl2至含有6％MeOH的CH2Cl2)，得到实施例5C的标题化合物(101.5mg)。
1H NMR(CDCl3)δ7.26(m，1H)，6.94(m，3H)，3.87(m，1H)，3.70(m，1H)，3.52(m，1H)，2.98(m，3H)，2.78(m，2H)，2.48(m，2H)，2.20(m，1H)，1.89-1.24(m，14H)；MS 404.2(M+1)，401.9(M-1).
实施例85S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮 步骤A7-{2R-[3S-羟基-4-(3-氯-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。在-45℃下，向7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-氯-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚腈(1.62g，4.34mmol)的二氯甲烷(200ml)溶液中加入(R)-2-甲基-CBS-氧氮杂borolidine(1M甲苯溶液，1.3ml，1.3mmol)。搅拌20分钟后，滴加儿茶酚硼烷(1M THF溶液，13ml，13mmol)。将反应系在-45℃下搅拌16小时，加入1N HCl。使混合物温热至室温，分离各层。有机溶液用冷的1N NaOH洗涤(3次)。将有机溶液连续用1N HCl、水和盐水洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化(1∶1己烷∶FtOAc至含有20％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2R-[3S-羟基-4-(3-氯-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(536mg)，HPLC鉴定为3S∶3R醇的8.2∶1混合物。1H NMR(CDCl3)δ7.24-7.17(m，3H)，7.07(m，1H)，5.69(dd，1H)，5.46(dd，1H)，4.40(m，1H)，4.01(m，1H)，3.46(m，1H)，2.81(m，2H)，2.68(m，1H)，2.42-2.28(m，4H)，2.20(m，1H)，1.73-1.59(m，4H)，1.42(m，4H)，1.25(m，2H)；MS 375(M+1).
步骤B7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈。遵循实施例4步骤C所述工艺，在10％披钯碳(60mg)的存在下，使7-{2R-[3S-羟基-4-(3-氯-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(536mg)在EtOH(30ml)中氢化3.5小时。经过中压色谱法纯化(1∶1己烷∶EtOAc至含有20％MeOH的CH2Cl2)，得到7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(440mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.22(m，3H)，7.08(m，1H)，3.83(m，1H)，3.59(m，2H)，2.90(m，1H)，2.77(dd，1H)，2.66(dd，1H)，2.39-2.29(m，4H)，2.11(m，1H)，1.78(m，1H)，1.68-1.39(m，11H)，1.29(m，2H)；MS 377.2(M+1).
步骤CS-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。遵循实施例3步骤D所述工艺，将7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚腈(420mg，1.114mmol)、三甲基叠氮化硅(257mg，2.23mmol)与氧化二丁锡(56mg)在甲苯(30ml)中的混合物在回流下加热16小时。在真空中除去挥发物，将残余物溶于MeOH，与3N HCl搅拌3小时。反应系用水和CH2Cl2稀释，分离各层。有机层用水、再用盐水洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化(EtOAc至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有7％MeOH的CH2Cl2)，得到5S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-1-[6-(2H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮(311mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.22(m，3H)，7.08(m，1H)，3.86(m，1H)，3.66(m，1H)，3.52(m，1H)，2.96(m，3H)，2.82-2.68(m，2H)，2.45(m，2H)，2.17(m，1H)，1.88-1.22(m，14H)；MS 420.2(M+1)，418.3(M-1).
实施例97-{2R-[3-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸 步骤A7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。遵循实施例1步骤A所述工艺，将从[2-氧代-3-(3-苯氧基-苯基)-丙基]-膦酸二甲酯(633mg，1.98mmol)和NaH(60％油悬液，70mg，1.74mmol)衍生的阴离子与7-(2R-甲酰基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯(假定1.58mmol)反应24小时。中压色谱法(EtOAc)得到7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(215mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.28(m，3H)，7.08(m，1H)，6.97(m，2H)，6.89(m，2H)，6.83(m，1H)，6.62(dd，1H)，6.19(d，1H)，4.13(m，1H)，4.08(q，2H)，3.79(s，2H)，3.51(m，1H)，2.68(m，1H)，2.35(m，2H)，2.24(m，3H)，2.24(m，3H)，1.75(m，1H)，1.54(m，2H)，1.43-1.20(m，9H).
