作为检测早期免疫激活的标记物的tirc7的制作方法

专利名称：：作为检测早期免疫激活的标记物的tirc7的制作方法作为检测早期免疫激活的标记物的TIRC7本发明涉及通过检测T细胞免疫应答cDNA7(TIRC7)来诊断早期免疫激活的方法。特别地，本发明提供了作为用于在非侵袭性诊断方法中检测移植排斥的早期生物标记物的TIRC7，所述诊断方法通过用于在移植后进行监测的简单诊断方法取代活组织检查干预(biopsyintervention)。此外，本发明涉及用于此类i貪断方法的试剂盒。T细胞激活是涉及多个信号转导途径和基因表达的连续性改变从而导致T细胞分化成不同的亚群(即Thl和Th2)的系列过程，所述亚群可通过它们的细胞因子产生模式来区分并且表征所述细胞免疫应答的模式。T细胞应答由抗原特异性T细胞受体(TCR)与抗原递呈细胞用引发。由通过许多统称为共刺激信号(Perez，Immunity6(1997)，411-417)的膜蛋白例如CD28/CTLA4和B7、CD40/CD40L、LFA-1和ICAM-1(Lenschow，Science257(1992)，789-792;Linsley，A腿.Rev.Immunol.11(1993)，191-212;Xu，Immunity1(1994)，423-431;Bachraann，Immunity7(1997)，549-557;Schwartz,Cell71(1992)，1065-1068)介导^受体-配体相互作用的网络提供另外的信号。这些膜蛋白可以以不同的方式改变T细月包的激活(Bachmann，Immunity7(1997)，549-557)和通过整合由这些分子提供的正信号和负信号来调节免疫应答(Bluestone，Immunity2(1995)，555-559;Perez,Immunity6(1997)，411-417)。在调节细胞免疫应答中有效的许多试剂可干扰T细胞受体(Cosimi，Transplantation32(1981)，535-539)阻断共刺激信号转导(Larsen，Nature381(1996)，434-438;BlazarJ.Immuno.157(1996)，3250-3259;Kirk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(1997)，8789-8794;Linsley，Science257(1992)，792-95;Turka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)，11102-11105)或抑制这些原始细胞膜触发器下游的细胞内活化信号(Schreiber和Crabtree,ImmunologyToday13(1992)，136-42)。器官移植和自身免疫性疾病中T细胞激活的治疗性预防目前依赖于干扰下游细胞内事件的泛免疫抑制(pan-immu廳upressive)药物。免疫应答的特异性调节和检测(例如移植治疗中的)仍然是在免疫学研究中的长期目标。例如，急性排斥(aRx)对肾同种异体移植物的长期结果具有重大影响，并且其诊断依赖于同种异体移植物活组织检查的侵袭性方法。新的免疫抑制方案已减少了发生率但还未消除该问题。此外，现在在门诊患者中，在移植后数周更频繁地看到aRx。用于预测aRx的的非侵袭性诊断检测可改善管理(management)和结果。因此，存在对早期生物标记物和非侵袭性诊断方法的需要，所述生物标记和非侵袭性诊断方法用于检测免疫应答的激活，特别是对于其中免疫应答的激活涉及疾病或病症例如移植排斥的情况的检测。通过提供在权利要求中表征的和下面进一步描述的实施方案实现了对该技术问题的解决。因此，本发明涉及诊断早期和/或不希望的免疫应答的优选的非侵袭性方法，所述方法包括分析T细胞免疫应答cDM7(TIRC7)在样品中的表达。如根据本发明使用的，术语"TIRC7"，也称为T细胞免疫调节剂l(TCIRGl)，是指参与T细胞激活和/或增殖的信号转导的蛋白和，优选以可溶性形式存在的、能够抑制或压制响应混合淋巴细胞培养中的异构激活(alloactivation)或响应有丝分裂原(当向培养物中外源加入有丝分裂原时)的T细胞增殖的蛋白。体外翻译的TIRC7蛋白能够有效地以剂量依赖性的方式抑制响应混合淋巴细胞培养中的异构激活或响应有丝分裂原的T细胞的增殖。TIRC7对于本领域技术人员来说是已知的并且描述于，尤其是，W099/11782和Utku等人，Immunity9(1998)，509-518和Heinemann等人，Genomics57(1999)，398-406中。核苷酸和氨基酸序列也描述于国际申请W099/11782和Heinemann等人(1999)，同上。因此，本发明已描述了T和B细胞上的新的细胞表面分子(Utku等人，J.Inmumol.173(2004)，2342-2352)。使用不同动物模型的TIRC7的抗体靶向显示通过在T细胞上诱导CTLA4和减少CD"的表达对肾脏或心脏同种异体移植物的器官排斥产生了有效的预防(Utku等人，Immunity9(1998)，509-518;Kumamoto等人，Am.J.Transplant4(2004)，505-154)。根据本发明，可确定T细胞免疫应答cDNA7(TIRC7)TIRC7在外周血淋巴细胞中在早期免疫激活时表达，在肾移植后在排斥之前和期间在炎性细胞中和在患有已确立的类风湿性关节炎的患者的关节中持续被诱导。此外，令人吃惊地发现体液例如尿中的TIRC7的表达符合TIRC7表达的组织学检查；参见实施例1和2。因此，尿中的TIRC7mRNA表达的测量为确定免疫系统的状态提供了新的非侵袭性方法。在肾脏移植后对器官排斥的前2天，使用TaqmanPCR方法分析患者的尿中的TIRC7的表达导致发现TIRC7用作早期生物标记物在早期阶段检测免疫激活(而不使用侵袭性方法例如活组织检查进行检测)的有益和有利的用途。在关于由人体的免疫应答引起或攻击的病症和疾病的上下文中，这使得可以例如增加或减少各治疗的免疫治疗剂量，从而最优化患者(例如移植物受者)的治疗。