专利名称：：IL-15Rαsushi结构域作为通过IL-15Rβ/γ的IL-15作用的选择性和有效的增强剂以及超...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及细胞因子诱导的和/或细胞因子刺激的生物响应领i或，更具体地涉及IL-15诱导和/或IL-15刺激的生物响应领域，并尤其涉及那些包含IL15R/3/7信号通^各的生物响应领域。
背景技术：
：IL-15是一种细胞因子，其类似于IL-2,起初被描述为T细胞生长因子(l)。这两种细胞因子属于四个a-螺旋束家族，并且它们的膜受体共有两个负责信号传导的亚单位(IL-2R/IL-15Rp和y链)(2)。IL-2Rp/Y复合物是这两种细胞因子的中等亲合力受体。其主要被大多数NK细胞表达，并能够在体外被纳摩尔浓度的IL-2或IL-15活化。在例如活化T细胞上表达并能够被皮摩尔浓度的任一细胞因子活化的高亲合力IL-2和IL-15受体另外含有它们自身特有的a链(IL-2Ra和IL-15Ra)，其赋予细胞因子特异性并增强细胞因子结合的亲合力(3)。两种细胞因子均在先天的和适应的免疫性中起关键作用。尽管最初的体外实验显示4交大的功能重叠(活化、淋巴细胞和NK细胞增殖和细胞毒性的诱导、B细胞增殖和免疫球蛋白合成的共刺激，T细胞的化学诱导)(1,4-6)，但最近的实验表明这两种细胞因子在体内显示互补的甚至相反的作用。小鼠中IL-2或IL-2Ra敲除与具有增加的活化T和B细胞总体自身免疫显型相关，而IL-15和IL-15Ra敲除则导致NK、NK-T、上皮内淋巴细胞和记忆CD8T细胞中的特异性缺陷(7，8)。此外，IL-2通过诱导激活诱导的细胞死亡(AICD)而促进外周耐受，而IL-15抑制IL-2介导的AICD(9),并且不同于IL-2,IL-15是CD8记忆T细胞的存活因子(IO)。根据这些观察结果，已提出IL-2的主要作用是限制活化T细胞的连续扩张，而IL-15对于T细胞分裂的起始和记忆T细胞的存活是关键的(ll)。已描述了IL-15转呈递的新机理，其中通过抗原呈递细胞(单核细胞、树突细胞)协同表达IL-15和IL-15Ra,并且与IL-15Ra结合的IL-15以转呈递到仅表达IL-15Rp/y受体的邻近NK或CD8T细胞(12)。作为共刺激事件发生于免疫突触的IL-15转呈递，现在似乎是IL-15体内作用的主要机理(13，14)。这表明其在肿瘤免疫监视中起主要作用(15)。IL-15Ra和IL-2Ra亚单位形成细胞因子受体的亚家族，因为在它们的N-末端胞外部分它们包括所谓的"sushi"结构域(在IL-15Ra中一个，在IL-2Ra中两个)，所述sushi结构域也发现于补体或粘着分子中(16)。在两种情况下均显示这些sushi结构域带有负责细胞因子结合的大部分结构元件。单独的IL-2Ra是IL-2的低亲合力受体(Kd=10nM)，而IL-15Ra以高亲合力与正-15结合(1:(1=100pM)。IL-2Ra通过蛋白水解的脱落是参与淋巴细胞活化的向下调节的自然机理。IL-2Ra被主要的螨过敏原Derpl裂解以抑制Thl细胞并偏爱过敏环境(17),并且被源自胂瘤的金属蛋白酶裂解以抑制遭遇癌的T细胞的增殖(18)。由此产生的可溶性IL-2Ra在体外是IL-2作用的竟争性抑制剂。然而，它仍然是低亲合力IL-2结合物，并且不太可能有效参与体内IL-2活性的向下调节。最近显示人IL-15Ra的可溶形式也能够由IL-15Ra阳性细月包通过涉及MMPs的脱落过程而自然释放(19)。与可溶性IL-2Ra相反，该可溶性IL-15Ra受体能够以高亲合力与IL-15结合，并有效封闭通过高亲合力IL-15Ra/p/y信号复合物驱动的增殖。该结果与sIL-15Ra作为拮抗剂的行为(如同其同系物sIL-2Ra)的概念一致，并且与小鼠sIL-15Ra在体外和体内的抑制作用一致(20,21)。在此，本发明人显示基本由IL-15R阿尔法(^L-15Ra)的sushi结构域组成的片段具有相反的作用。这样的片段能够通过IL-15R贝塔/伽玛(=IL-15R(3/力中等亲合力受体增强IL-15的结合以及生物活性，而不影响那些通过高亲合力受体的IL-15的结合以及生物活性。此外，本发明人描述了作为IL-15Rp/y复合物的有效超激动剂起作用的融会蛋白。这样的融合蛋白包括IL-15R/3Ay结合体，例如IL-15(或其保守片段、激动剂、模拟物)，所述IL-15R/5Ay结合体通过诸如柔性连接区的共价连接与保留IL-15Ra的sushi结构域的IL-15Rot或IL-15Ra片,爻融合。据本发明人所知，仅有一篇现有4支术报道了包括IL-15Rce相关元件的化合物，即可商购形式的可溶性IL-15Ra的刺激作用。