步骤B7-{2R-[3-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。遵循实施例3步骤C所述工艺，在0℃下，使7-{2-氧代-5R-[3-氧代-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(215mg，0.451mmol)与NaBH4(17mg，0.45mmol)在EtOH(3ml)中反应4小时。经过中压色谱法纯化(EtOAc)，得到7-{2R-[3-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(167mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.33(m，2H)，7.25(m，1H)，7.10(m，1H)，6.99(m，2H)，6.93(m，1H)，6.86(m，2H)，5.72(m，1H)，5.45(m，1H)，4.37(m，1H)，4.10(q，2H)，3.47(m，1H)，2.82(m，3H)，2.35(m，2H)，2.26(t，2H)，2.15(m，1H)，1.70-1.21(m，13H).
步骤C7-{2R-[3-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。遵循实施例1步骤D所述工艺，在室温下，将7-{2R-[3-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(29mg，0.060mmol)用2M NaOH的EtOH溶液(4.0ml)水解24小时，得到标题化合物(20mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.33-7.21(m，3H)，7.08(m，1H)，6.98-6.84(m，5H)，5.70(m，1H)，5.44(m，1H)，4.36(m，1H)，4.00(m，1H)，3.44(m，1H)，2.85-2.51(m，3H)，2.32(m，4H)，2.14(m，1H)，1.68-1.18(m，10H).
实施例107-{2S-[3-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸 步骤A7-{2S-[3-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯。遵循实施例1步骤C所述工艺，将7-{2R-[3-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁-1-烯基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(139mg，0.290mmol)、MeOH(30ml)与10％披钯碳(14mg)的混合物在50psi Parr摇动器上氢化18小时。经过中压色谱法纯化(1∶1己烷∶EtOAc)，得到7-{2S-[3-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(86mg)。1HNMR(CDCl3)δ7.35-7.24(m，3H)，7.10(m，1H)，6.99(m，2H)，6.93(m，1H)，6.87(m，2H)，4.09(q，2H)，3.80(m，1H)，3.58(m，2H)，2.82(m，2H)，2.64(m，1H)，2.42-2.24(m，4H)，2.10(m，1H)，1.77(m，1H)，1.66-1.21(m，16H).
步骤B7-{2S-[3-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。遵循实施例1步骤D所述工艺，将7-{2S-[3-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸乙酯(86mg，1.79mmol)用2N NaOH的MeOH溶液(4ml)水解18小时，得到标题化合物(62mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.33-7.23(m，3H)，7.09(m，1H)，6.98(m，2H)，6.91(m，1H)，6.86(m，2H)，3.80(m，1H)，3.56(m，2H)，2.88(m，1H)，2.77(m，1H)，2.64(m，1H)，2.38-2.28(m，4H)，2.09(m，1H)，1.77(m，1H)，1.64-1.21(m，13H).
制备例17-(2R-羟甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚腈步骤A7-[2R-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基甲基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚腈。向NaH(60％油悬液，3.836 g，0.0959mmol，用25ml DMF洗涤)在DMF(250ml)中的混合物中加入5R-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基甲基)-吡咯烷-2-酮(TetrahdedronAsymmetry(四面体不对称)，1996，7，2113)(20.00g，87.19mmol)的DMF溶液(50ml)。将反应系在室温下搅拌1.5小时，加入2-溴庚腈(16.574g，87.19mmol)的DMF(50ml)溶液。将反应系在90C下搅拌3小时。将反应系冷却至室温，加入水(750ml)。水溶液用EtOAc洗涤(4×250ml)。合并有机溶液，用水洗涤(2×250ml)，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化，用溶剂梯度(9∶1己烷∶EtOAc至7∶3己烷∶EtOAc至1∶1己烷∶EtOAc)洗脱，得到7-[2R-(叔丁基-二甲基硅烷氧基甲基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚腈(22.46g)。1H NMR(CDCl3)δ3.69-3.55(m，4H)，2.99(m，1H)，2.42(m，1H)，2.34-2.24(m，3H)，2.05(m，1H)，1.81(m，1H)，1.67-1.42(m，6H)，1.31(m，2H)，0.86(s，9H)，0.03(s，6H)；MS 339.3(M+1).