在该方面，容易理解本发明的方法也可用于监测免疫抑制剂的活性，其中与非治疗受试者相比TIRC7的表达的下调表示被抑制的或非激活的免疫应答。换句话说，本发明也涉及此处描述的用于确定抑制的免疫应答的方法。原则上，本发明的方法可用于其中希望评估免疫应答(如果有)的状态的任何情况。通常，所述免疫应答由传染性疾病或炎性疾病诱发。优选地，所述炎性疾病是自身免疫性疾病，例如，牛皮癣、多发性硬化症、关节炎或移植排斥。在本发明的方法的特别优选的实施方案中，所述疾病是肾移植排斥或类风湿性关节炎。从受试样品获得基因样品(geneticsample)。基因样品包含核酸，优选RNA。例如，在确定TIRC7的表达中，人们可从受试样品获得mRNA，并且可将该mRNA反转录为cDNA以进行进一步分析。在另一个实施方案中，mRNA自身用于确定TIRC7的表达。在一些实施方案中，可通过确定基因产物(例如蛋白质)的水平/存在来确定TIRC7的表达水平，从而消除了对从受试样品获取基因样品的需要。抗TIRC7的多克隆抗体和单克隆抗体以及核酸探针描述于例如W099/11782和Utku等人，Immunity9(1998)，509-518;也参见上面。优选地存在足够的受试样品以获得大量足以精确和可靠地确定TIRC7的表达水平的基因样品。在某些实施方案中，为了获得代表性取样可采集多个样品。可通过^f吏用本领域内已知的任何技术(Ausubel等人CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,1999);MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，由Sambrook，Fritsch，和Maniatis编著(ColdSpringHarborLaboratoryPress:1989);NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编著，1984);论文，MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.);其各自在此引用作为参考)从受试样品获得基因样品，例如核酸样品。可使用DNA或RM纯化技术从完整的细胞纯化核酸。也可使用PCR或需要亚克隆的体内技术扩增基因样品。在优选实施方案中，通过从受试样品的细胞分离mRM，然后将所述RM反转录成DM以产生cDNA来获得基因样品(Khan等人，Biochem.Biophys.Acta1423(1999)，17-28;在此引用作为参考)。一旦获得受试样品，可就TIRC7的存在或不存在对其进行分析。可使用本领域已知的任何技术进行该分析，所述技术包括，但不限于，序列测定、PCR、RT-PCR、定量PCR、限制性片段长度多态性、杂交技术、Northern印迹法、微阵列技术、MA微阵列技术等。在确定TIRC7在受试样品中的表达水平中，可通过与另一种基因例如熟知的、良好表征的基因或管家基因的表达比较来标准化表达的水平；也参见实施例。为了确定特定免疫应答的表型或特征，可使用下面实施例中描述的统计学方法分析来自TIRC7的表达数据。也可将分析的数据用于选择/描述(profile)患者以进行特定的治疗方案。本发明的方法中的分析表达包括用于检测TIRC7的表达的任何定性或定量方法，这些方法中的许多方法在本领域内是已知的。所述方法可包括通过使用定量方法测量TIRC7的表达或通过使用定性方法来分析TIRC7的表达。下面描述用于分析多核苷酸和多肽的非限定性方法。优选地，使用指向多核苷酸的方法分析表达。因此，在本发明的方法的优选实施方案中，样品包含核酸，其中通过检测编码TIRC7的多核苷酸来分析TIRC7的表达，其中TIRC7的表达的增加表示免疫应答的激活。本发明的方法可包括例如从生物样品提取核酸的步骤。检测TIRC7核酸靶基因的存在，即其量(如果存在)或不存在。优选地，在检测前扩增核酸。优选扩增方法是使用逆转录和聚合酶链式反应(PCR)。在本发明的一个实施方案中，PCR进一步包括嵌套PCR。在优选实施方案中，所述方法还可包括制备至少两对与TIRC7核酸的区域互补的引物。分析TIRC7的存在的方法也可使用生物芯片，或其他微型高通量技术。生物芯片例如包括生物阵列(bioarray)的生物芯片的生产和用途在本领域是已知的并且可商购获得；参见，例如，可从Sigma-Genosys(TheWoodlands,TX);Affymetrix(SantaClara，CA)和FullMoonBiosystems(Sunnyvale,CA)商购获得的生物阵列。关于生物芯片和生物阵列的综述参见，例如，Kallioniemi，Ann.Med.33(2001)，142-147;和Rudert，Curr.Opin.Mol.Ther.2(2000)，633-642)。可使用类似于下面讨论的用于检测多核苷酸和多肽的常规技术的印迹技术分析这些生物阵列。用于分析基因表达的其他微流装置和方法，特别是其中可同时分析一个以上的基因的那些装置和方法和涉及高通量技术的装置和方法，可用于本发明的方法。使用生物阵列对表达水平的定量测量在本领域也是已知的，并且通常包括此处所述的用于测量表达的常规方法的改进形式。例如，可通过使用砩光体图像仪(phospohorimager)和成像软件测量结合至微阵列的斑点的放射性标记的探针的磷光体像(phosphorimage)来进行该定量。用于分析生物阵列数据例如核酸微阵列数据的分析生物信息学方法是可获得的并且描述于现有技术中；参见，例如，国际申请綱3/067217。本发明的方法通常使用分离自皮肤样品的RNA，包括信使RNA(mRM)。所述RNA可以是单链或双链的。可使用本领域内熟知的最适于将模板反转录成DNA的酶和条件。备选地，可将RNA接受RNA酶保护测定法。也可使用包含各自的一条链的DNA-RM杂交体。也可使用多核苷酸的混合物，或可使用利用相同的或不同的引物在之前的扩增反应中产生的多核苷酸。在其中要扩增多核苷酸序列的情况下，所述多核苷酸序列可以是TIRC7的部分，或最初可以以不连续的分子形式存在，这样特定的序列是完整的核酸。