该现有4支术为Giron-Michel等人发表的题为"Mem6rawe-Z)o回of朋j/mwc"ow51ow/mmawAae,鄉o/Wc/ragem7ora卩應潜合的X溶'^的/l-"/^-"/^复合務对乂类造j&源^^为v么yr子和^雜/，的文章(Blood,1October2005,Vol.106，No.7，pp.2302-2310;2005年6月网络预出版)。Giron-Michel等人的出版物公开了(参见Giron-Micheletal.中图7):-当重组IL-15(rlL-15)以10ng/ml的剂量使用时诱导显著的抗凋亡效应，并且-在0.1ng/mL的剂量下rIL-15不i秀导任何显著的抗凋亡效应，但是-当rIL-15与可溶性IL-15Ra的可商购形式共同4吏用时在0.1ng/mL的剂量下诱导显著的抗凋亡效应。Giron-Michel等人所用的可溶性IL-15Ra是IL-15Ra的可商购形式(购自R&DSystems,参照符号147-IR)。该可溶性IL-15Ra是可溶性IL-15Ra的修饰形式，其缺少外显子3。因此Giron-Michel等人所用的可溶性IL-15Ra的形式包括IL-15Ra的外显子2编码部分，直接连接于IL-15Ra的外显子4编码部分，不包含任何IL-15Ro;的外显子3编码部分。因此Giron-Michel等人所用的可溶性IL-15Ra的形式不对应于IL-15R0!的片段，而对应于其4务饰形式。Giron-Michel等人所用的可溶性IL-15Ra的形式还包括与其共《介连接的Fc片段(人IgG)。Fc片段不与IL-15R/8Ay结合。因此Giron-Michel等人的出版物没有公开其中可溶性IL-15Ra形式与IL-15R/5Ay结合体共价结合的任何化合物。Giron-Michel等人的出版物还公开了抗凋亡效应，但没有公开对IL-15R0Ay阳性细胞的增殖和/或活化的任何效应。能够进一步指出，所公开的抗凋亡效应测定不包括任何含有下列成分的对照样品(i)没有rIL-15存在下的可溶性IL-15Rce-Fc片段或(ii)不具有任何Fc片段的可溶性IL-15Rce。因此所公开的抗凋亡效应不能直接归因于所用化合物的IL-15Ra部分。另外，Giron-Michel等人的出版物不包含IL-15Ra的sushi结构域的任何线索(也不包含该现有技术中所用的可溶性IL-15Ra形式中不存在的铰链区的线索)，也不包含IL-15jS/7信号通路的线索。本发明首次描述了对IL-15生物作用的诱导和/或刺激、IL-15|SAy信号通路的特异性触发以及NK和/或T细胞增殖的诱导和/或刺激的必要和尤其有利的结构单元。因此本发明代表对现有技术的技术贡献，其能够实现先前未达到的生物和医药应用。因此，本发明人相信，当在先验的基础上分析时，Giron-Michel等人的出版物没有向本领域技术人员教导请求保护的本发明，也没有引导技术人员至请求保护的本发明。发明概述本发明涉及IL-15R/3/7信号通路以及诸如NK和/或T细胞的IL-15R/3Ay阳性细胞的活化和/或增殖的诱导和/或刺激和/或凋亡的防止。本发明证明IL-15Ra胞外区能够通过IL-15Rj8Ay信号通路作为IL-15生物作用的激动剂起作用。本发明特别证明IL-15Ro;胞外区能够刺激和/或诱导诸如NK和/或T细胞的IL-15R/3/7阳性细胞的增殖和/或活化，和/或防止凋亡。本发明证明包含在该IL-15Ra胞外区中赋予这样的激动剂作用所需的最小结构单元是IL-15Ra胞外区的sushi结构域。本发明还证明该IL-15Ra胞外区的铰链区和尾区显著增加该激动剂作用的效率。本发明还提供这样的化合物，其生物活性与野生型IL-15相比显示30至150倍的增加，并且其甚至比IL-15与可溶性IL-15Rasushi结构域的简单締合更有效。本发明涉及详细描述部分所描述的目标，并且更具体地涉及所附的权利要求中所定义的那些目标。附图的简要说明图1.各种可溶性IL-15Ra蛋白对IL-15的结合亲合力.与增加浓度的rIL-15(3.1nM、6.2nM、12.5nM、25nM、50nM和100nM)结合(締合和离解相)以固定(j)sIL-15Ra-IL曙2、(5)sIL國15Ra國sushi誦IL國2或(C)IL-15Ra-sushi的SPR传感图。(D):用与TF-1细胞结合的放射性石舆化的rIL-15(200pM)进行的sIL-15Ra画sushi()、sIL-15Ra-IL-2(令)或sIL-15Ra-sushi-IL-2(A)的竟争研究。与增加浓度的rIL-15(1nM、2.5nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM)结合(締合和离解相)以固定(E)sIL-15Ra-Sushi+的SPR传感图图2.