步骤B7-(2R-羟甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚腈。在0℃下，将氟化四丁铵(1M THF溶液，100.0ml，100.0mmol)缓慢加入到7-[2R-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基甲基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚腈(22.39g，66.13mmol)的THF(400ml)溶液中。使反应系温热至室温，搅拌4小时。加入饱和NaHCO3水溶液(250ml)，在真空中除去挥发物。其余水溶液用CHCl3洗涤(4×200ml)。合并有机溶液，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化，用溶剂梯度(9∶1己烷∶EtOAc至4∶1己烷∶EtOAc至7∶3己烷∶EtOAc至6∶4己烷∶EtOAc至1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至9∶1EtOAc∶MeOH)洗脱，得到7-(2R-羟甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚腈(14.922g)。1H NMR(CDCl3)δ3.78(dd，1H)，3.71-3.58(m，3H)，3.00(m，1H)，2.46(m，1H)，2.36-2.27(m，3H)，2.08(m，1H)，1.93(m，1H)，1.77(m，1H)，1.68-1.43(m，6H)，1.32(m，2H)；MS 225.1(M+1).
制备例27-(2R-羟甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯步骤A7-[2R-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基甲基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯。遵循制备例1步骤A所述工艺，在90℃下，使从5R-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基甲基)-吡咯烷-2-酮(30.000g，130.8mmol)和NaH(60％油悬液，5.756g，143.9mmol)衍生的阴离子在DMF(600ml)中与7-溴庚酸乙酯(32.559g，137.3mmol)反应3小时。经过中压色谱法纯化，用溶剂梯度(9∶1己烷∶EtOAc至4∶1己烷∶EtOAc至7∶3己烷∶EtOAc至6∶4己烷∶EtOAc)洗脱，得到7-[2R-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基甲基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯(39.46g)。1HNMR(CDCl3)δ4.10(q，2H)，3.62(m，4H)，2.95(m，1H)，2.42(m，1H)，2.27(m，3H)，2.04(m，1H)，1.81(m，1H)，1.65-1.26(m，8H)，1.23(t，3H)，0.86(s，9H)，0.03(s，6H)；MS 386.2(M+1).
步骤B7-(2R-羟甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯。遵循制备例1步骤B所述工艺，将7-[2R-(叔丁基-二甲基硅烷氧基甲基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸乙酯(39.46g，102.3mmol)用TBAF(1M THF溶液，154.0ml，154.0mmol)去保护，反应时间为2.5小时。经过中压色谱法纯化，用溶剂梯度(9∶1己烷∶EtOAc至6∶4己烷∶EtOAc至1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至19∶1 EtOAc∶MeOH)洗脱，得到7-(2R-羟甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯(25.41g)。
1H NMR(CDCl3)δ4.10(q，2H)，3.77(dd，1H)，3.64(m，3H)，2.96(m，1H)，2.46(m，1H)，2.35-2.25(m，3H)，2.08(m，1H)，1.93(m，1H)，1.71(m，1H)，1.63-1.27(m，8H)，1.23(t，3H)；MS 272.2(M+1).
制备例3[2-氧代-3-(3-三氟甲基-苯基)-丙基]-膦酸二甲酯步骤AN-甲氧基-N-甲基-2-(3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺。在0℃下，向盐酸N，O-二甲基羟胺(1.577g，16.2mmol)的DMF(25ml)与CH2Cl2(25ml)溶液中加入三乙胺(2.25ml)。搅拌5分钟后，加入3-三氟甲基苯乙酸(3.0g，14.7mmol)、HOBT(3.177g，23.5mmol)和DEC(盐酸2-二乙氨基乙基氯，3.10g，16.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时，在真空中浓缩。残余物用EtOAc稀释，将有机溶液连续用1N NaOH(2次)、水和盐水洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤，在真空中浓缩。中压色谱法(含有20％EtOAc的己烷至含有50％EtOAc的己烷)得到N-甲氧基-N-甲基-2-(3-三氟甲基-苯基)-乙酰胺。
步骤B[2-氧代-3-(3-三氟甲基-苯基)-丙基]-膦酸二甲酯。在-78℃下，向甲基膦酸二甲酯(9.4g，75.8mmol)的甲苯(80ml)溶液中缓慢加入正丁基锂(2.5M己烷溶液，28ml，70mmol)。将反应混合物搅拌1小时，缓慢加入N-甲氧基-N-甲基-2-(3-三氟甲基苯基)-乙酰胺(14.39g)的甲苯(50ml)溶液。将反应混合物搅拌2.5小时，加入AcOH(40ml)。使反应混合物温热至室温，加入水。有机层用水、再用盐水洗涤。将有机溶液干燥(MgSO4)，过滤，在真空中浓缩。中压色谱法(CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2)得到制备例3的标题化合物(9.37g)。1H NMR(CDCl3)δ7.52(m，1H)，7.44(m，2H)，7.37(m，1H)，3.96(s，2H)，3.87(s，3H)，3.76(s，3H)，3.12(d，2H).