待扩增的序列最初不必以纯的形式存在；其可以是复合混合物的小部分。此外，如果RM是获自样品的多核苷酸，那么可使用RM酶保护测定法。在该方法中，将标记的反义RNA探针与样品中互补的多核苷酸杂交。通过核酸酶处理降解剩下的未杂交的单链探针。杂交的、双链的探针得到保护从而免受RNA酶的降解。在合适的时间后，收集降解反应的产物，然后在凝胶上进行分析(参见例如Ausubel等人，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,section4.7.1(1987))。如此处所用的，"RNA探针"是指能够与目的样品中的RNA杂交的核糖核苷酸。本领域技术人员能够鉴定和改良对于待测量的多核苷酸是特异性的RNA酶保护测定法，例如，可改变探针的特异性，杂交温度、核酸的量等。另外，许多商业试剂盒可商购获得，例如，RiboQuantTMMulti-ProbeRNAseProtectionAssaySystem(Pharmingen，Inc.，SanDiego，CA)。在另一个实施方案中，可通过印迹法通常为Northern印迹法分析样品中的多核苷酸。为了进行印迹法，在凝胶上分离多核苷酸，然后用针对目的序列的互补多核苷酸探测。例如，将凝胶上分离的RNA转移至硝酸纤维素，然后用针对一个此处公开的黑色素瘤差异诊断基因(melanomadifferentially-diagnosedgene)的互补DNA进行探观'J。可对互补探针进行放射性、化学等标记。探针的杂交表示存在目的黑色素瘤。可通过使用放射性标记的探针任意地进行多核苷酸的检测。可使用提供足够信号的任何放射性标记。其他标记包括配体、有色染料和荧光分子(其可用作被标记的配体的特异性结合对成员)等。通过例如Southern或Northern杂交技术，可将标记的制剂用于探测多核苷酸。将获自样品的核苷酸转移至结合多核苷酸的滤纸。在对标记的、将与包含靶核酸序列的核苷酸片段杂交的多核苷酸探针进行暴露后，通过放射自显影法鉴定放射性探针对靶核苷酸片段的结合(参见GeneticEngineering,第l版.RobertWilliamson,AcademicPress(1981)，pp.72-81)。特定的杂交技术对于本发明不是必需的。杂交技术对于本领域技术人员来说是熟知或容易由本领域技术人员确定。由于对杂交技术进行了改进，因此其可用于本发明的方法。此处公开了用于本发明的方法的选择性与TIRC7杂交的本发明的探针。在优选实施方案中，使用本领域已知的方法将探针点在生物阵列上。如此处所用的，术语"选择性杂交"或"选择杂交"是指在中等严紧或高严紧条件下杂交，以使核苷酸序列优先于不相关的核苷酸序列地与选择的核苷酸序列结合，达到足以用于检测TIRC7的表达的程度。要承认，一定量的非特异性杂交是不可避免的，但却是可接受的，只要对靶核苷酸序列的杂交具有使其可与非特异性交叉杂交相区分的充分选择性，如例如由结合靶核酸分子的经标记的寡核苷酸的量确定的，与除了靶分子外的核酸分子特别是除了靶核酸分子外基本上相似(即，同源)的核酸分子相比，至少大约2倍多的选择性，通常至少大约3倍多的选择性，通常至少5倍多的选择性和特别地至少大约IO倍多的选择性。可通过经验确定，或可基于例如杂交寡核苷酸和其将杂交的序列的相对GC:AT含量、杂交寡核苷酸的长度和寡核苷酸和其将杂交的序列之间的错配数目(如果有的话)估计允许进行选择性杂交的条件(参见，例如，Sambrook等人，"MolecularCloning:Alaboratorymanual(ColdSpringHarborLaboratoryPress1989))。渐进增高的严紧条件的实例如下2xSSC/0.1%SDS，在大约室温下(杂交条件)；0.2xSSC/0.1%SDS,在大约室温下(低严紧条件)；0.2xSSC/0.1%SDS,在大约42'C(中等严紧条件)；和0.1xSSC,在大约68'C(高严紧条件)。可只使用这些条件中的一个条件例如高严紧条件进行洗涤，或可以以上面列出的顺序使用所述条件的各个条件，例如各自进行10-15分钟，重复任何或所有列出的步骤。然而，如上面所提到的，最适条件可发生变化(取决于涉及的特定杂交反应)，并且可通过经验进行确定。在其被检测前可扩增编码TIRC7的多核苷酸。术语"扩增的"是指从单个多核苷酸分子产生多拷贝的该核苷酸分子的过程。可通过本领域技术人员已知的生物化学方法体外进行多核苷酸的扩增。扩增试剂可以是用于完成引物延伸产物的合成的任何化合物或系统，包括酶。用于该目的的合适的酶包括，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I、Taq聚合酶、大肠杆菌DM聚合酶I的Klenow片段、T4DM聚合酶、其他可获得的DNA聚合酶、聚合酶突变体、逆转录酶、连接酶和其他酶，包括热稳定的酶(即，在接受提高到足以导致变性的温度后进行引物延伸的酶)。合适的酶可以以适当的方式促进核苷酸的组合，从而形成对于各突变核苷酸链是互补的引物延伸产物。通常，合成在各引物的3，末端起始并以5，方向沿模板链进行，直至合成终止，产生不同长度的分子。然而可存在使用与上述方法相同的方法，于5，末端起始合成并以其他方向进行的扩增试剂。无论如何，本发明的方法不限定于此处描述的扩增的实施方案。可根据本发明使用的体外扩增的一个方法是例如描述于美国专利4，683，202和4，683，195中的聚合酶链式反应(PCR)。术语"聚合酶链式反应"是指通过使用热稳定的DNA聚合酶和两个寡核苷酸引物扩增DM碱基序列的方法，一个引物与待扩增的序列的一个末端上的(+)-链互补而另一个与在另一末端上的(-)-链互补。因为新合成的DNA链随后可用作相同引物序列的额外的模板，引物退火、链延伸和解链的连续循环产生希望的序列的快速和高度特异性的扩增。许多聚方法。例如，可将DNA如下经历热循环仪中的30至35个扩增循环95'C进行30秒、52至60X:进行1分钟，和72C进行1分钟，和终延伸步骤在72。C下进行5分钟。例如另一个例子，可将DNA在热合成仪中经历35个聚合酶链式反应循环在95'C的变性温度下进行30秒，然后在从54至58。