制备例4[3-(3-氯-苯基)-2-氧代-丙基]-膦酸二甲酯遵循类似于制备例3所述工艺，取代适当的原料，制得制备例4的标题化合物。
制备例5[3-(3-氯-苯基)-2-氧代-丙基]-膦酸二甲酯在-78℃下，向甲基膦酸二甲酯(17.93g，144mmol)的THF(270ml)溶液中缓慢加入正丁基锂(2.5M，64.2ml，160.6mmol)。将反应混合物搅拌1小时，缓慢加入(3-氯-苯基)-乙酸甲酯(26.93g，146mmol)。使反应混合物温热至室温，搅拌24小时。加入AcOH(15ml)，在真空中除去挥发物。残余物用CH2Cl2稀释，将有机溶液小心地用饱和NaHCO3水溶液洗涤(3次)。将有机层干燥(MgSO4)，过滤，在真空中浓缩。经过中压色谱法纯化(含有20％EtOAc的己烷至EtOAc)，得到标题化合物(9.28g)。
制备例6四氢-吡咯烷(pyrrolizine)-3，5-二酮遵循美国专利No.4,663,464所述工艺制得制备例6的标题化合物。
制备例77-(2R-甲酰基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯向7-(2R-羟甲基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯(1.63g，6.0lmmol)的苯(50ml)溶液中加入盐酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(3.46g，18.03mmol)和DMSO(1.5ml，24.04mmol)。将溶液冷却至0℃，加入吡啶鎓三氟乙酸盐(1.28g，6.61mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌15分钟，然后在室温下搅拌2小时。从油性残余物中滗析溶液。残余物用苯洗涤(3x)，合并苯洗涤液，在真空中浓缩，得到7-(2R-甲酰基-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸乙酯，无需进-步纯化即可使用。
制备例84-(3-{2-(4-联苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-丙基)-苯甲酸甲酯步骤A5-(3-溴-3-氧代-丁基)-吡咯烷-2-酮。在0℃下，向四氢吡咯烷-3，5-二酮(5g，36mmol)的CH2Cl2(320ml)溶液中滴加3-溴苄基溴化镁(0.25M Et2O溶液，155ml，38.8mmol)。将溶液在0℃下搅拌2小时，用饱和氯化铵水溶液猝灭。加入1N HCl水溶液至达到pH＝3。温热至室温后，水溶液用CH2Cl2萃取(3x)。合并有机萃取液，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化，用溶剂梯度(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有5％MeOH的CH2Cl2)洗脱，得到5-(3-溴-3-氧代-丁基)-吡咯烷-2-酮(7.84g)。1H NMR(CDCl3)δ7.41-7.11(m，4H)，6.24(bs，1H)，3.67(s，2H)，3.60(m，1H)，2.52(t，2H)，2.32(m，2H)，2.20(m，1H)，1.88-1.60(m，3H).