C的范围内改变退火温度，进行1分钟，在70匸下进行延伸步骤1分钟和在70。C下进行终延伸步骤。只要引物能够与目的多核苷酸杂交，可使用任何合适的方法，例如常规的磷酸三酯和磷酸二酯法或其自动化实施方案制备用于扩增本发明的多核苷酸的引物。用于在经修饰的固体支持物上合成寡核苷酸的一个方法描述于美国专利4，458，066中。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、緩冲液和核苷酸组成。引物必须在用于扩增的诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。根据本发明的方法使用的引物对于待扩增的核苷酸序列的各链是互补的。术语"互补"是指引物在允许用于聚合作用的试剂起作用的条件下必定与其各自的链杂交，换句话说，与侧翼连接序列互补的引物与该侧翼连接序列杂交并且允许核苷酸序列的扩增。优选地，被延伸的引物的3，末端具有与互补的侧翼连接链完全碱基配对的互补性。可使用与本公开内容结合的已知的方法开发用于差异表达的TIRC7的引物和探针。本领域技术人员知道也可用于增加靶核酸的拷贝数的各种扩增方法。可在溶液中或在结合至固体支持物后，通过用于检测特定核酸序列的任何方法例如另一种聚合酶链式反应、寡聚物限制性(Saiki等人,Bio/Technology3(1985)，1008-1012)、等位基因特异的寡核苷酸(allele-specificoligonucleotide)(AS0)探针分析(Conner等人，Proc.Natl,Acad.Sci.USA80(1983)，278)、寡核苷酸连接分析法(OLA)(Landegren等人，Science241(1988)，1077)、RNA酶保护测定法等对本发明的方法中检测的多核苷酸进行进一步评估、检测、克隆、序列测定等。已对用于DNA分析的分子技术进行了综述(Landegren等人，Science242(1988)，229-237)。在DNA扩增后，可在不使用放射性探针的情况下，通过Southern印迹分析检测反应产物。在该方法中，例如，扩增从组织或受试者获得的少量包含多核苷酸的DNA样品，并通过Southern印迹技术进行分析。通过高水平的扩增信号促进非放射性探针或标记的使用。在本发明的一个实施方案中，一个三磷酸核苷被放射性标记，从而允许通过放射自显影术直接看到扩增产物。在中一个实施方案中，对扩增引物进行荧光标记并将其通过电泳系统跑胶。通过激光检测显现扩增产物，然后进行计算机辅助图形显示，从而无需放射性信号。本发明的方法可包括实时定量PCR测定法，例如Taqman测定法(Holland等人，Pro"Natl.Acad.Sci.USA,88(1991)，7276);也参见实施例2。可在设计用于进行该测定的仪器例如可从AppliedBiosystems(FosterCity，CA)商购获得的仪器上进行所述测定。可根据本领域内已知的方法设计用于该测定的引物和探针。根据本发明的方法，可使用包含分离的产物的凝胶的简单目测法分析TIRC7。例如，对凝胶进行染色以使分离的多核苷酸可见，许多染料对于本领域技术人员来说是熟知的。然而，也可使用本领域技术人员已知的其他方法，例如扫描光密度仪、计算机辅助扫描与定量以及其他方法。根据本发明用于检测TIRC7的方法可选择地使用TIRC7基因的多肽产物的检测。在这点上，样品(如此处所述的)可用作分离多肽的来源。特定多肽的测量可用作免疫系统相关性疾病的检测、分期、诊断、监控、预测或辅助治疗的方法。例如在采集样品后，使用本领域技术人员已知的方法，例如通过ELISA定量多肽。针对特定多肽的单克隆抗体可用于(例如以液相或结合至固相栽体的形式)免疫测定法以检测TIRC7多肽。此外，可以各种方法可检测地标记这些免疫测定中的单克隆抗体。可使用单克隆抗体的免疫测法。此类免疫测定法的实例是放射免疫测定法(RIA)和三明治(免疫测定)分析法。可使用以正向、反向或同步模式进行的免疫测定法(包括对生理样品的免疫组织化学测定)进行使用单克隆抗体进行的多肽抗原的检测。本领域技术人员知道，或可容易地识别其他免疫测定形式而无需过度的实验。优选地，可将识别TIRC7的主要(第三)细胞外结构域的抗体(参见图1或W099/11782)用于本发明的诊断方法中。特别有用的抗TIRC7抗体描述于国际申请W003/054018和WO03/054019中。术语"免疫测定分析法"或"三明治免疫测定法"包括同步三明治、正向三明治和反向三明治免疫测定法。本领域技术人员明确地理解这些术语。本领域技术人员也认识到本发明的抗体可用于目前已知的或可在将来发展的测定法的其他变种和形式中。这些变体和形式希望包括在本发明的范围内。可将单克隆抗体结合至许多不同的载体和用于检测TIRC7多肽的存在。熟知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然的和经修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。对于本发明的目的，载体的性质可以是可溶性的或不溶性的。本领域技术人员知道用于结合单克隆抗体的其他合适的载体，或能够使用常规实验确定此类栽体。当TIRC7多肽存在于生物学液体中时可用单克隆抗体检测。在进行测定中，可希望在温育培养基中包含某些"封闭剂"(通常与标记的可溶性抗体一起加入)。加入"封闭剂"以确保非特异性蛋白对存在于实验样品中的抗TIRC7免疫球蛋白不产生交叉连接或破坏固相支持物上的抗体或放射标记的指示剂抗体从而产生假阳性或假阴性结果。因而"封闭剂"的选择可实质性地增加测定的特异性。已发现许多与用于测定的种类或亚类相同的种类或亚类(同种型)的非相关(即，非特异性)抗体(例如，IgGl、IgG2a、IgM等)可用作"封闭剂"。为了保持适当的灵敏度同时还抑制由样品中相互发生交叉反应的蛋白导致的不想要的干扰，"封闭剂"的浓度(通常1-100lag/ml)可以是非常重要的。如前面所述，样品优选是体液，例如，尿、淋巴、腹水、脑脊髓液、滑膜液、胸膜(腔)积液、痰、粪便、眼泪、汗、脓等。