步骤B5-(3-溴-3-羟基-丁基)-吡咯烷-2-酮。在0℃下，向5-(3-溴-3-氧代-丁基)-吡咯烷-2-酮(7.84g，25.3mmol)的EtOH(130ml)溶液中加入NaBH4(480mg，12.6mmol)，将反应系在0℃下搅拌2.5小时。用饱和氯化铵水溶液猝灭反应。加入水和CH2Cl2。含水层用CH2Cl2洗涤(3x)，合并有机萃取液，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化，用溶剂梯度(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有3％MeOH的CH2Cl2至含有5％MeOH的CH2Cl2至含有8％MeOH的CH2Cl2)洗脱，得到5-(3-溴-3-羟基-丁基)-吡咯烷-2-酮(6.76g)。
1H NMR(CDCl3)δ7.36-7.09(m，4H)，6.27(d，1H)，3.78(m，1H)，3.63(m，1H)，2.75(m，1H)，2.62(m，1H)，2.32-2.18(m，3H)，1.88(m，1H)，1.73-1.42(m，5H)；MS 312.2，314.1(M+).
步骤C5-[3-溴-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-吡咯烷-2-酮。向5-(3-溴-3-羟基-丁基)-吡咯烷-2-酮(6.76g，21.6mmol)的DMF(86ml)溶液中加入叔丁基二甲代甲硅烷基氯(3.59g，23.8mmol)，再加入咪唑(2.95g，43.3mmol)和DMAP(264mg，2.16mmol)。将反应系搅拌24小时，用饱和氯化铵水溶液猝灭。水溶液用EtOAc洗涤(3x)，合并有机萃取液，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化，用溶剂梯度(CH2Cl2至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有3％MeOH的CH2Cl2至含有5％MeOH的CH2Cl2至含有8％MeOH的CH2Cl2)洗脱，得到5-[3-溴-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(7.45g)。1H NMR(CDCl3)δ7.30(m，2H)，7.12(m，1H)，7.04(m，1H)，5.71(m，1H)，3.81(m，1H)，3.56(m，1H)，2.66(m，2H)，2.32-2.17(m，3H)，1.70-1.35(m，5H)，0.82(s，9H)，-0.06(d，3H)，-0.24(d，3H)；MS 426.2，428.2(M+).
步骤D5-[4-联苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-吡咯烷-2-酮。向5-[3-溴-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(750mg，1.76mmol)的DME(15ml)溶液中加入苯基代硼酸(236mg，1.93mmol)。加入乙酸钯(26.8mg，0.088mmol)和三邻甲苯基膦(39.5mg，0.176mmol)，再加入Na2CO3(37.3mg，3.52mmol)的水(1.8ml)溶液。将反应系在回流下加热24小时。将反应系冷却，在真空中除去挥发物。残余物用盐水和EtOAc稀释。水溶液用EtOAc洗涤(3x)，合并有机萃取液，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩。经过中压色谱法纯化，用溶剂梯度(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有3％MeOH的CH2Cl2至含有5％MeOH的CH2Cl2)洗脱，得到5-[4-联苯-3-基-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(717.3mg)。1H NMR(CDCl3)δ7.57(m，2H)，7.43(m，2H)，7.33(m，3H)，7.11(m，2H)，5.78(m，1H)，3.91(m，1H)，3.59(m，1H)，2.76(m，2H)，2.27(m，3H)，1.73-1.38(m，5H)，0.83(s，9H)，-0.03(d，3H)，-0.16(d，3H)；MS 424.3(M+1).
制备例95-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮步骤A5-[4-(3-氟-苯基)-3-氧代-丁基]-吡咯烷-2-酮。遵循制备例8步骤A所述工艺，使四氢-吡咯烷-3，5-二酮(2g，14mmol)与3-氟苄基氯化镁(0.25M Et2O溶液，62ml，15.5mmol)反应2.5小时。经过中压色谱法纯化，用溶剂梯度(1∶1己烷∶EtOAc至2∶1 EtOAc∶己烷至EtOAc至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有10％MeOH的CH2Cl2)洗脱，得到5-[4-(3-氟-苯基)-3-氧代-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.1730g)。
1H NMR(CDCl3)δ7.32-7.27(m，1H)，7.00-6.90(m，3H)，6.12(bs，1H)，3.69(s，2H)，3.59(m，1H)，2.52(t，2H)，2.30(m，2H)，2.19(m，1H)，1.75(m，2H)，1.65(m，1H).
步骤B5-[4-(3-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-吡咯烷-2-酮。遵循制备例8步骤B所述工艺，将5-[4-(3-氟-苯基)-3-氧代-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.17g，8.71mmol)用NaBH4(165mg，4.35mmol)还原。经过中压色谱法纯化，用溶剂梯度(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有3％MeOH的CH2Cl2至含有6％MeOH的CH2Cl2)洗脱，得到5-[4-(3-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.23g)。
1H NMR(CDCl3)δ7.27(m，1H)，6.94(m，3H)，6.38(m，1H)，3.82(m，1H)，3.66(m，1H)，2.79(m，1H)，2.67(m，1H)，2.33-2.21(m，3H)，1.92(d，J＝4.15Hz，1H)，1.75-1.40(m，5H)；MS 252.2(M+1).
步骤C5-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮。遵循制备例8步骤C所述工艺，使5-[4-(3-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.23g，8.87mmol)与叔丁基二甲代甲硅烷基氯(1.47g，9.76mmol)反应。经过中压色谱法纯化，用溶剂梯度(1∶1己烷∶EtOAc至EtOAc至含有1％MeOH的CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有4％MeOH的CH2Cl2)洗脱，得到5-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(3-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.84g)。1H NMR(CDCl3)δ7.23(m，1H)，6.88(m，3H)，5.75(m，1H)，3.85(m，1H)，3.57(m，1H)，2.71(m，2H)，2.30(m，2H)，2.25(m，1H)，1.70-1.38(m，5H)，0.84(s，9H)，0(s，3H)，-0.2(s，3H).
制备例105-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]]-吡咯烷-2-酮步骤A5-[4-(4-氟-苯基)-3-氧代-丁基]-吡咯烷-2-酮。遵循制备例8步骤A所述工艺，使四氢-吡咯烷-3，5-二酮(1.41g，10.1mmol)与4-氟苄基氯化镁(0.25M Et2O溶液，50ml，12.5mmol)反应5小时。经过中压色谱法纯化(含有2％MeOH的CH2Cl2)，得到5-[4-(4-氟-苯基)-3-氧代-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.64g)。1H NMR(CDCl3)δ7.18(m，2H)，7.03(m，2H)，6.34(m，1H)，3.70(s，2H)，3.62(m，1H)，2.54(t，2H)，2.34-2.15(m，3H)，1.82-1.61(m，3H).
步骤B5-[4-(4-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-吡咯烷-2-酮。遵循制备例8步骤B所述工艺，在室温下，将5-[4-(4-氟-苯基)-3-氧代-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.64g，mmol)用NaBH4(400mg，mmol)还原14时。加入另外的NaBH4(150mg)，将反应系搅拌20小时。经过中压色谱法纯化，用溶剂梯度(CH2Cl2至含有2％MeOH的CH2Cl2至含有4％MeOH的CH2Cl2)洗脱，得到5-[4-(4-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-吡咯烷-2-酮(2.01g)。1H NMR(CDCl3)δ7.14(m，2H)，6.98(m，2H)，6.78(m，1H)，3.76(m，1H)，3.65(m，1H)，2.76(m，1H)，2.64(m，1H)，2.32-2.18(m，4H)，1.72-1.47(m，5H).
步骤C5-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮。遵循制备例8步骤C所述工艺，使5-[4-(4-氟-苯基)-3-羟基-丁基]-吡咯烷-2-酮(1.95g，7.79mmol)与叔丁基二甲代甲硅烷基氯(1.47g，9.76mmol)反应。经过中压色谱法纯化(含有1％MeOH的CH2Cl2)，得到5-[3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-4-(4-氟-苯基)-丁基]-吡咯烷-2-酮。1H NMR(CDCl3)δ7.12(m，2H)，6.97(m，2H)，5.75(m，1H)，3.83(m，1H)，3.60(m，1H)，2.71(m，2H)，2.36-2.24(m，3H)，1.70-1.38(m，5H)，0.84(s，9H)，-0.05(d，3H)，-0.2(d，3H).