最优选地，所述样品是尿；也参见实施例2。在另一个方面，本发明提供了用于监测受试者的可疑的免疫应答的非侵袭性方法。所述方法包括分析样品(优选来自第一时间点和第二时间点的尿液)中TIRC7的表达，和比较第一时间点和第二时间点的表达。时间点可包括任何时间间隔，但通常为至少2周，和更通常至少l个月的间隔。对于某些实施方案，时间点是2个月、3个月、6个月、l年或2年的间隔。可在任何数目的时间包括2、3、4、5个等时间点釆集样品。可使用用于比较数据点以评估数据中的差异的已知的统计学方法(包括基于时间的统计学方法例如控制绘图(controlcharting))进行来自不同时间点的表达分析数据的比较。可通过将表达水平与截断值比较或通过比较表达水平的改变以确定它们是否超过截断改变值(例如百分比改变截断值)来按时间顺序鉴定TIRC7。优选在给定的患者中进行上述方法至少2次。在检测后，可将在给定的患者中看到的结果与统计学上显著的正常患者和受试患者的参照组比较。这样，可能使确定的TIRC7的表达水平与各种临床状态或疾病预后发生相联。该实施方案特别适合用于监控因为例如移植目的而具有被抑制的免疫系统的患者。一些人必须服用免疫抑制药以预防转移的器官的排斥或因为他们患有其中免疫系统攻击身体自身组织的疾病(自身免疫性疾病)；其他人可需要放射治疗以治疗另一种形式的癌症。因为这些原因，服用免疫抑制药或接受放射治疗的所有人应当每隔一定时间进行TIRC7表达的检查。因此，本发明的方法对于这些患者群体特别有利。在其他实施方案中，本发明的方法特别适合用于在疾病进展期间监控自身免疫性疾病，特别是多发性硬化症。因为TIRC7蛋白的量似乎与疾病的状态相关，在正进行医学治疗的患者中的TIRC7的检测可用于治疗方法进程的预后。因此，本发明的方法包括在遭受例如多发性硬化症、脉管炎(vasculititis)或中枢神经系统(CNS)的胂瘤的患者中检测TIRC7的表达以诊断和更明确地监控疾病的进展或消退。更优选地，被用于采集样品以分析TIRC7的表达的体液是溶液(liquor)或血清。此外，TIRC7抗体例如上文中描迷的抗体(特别是其中这些抗体被标记的抗体)的使用是优选的。然而，也涉及基于此处描述的技术的核酸的使用。当然本实施方案特別适合用于定制药物剂量和施用方案，因为依赖于本发明的方法的结果，可施用更高或更低的药物浓度。例如，如果分别检测到大量的TIRC7核酸和蛋白，那么可施用更高浓度的药物和/或以更短的间隔施用药物。因此，本发明的方法在避免超剂量和剂量不足地施用给定的药物中是特别有利的。在另一个实施方案中，本发明提供了用于本发明的方法的试剂盒，其包括一种或多种选择性结合TIRC7的核酸或抗体探针或引物；和任意地包4舌检测工具(means)。也可将寡核苷酸引物点在试剂盒中提供的生物阵列上。该试剂盒可包括皮肤样品收集装置和选择性结合TIRC7的探针。这样的试剂盒也可包括经划分从而以封闭限制的方式接受一个或多个容器例如瓶子、试管等的载体工具，容器包含用于本方法的分开的组分(element)的一种组分。如果存在，第二容器可包含裂解緩沖液。可选择地，试剂盒可包含计算机类型的芯片，在该芯片上，通过电流实现细胞的裂试剂盒也可具有包含探针或引物的容器或包含报告子的容器，所述探针或引物用于可被标记的或可不被标记的靶核酸序列的扩增或与其杂交，所述报告子是例如结合至报告分子(例如酶、荧光或放射性核素标记)的生物素结合蛋白(例如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)。术语"可检测标记的脱氧核糖核苷酸"是指与用于检测脱氧核糖核苷酸的可检测标记结合的脱氧核糖核苷酸。例如，可检测标记可以是放射性标记的核苷酸或共价结合至核苷酸的小分子(其中所述小分子被良好表征的大分子识别)。这些小分子的实例是被抗生物素蛋白结合的生物素和被抗甲状腺素抗体结合的甲状腺素。标记的其他方法对于本领域技术人员来说是熟知的，包括酶、荧光化合物、化学发光化合物、发磷光化合物和生物发光化合物。试剂盒可包括一种或多种引物对，所述引物对包括选择性地在一条链上结合TIRC7基因的上游的正向引物，和选择性地在互补链上结合TIRC7基因的上游的反向引物。随着新标记被鉴定，可开发显示与不同的种族集团或性别、不同的地理分布、不同的疾病分期、不同的特异性程度或不同的敏感性程度最佳作用的不同组合。也可开发对于治疗方案对疾病进展的效果是净争别灵敏的标^己纟且合。例3口，已由Kotsch等人，在Transplantation77(2004)，1866-1875中报导了早期和延迟的急性肾同种异体移植物排斥中的增加的颗粒溶素mRM表达，其中描述于第1867和1868页的材料和方法明确地在此引用作为参考。可在手术、低体温症、免疫治疗、细胞因子治疗、基因治疗、放射治疗或化学治疗后监控患者以确定特定的治疗是否有效。因此，本发明通常涉及此处公开的方法用于确定与免疫应答的病症或早期激活相关的疾病的风险和/或分期的用途。根据本发明的方法诊断的疾病的其他实例包括，但不限于，免疫系统病症例如炎症、光化性角化病、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、阿狄森氏病、成人呼吸窘迫综合征、变态反应、强直性脊柱炎、淀粉样变病、贫血、动脉硬化、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性甲状腺炎、支气管炎、滑嚢炎、胆嚢炎、肝硬化、接触性皮炎、克罗恩病、异位性皮炎、皮肌炎、糖尿病、肺气肿、胎儿母红血球增多症、结节性红斑、萎缩性胃炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻氏综合征、痛风、突眼性曱状腺肿、桥本甲状腺炎、阵发性睡眠性血红蛋白尿、肝炎、嗜伊红细胞增多症、肠易激综合征(irritablebowelsyndrome)、发作性淋巴细胞减少伴淋巴细胞毒素(episodiclymphopeniawithlymphocytotoxins)、混合性结締组织病(MCTD)、多发性硬化症、重症肌无力、心肌或心包炎症(myocardialorpericardialinflammation)、骨髓纤维化、骨关节炎、骨质疏松症、胰腺炎、真性红细胞增多症、多发性肌炎、牛皮痺、莱特尔(氏)综合征、类风湿性关节炎、硬皮症、舍格伦综合征、全身性过敏反应、系统性红斑狼齊、系统性硬化病、原发性血小板增多症、血小板减少性紫癜、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、沃纳综合征、癌症的并发症(complicationsofcancer)、血、液透牙斤、和体夕卜循环、夕卜Y另和造血性癌症(hematopoieticcancer)包括淋巴瘤、非白血性白血病、和骨髓瘤；生殖病症例如催乳素产生性病症、不孕症包括输卵管疾病、排卵缺陷(ovulatorydefects)和子宫内膜异位、动情周期的打断、月经周期的打断、多嚢性卵巢综合征、卵巢过度刺激综合征、子宫内膜或卵巢肿瘤、子宫肌瘤、自身免疫性疾病、异位妊娠、和畸形发生、乳腺癌、纤维嚢性乳房疾病、和乳溢、精子发生的破坏、畸形精子生理学、睾丸癌、前列腺癌、良性前列腺增生(症)、前列腺炎、佩罗尼氏病、阳痿、男性乳腺癌、和男子女性型乳房；神经系统疾病例如癫痫、缺血性脑血管疾病、中风、脑肺瘤、阿尔茨海默病、皮克氏病、亨丁顿舞蹈症、痴呆、帕金森病和其他锥体外障碍洗眼杯疾病、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化和其他神经元病症、进行性神经性肌萎缩、色素性视网膜炎、遗传性共济失调、多发性硬化症和其他脱髓鞘性病、细菌引起的脑膜炎和病毒性脑膜炎、脑脓肿、硬脑膜下积脓、硬膜外脓肿、化脓性颅内血松性静脉炎(suppurativeintracranialthrombophlebitis)、脊髓炎和脊神经根炎、滤过性毒菌引起的中枢神经系统疾病、朊病毒病包括库鲁病、克罗伊茨费尔特-雅各布病，痘挛性假性硬化、和Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征、致命性家族性失眠症、神经系统的营养和新陈代谢疾病、神经纤维瘤病、结节性硬化、小脑视网膜的成血管细胞瘤病、脑三叉神经综合征(encephalotrigeminalsyndrome)、智力发育障碍和中枢神经系统的其他发育病症、脑性麻痹、神经骨骼病症、自主神经系统病症、脑神经病症、脊髓疾病、肌营养不良和其他神经肌肉障碍、周围神经系统病症、皮肌炎和多发性肌炎、遗传性、代谢性、内分泌和中毒性肌病、重症肌无力、周期性麻痹、精神紊乱(精神紊乱)包括情绪、焦虑和精神分裂性障碍、静坐不能(akathesia)、健忘症、紧张症、糖尿病神经病变、迟发性运动障碍、张力障碍、偏执型精神病、带状疱疹后神经痛和图雷特(氏)精神障碍；细胞信号转导病症包括内分泌病症例如由损伤导致的下丘脑和脑下垂体的病症例如原发性脑肿瘤、腺瘤、妊娠相关梗塞、垂体摘除术、动脉瘤、血管畸形、血栓症、感染、免疫病症和由头部创伤引起的并发症；垂体功能亢进相关病症包括肢端肥大症、巨大症(giantism)、和通常由良性腺瘤引起的不适当抗利尿激素(ADH)分泌(SIADH)的综合征；曱状腺功能减退相关病症包括甲状腺肿、粘液(性)水胂、细菌感染相关性急性甲状腺炎；甲状旁腺功能亢进相关病症包括Conn病(慢性骨痂增生)；胰脏病症例如I型或II型糖尿病和相关的并发症；肾上腺相关病症例如超常增生、癌，或肾上腺皮质腺瘤、碱中毒相关高血压；性腺类固醇激素相关病症例如在妇女中，异常催乳素的产生、不孕、子宫内膜异位、月经周期的干扰、多嚢卵巢病、高催乳素血症、单一性促性腺激素缺乏症、闭经、乳溢、两性同体、多毛症和男性化、乳腺癌，和，在经绝后的妇女中，骨质疏松症；和，在男性中，莱迪希细胞缺乏、男性更年期、和生殖细胞不发育症、莱迪希细胞肿瘤相关性腺机能亢进病症(hypergonadaldisordersassociatedwithLeydigcel1tumors)、雄性激素受体缺乏相关性雄激素抗性(androgenresistanceassociatedwithabsenceofandrogenreceptors)、5a-还原酶的综合征、和男子女性型乳房；和细胞增殖病症例如光化性角化病、血管硬化、动脉粥样硬化、滑嚢炎、肝硬化、肝炎、混合性结締组织病(MCTD)、骨髓纤维化、阵发性夜间血红蛋白尿、真性红细胞增多症、牛皮癣、原发性血小板增多，和癌症包括腺癌、非白血性白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌，和，特别地，肾上腺、膀胱、骨、骨髓、脑、乳腺、宫颈、胆嚢、神经中枢、胃肠道、心脏、肾、肝、肺、肌肉、卵巢、胰腺、曱状旁腺、阴茎、前列腺、涎腺、皮肤、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫的癌症。在其他方面，本发明涉及治疗剂(优选免疫抑制剂)用于预防或治疗受试者的上述疾病的任一种的的用途，其中根据本发明的诊断方法，所述受试者经检测为阳性。本发明的描述和实施例公开和包括了这些和其他实施方案。使用例如电子设备可从公共图书馆和数据库检索到关于根据本发明使用的任何一种材料、方法、用途和化合物的其他文献。例如可利用由在美国国立卫生研究院的美国国家生物技术信息中心和/或美国国立医学图书馆拥有的公共数据库"联机医学文献分析与检索系统(Medline)"。其他数据库和网址，例如为欧洲分子生物学实验室(EMBL)的部分的欧洲生物信息研究所(EBI)的数据库和网址对本领域技术人员来说是已知的并且也可通过使用国际互联网检索引擎获得。在Berks,TIBTECH12(1994)，352-364中提供了生物技术学的专利信息的综述和用于回顾搜索和最新文献通报的专利信息的相关来源的纵览。在整个本说明书的内容中引用了几份参考资料。所有引用的参考资料(包括在整个本申请中引用的文献来源、发行的专利、公布的专利申请书和厂商的详述、技术说明书等)的内容明确地在此引用作为参考；然而，不承认引用的任何资料对于本发明确实是现有技术。上面的公开内容通常描述了本发明。