制备例11[2-氧代-3-(3-苯氧基-苯基)-丙基]-膦酸二甲酯按照类似于制备例5化合物所述的方式，取代适当的原料，制得制备例11的标题化合物。
权利要求
1.治疗哺乳动物呈现低骨质量的疾病的方法，包含对所述哺乳动物给以EP4受体选择性激动剂、其前体药物或所述EP4受体选择性激动剂或所述前体药物的药学上可接受的盐。
2.权利要求1的方法，其中所述疾病是骨质疏松、虚弱、骨质疏松性骨折、骨缺陷、儿童自发性骨损失、牙槽骨损失、下颌骨损失、骨折、骨切开术、与牙周炎有关的骨损失或假体向内生长。
3.权利要求2的方法，其中所述组合物是全身给药的。
4.权利要求2的方法，其中所述组合物是局部给药的。
5.权利要求2的方法，其中所述疾病是虚弱。
6.权利要求2的方法，其中所述疾病是骨质疏松。
7.权利要求2的方法，其中所述疾病是骨折或骨质疏松性骨折。
8.权利要求1的方法，其中所述EP4选择性激动剂是式I化合物 其前体药物或所述化合物或所述前体药物的药学上可接受的盐，其中Q是COOR3、CONHR4或四唑-5-基；A是单键或顺式双键；B是单键或反式双键；U是 或 R2是α-噻吩基、苯基、苯氧基、单取代的苯基和单取代的苯氧基，所述取代基是氯、氟、苯基、甲氧基、三氟甲基或(C1-C3)烷基；R3是氢、(C1-C5)烷基、苯基或对-联苯基；R4是COR5或SO2R5；R5是苯基或(C1-C5)烷基。
9.权利要求8的方法，其中所述EP4受体选择性激动剂是其中Q是5-四唑基、U是 的式I化合物。
10.权利要求9的方法，其中所述化合物是5R-(3S-羟基-4-苯基-丁-1-烯基)-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。
11.权利要求9的方法，其中所述化合物是5S-(3R-羟基-4-苯基-丁基)-1-[6-(1H-四唑-5-基)-己基]-吡咯烷-2-酮。
12.权利要求9的方法，其中所述化合物是5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基)-]-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮。
13.权利要求9的方法，其中所述化合物是5S-(3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-]-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮。
14.权利要求8的方法，其中所述EP4受体选择性激动剂是其中Q是COOH、U是 的式I化合物。
15.权利要求14的方法，其中所述化合物是7-(2S-(3R-羟基-4-苯基-丁基)-5-氧代-吡咯烷-]-基)-庚酸。
16.权利要求14的方法，其中所述化合物是7-[2R-(3S-羟基-4-苯基-丁-1-烯基)-5-氧代-吡咯烷-1-基]-庚酸。
17.权利要求14的方法，其中所述化合物是7-{2S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
18.权利要求14的方法，其中所述化合物是7-{2S-[3R-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
19.权利要求14的方法，其中所述化合物是7-{2S-[3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
20.权利要求14的方法，其中所述化合物是7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
21.权利要求8的方法，其中所述化合物选自7-{2S-[3R-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；7-(2S-(3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸；7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮；和5S-(3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮。
22.化合物，选自7-{2S-[3R-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；7-(2S-(3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸；7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸；5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮；和5S-(3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮。
23.权利要求22的化合物，它是7-{2S-[3R-羟基-4-(3-苯氧基-苯基)-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
24.权利要求22的化合物，它是5S-(4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基-吡咯烷-2-酮。
25.权利要求22的化合物，它是7-(2S-(3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-5-氧代-吡咯烷-1-基)-庚酸。
26.权利要求22的化合物，它是7-{2S-[4-(3-氯-苯基)-3R-羟基-丁基]-5-氧代-吡咯烷-1-基}-庚酸。
27.权利要求22的化合物，它是5S-(3R-羟基-4-(3-三氟甲基-苯基)-丁基)-1-(6-(2H-四唑-5-基)-己基)-吡咯烷-2-酮。
全文摘要
本发明涉及治疗呈现低骨质量的疾病的方法，特别是骨质疏松、虚弱、骨质疏松性骨折、骨缺陷、儿童自发性骨损失、牙槽骨损失、下颌骨损失、骨折、骨切开术、与牙周炎有关的骨损失或假体向内生长，包含将前列腺素激动剂给药，它们是EP
文档编号C07D403/06GK1413190SQ00817566
公开日2003年4月23日 申请日期2000年11月20日 优先权日1999年12月22日
发明者K·O·卡梅伦, 柯华珠, B·A·莱福科, D·D·汤普森 申请人:辉瑞产品公司