可通过参考下列特定的实施例获得更完全的理解，所述实施例在此处只是为了说明而提供的，从而不希望限定本发明的范围。实施例下面的实施例进一步举例说明本发明，但不应当解释为以任何方式限定本发明的范围。常规方法例如此处所用的方法的详细描述可见于引用的文献中；也参见"TheMerckManualofDiagnosisandTherapy",第17版，由Beers和Berkow(Merck&Co.,Inc.2003)除非另外指出，本发明的实践将使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力范围之内。分子遗传学和基因工程中的方法通常描述于当前版本的MolecularCloning:ALaboratoryManual,(Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress);DMCloning,第I和II巻(Glover编著，1985);OligonucleotideSynthesis(Gait编著，1984);NucleicAcidHybridization(Hames和Higgins编著，1984);TranscriptionAndTranslation(Hames和Higgins编著，1984);CultureOfAnimalCells(Freshney和Alan,Liss，Inc.,1987);GeneTransferVectorsforMammalianCells(Mi1ler和Calos，编著，)；CurrentProtocolsinMolecularBiologyandShortProtocolsinMolecularBiology,第3版(Ausubel等人，编著，)；和Recombinant腿Methodology(Wu，编著，AcademicPress)。GeneTransferVectorsForMammalianCells(Mi1ler和Calos，编著，1987,ColdSpringHarborLaboratory);MethodsInEnzymology,第154和155巻(Wu等人，编著，)；ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress,1986);Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning(1984);论文，MethodsInEnzymology(AcademicPress,Inc.，N.Y.);ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker,编著，AcademicPress,London,1987);HandbookOfExperimentalImmunology,第I至IV巻(Weir和Blackwel1，编著，1986)。本公开内容中提及的用于基因操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业售主例如BioRad、Stratagene、Invitrogen和Clontech商购获得。细胞培养和培养基收集中的一般技术概述于LargeScaleMammalianCellCulture(Hu等人，Curr.Opin.Biotechnol.8(1997)，148);Serum-freeMedia(Kitano，Biotechnology17(1991)，73);LargeScaleMammalianCellCulture(Curr.Opin.Biotechnol.2(1991)，375);和SuspensionCultureofMammalianCells(Birch等人，BioprocessTechnol.19(1990),251);ExtractinginformationfromcDNAarrays,Herzel等人，CHAOS11，(2001)，98-107。图1:在移植中作为诊断标记物的TIRC7。使用来自肾移植患者的尿样品进行TaqmanPCR分析的结果(平均值=0，131，标准差=0,115，n==IO)与无排斥事件的移植患者的尿样的分析结果(平均值=0，017,标准差=0，015，n=10)的比较。*灵敏度假定受试者具有疾病，试验结果为阳性的概率-通过TP/(TP+FN)估计。**特异性假定受试者不具有疾病，试验结果为阴性的概率-通过TN/(TN+FP)估计。实施例举例说明本发明。实施例1:作为用于免疫激活的早期检测的诊断标记物的TIRC7本实验的目的是检查TIRC7在各种组织中的表达，从而分析其作为生物标记在早期诊断不希望的免疫应答的可能作用。因此，在移植后在人肾同种异体移植的排斥期间，使用特异性单克隆抗体(mAb)检查TIRC7蛋白在已确立的类风湿性关节炎UA)的患者的关节组织和滑膜液中以及健康志愿者的静息和激活的外周血淋巴细胞(PBL)中的表达。通过免疫组织学，在急性排斥的活组织检查确认的诊断后，使用FITC标记的抗TIRC7mAb通过免疫组织学方法在肾脏同种异体移植物受者(所述受者用基于钙调神经磷酸酶抑制剂免疫抑制进行治疗)的临床活组织检查中检测TIRC7的表达。将从患有类风湿性关节(RA)的患者分离的关节组织接受使用直接FITC标记的抗-TIRC7mAb的免疫组织化学检查。使用抗TIRC7mAb对用同种异体抗原激活的PBL进行流式细胞检测分析。使用多克隆TIRC7特异性抗体在CD4+和CD8+T细胞上确定TIRC7蛋白的表达。用缀合的mAb(CD28,CD45R0)对细胞进行染色，然后通过FACScalibur流式细胞测定仪分析样品。免疫荧光显微镜显示，从在使用各种试剂(钓调神经磷酸酶抑制剂；FK506/环孢素A(CyA)、甲基泼尼松龙(MP)和麦考酚酸莫酯(CC))的免疫抑制剂组合疗法下具有急性排斥的患者获得的人组织的淋巴细胞强烈地表达TIRC7(n-5)，而正常肾不显示任何TIRC7表达。TIRC7mAb染色显示在获自膝关节样品的组织中和来自获自具有已确立的RA的患者的关节液的单核细胞中，TIRC7蛋白的表达强烈上调。在使用对照抗体进行染色的所有实验中未观察到染色。在人PBL上，TIRC7主要在对CD4+45RO+28+和CD8+45RO+28+激活的前1个小时内被诱导但在CD28-阴性T细胞上较少，表明TIRC7主要在静息记忆T细胞上表达但在原态(naive)T细胞和效应/记忆T细胞上表达较少。这些实验表明，在静息记忆T细胞的体外激活后TIRC7被强烈上调但在原态(CD45R0-)和效应器/记忆(CD28-)T细胞上上调较少并且在体内，在患有类风湿性关节炎(RA)的患者中和在被排斥的肾组织中也如此。总之，这些研究表明TIRC7可能适合用于记忆T细胞的耙向和作为免疫激活的诊断标记。实施例2:体液中用于诊断移植排斥的TIRC7的检测为了调查在体液中是否可检测到TIRC7的表达，如果可检测到，是否检测到的TIRC7的表达水平可表示免疫应答的状态，进行本实验。特别地，本研究的目的是分析TIRC7作为检测排斥的早期生物标记物物的功能作用，以使能够用简单的诊断代替活组织检查干预来进行移植后监控。因此在移植后在人肾同种异体移植的排斥期间使用特异性单克隆抗体OnAb)在肾移植后的患者的尿中检查TIRC7的表达。从经历组织学上确认的急性排斥的患者获得肾活检样品(n=5)。从被诊断为已建立的RA的患者获得关节组织和液体单核细胞(fluidmononuclearcells)。用经FITC标记的抗TIRC7的mAb对这些组织进行免疫组织学染色。外周血淋巴细胞获自健康志愿者。用促分裂原培养细胞。随后用缀合的mAb(CD4、CD8、CD16、CD19、CD28、CD45R0和抗-TIRC7mAb)染色，然后用FACScalibur流式细胞仪进行分析。对于mRNA表达分析，在10.000rpm和4C下对尿离心15分钟。用1mL磷酸盐緩沖盐水洗涤沉淀，然后在14.000rpm下在4X:下离心7分钟。弃去上清液，使用RNeasyTM试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)从沉淀分离总RNA。如近年来由Kotsch等人，Transplantation77(2004),1866-1875所描述的进行cDNA合成和实时RT-PCR。简而言之，使用ABIPRISM-7700DS系统(AppliedBiosystems)和40个循环(在95°C下进行15秒的变性和在60°C下进行60秒的退火-延伸)测量IP-10的mRNA。将组蛋白mRNA的基因表达用于式2—a"提供的标准化。使用PrimerExpress软件(AppliedBiosystems)设计所有引物和探针并在InstituteofMedicalImmunology,UniversitatsmedizinChari"，Ber1in确认其的有效性。在Tx后对17个具有aRx事件的患者就个体动态IP-10mRNA表达分析总共120个尿样品。通过与来自参照组的raRNAIP-10表达值的算术平均值(所这值基于来自26个具有稳定肾功能患者的85份尿样品)相比设定排异反应患者的2-a"值(2—脇t法)；参见Kotsch等人(2004),同上。将规范的来自对照患者的数据进一步用于建立2a-置信度。如图1中所示，从分离自排斥反应之前2天具有肾移植的患者的尿中的cDNA看出，TIRC7被诱导。这些结果表明TIRC7可用作在尿中检测排异反应的早期生物标记物，从而第一次使TIRC7成为检测早期免疫激活的有用的非侵袭性诊断标记。权利要求1.诊断早期和/或不希望的免疫应答的非侵袭性方法，所述方法包括分析样品中T细胞免疫应答cDNA7(TIRC7)的表达，其中TIRC7的上调表明存在免疫应答的激活。2.权利要求1的方法，其中所述免疫应答由传染性疾病或炎性疾病诱发。3.权利要求2的方法，其中所述炎性疾病是自身免疫性疾病。4.权利要求2或3的方法，其中所述疾病是牛皮瘅、多发性硬化症、关节炎或移植排斥。5.权利要求4的方法，其中所述疾病是肾移植排斥或类风湿性关节炎。6.权利要求1至5中任一项的方法，其中确定蛋白的转录活性或量。7.权利要求1至6中任一项的方法，其中样品包含核酸，和其中通过检测其编码性核苷酸来分析TIRC7的表达。8.权利要求7的方法，其中所述核酸包含RNA，并且通过分析TIRC7的RNA水平来分析表达。9.权利要求7或8的任一项，其中通过将核酸应用于生物阵列来分析TIRC7的表达。10.权利要求7至9中任一项的方法，其中核酸是mRNA，并且使用实时逆转录酶聚合酶链式反应(qRT-PCR)扩增所述核酸。11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述样品是体液的样12.权利要求ll的方法，其中所述样品是尿。13.用于权利要求1至12中任一项的方法的试剂盒，其包括一种或多种选择性结合TIRC7的核酸或抗体探针或引物；和任意地包括检测工具。14.权利要求13的试剂盒，其还包括从细胞分离和纯化mRNA所必需的试剂、用于cDNA的制备的酶和试剂和/或用于核酸的放射化学或发色团标记的酶和试剂。15.权利要求13或14的试剂盒，其中所述试剂盒提供作为生物阵列或基因芯片的部分的探针。16.权利要求1至12中任一项的方法用于确定与免疫系统的病症或早期激活相关的疾病的风险和/或分期的用途。17.免疫抑制剂用于预防或治疗权利要求2至5中任一项定义的疾病的用途，其中根据权利要求1至12中任一项的方法检测遭受或怀疑发生所述疾病的受试者。全文摘要本发明提供了通过检测T细胞免疫应答cDNA7(TIRC7)来诊断早期免疫激活的方法。特别地，描述了作为在非侵袭性诊断方法中用于检测移植排斥的早期生物标记物的TIRC7，所述非侵袭性诊断方法用简单的诊断方法取代活组织检查干预以进行移植后的监控。此外，提供了用于此类诊断方法的试剂盒。例如，在肾移植后的尿样品中检测TIRC7。文档编号C07K14/705GK101268373SQ200680022255公开日2008年9月17日申请日期2006年5月17日优先权日2005年5月17日发明者N·乌特库申请人:塞尔艾克特制药有限公司