通过IL-15RP对IL-15诱导的增殖的影响。通过并入[311]-胸苷评价Mo-7细胞的增殖。用增加浓度的人rIL-15(j)或人rlL-2(5)，不在(參)或在(O)固定浓度(IOnM)的sIL-15Ra-sushi存在下培养细胞。(C):不用(參)或用增加浓度的sIL-15Ra-sushi()，在1nMrIL-15存在下培养细胞。(￡>):用增加浓度的rIL-15(*)、IL-15和sIL-15Ra-sushi的等摩尔混合物(O)、RLI(A)或ILR融合蛋白(A)培养细胞。用于表达RLI和ILR融合蛋白的分子构建体。IL-15Rasp:人IL-15Ra信号肽，pplsp:牛泌乳素前体信号肽。(F):融合蛋白的三维模型结构。图3.通过IL-15Rp/y对IL-15诱导的预防凋亡的影响。使用流式细胞计数法通过膜联蛋白V细胞表面表达评价凋亡。实柱状图(Ja)表示实验开始时膜联蛋白V在Mo-7上染色。不用046)或用固定浓度的人rlL-15(500pM)(Jc),不在(实柱状图)或在(实线)sIL-15Ra-sushi(10nM)的存在下将细胞培养48小时。(5):不在外源细胞因子(參)的存在下或在rIL-15C500pM)C〇)、sIL-15Ra-sushi(10nM)(□)、sIL画15Ra國sushi(10nM)力。rIL-15(500pM)(O)或RLI(500pM)(A)的存在下膜联蛋白V在Mo-7细胞上表达的动力学。(C):用增加浓度的rIL-15，不在(O)或在(O)固定浓度(IOnM)的sIL-15Ra-sushi存在下培养Mo-7细胞，或用增加浓度的RLI(A)培养Mo-7细胞。图4.sIL-15Ra-sushi对结合到IL-15Rp/y上的IL-15的激动剂作用。RLI的结合与内在化，(A):不在(B)或在(口)10nMsIL-15Ra-sushi的存在下1251标记的rIL-15与Mo7细胞的结合。(万)1251标记的RLI融合蛋白的结合。插入的图中显示Scatchard图。(C):1251标记的RLI融合蛋白的内在化(500pM)。图5.通过IL-15Ra/p/y受体对IL-15诱导的细胞增殖和凋亡的影响。用增加浓度的rIL-15(*)、rIL-15和sIL-15Ra-sushi的等摩尔混合物(O)、RLIO)或ILR融合蛋白(A)培养的Kit225(A)和TF-lp(B)细胞对pH]-胸苷的并入。(C):实验开始时(Oz)、不用(C6)或用固定浓度的人rIL-15(500pM)(C。，不在(实柱状图)或在(实线)sIL-15Ra-sushi蛋白(IOnM)的存在下、或在10pM的RLI(OZ)存在下培养48小时后膜联蛋白V对TF-ip的染色。(Z)):不在外源细胞因子(O)或在rIL-15(10pM)(參)、sIL-15Ra-sushi(10nM)(□)、sIL曙15Ra儒hi(10nM)加rIL-15(10pM)(O)或RLI融合蛋白(10pM)(A)存在下的染色动力学。用增加浓度的rIL-15，不在(參)或在(O)固定浓度(10nM)的sIL-15Ra-sushi存在下培养48小时后的染色，或用增加浓度的RLI融合蛋白(A)培养48小时后的染色。图6.sIL-15Ra-sushi和RLI对TF-ip细胞的结合与内在化.sIL-15Ra-sushi对IL-15结合的影响。(A):1251标记的rIL-15不在(B)或在(口)10nMsIL-lSRa-sushi存在下的饱和结合曲线。(S):增加浓度的sIL-15Ra-sushi对固定浓度的放射性碘化的rIL-15(200pM)的结合的影响。(C):1251标记的sIL-15Ra-sushi在lnMrlL-15存在下的饱和结合曲线以及(D)后续的内在化。(五)1251标记的RLI的饱和结合曲线以及("后续的内在化。图7:提出的sIL-15Ra与sIL-15Ra-sushi的差异影响的才莫型。(A)在IL-15Ra/p/Y受体的情况下，sIL-15Ra与膜IL-15Ra竟争结合IL-15。(5)在IL-15RpA/受体的情况下，sIL-15Ra-sushi与IL-15形成复合物，其比单独的IL-15更有效地活化IL-15Rp/y复合物。RLI或ILR融合蛋白放大该激动剂作用。(C)在IL-15Ra/p/丫受体的情况下，sIL-15Ra-sushi与膜IL-15Ra的竟争效率较低，或者其与膜IL-15Ra竟争，并且sIL-15Ra-sushi与IL-15的复合物与在(5)中类似，活化过量的IL-15R(3/y复合物。图8-42显示氨基酸和核酸序列，其序列号列于表4(表4位于参考文献之后，权利要求之前)。图8:人野生型IL-15RacDNA(SEQIDN0:1)。图9:人野生型IL-15Ra的CDS(SEQIDNO:2)，以及人野生型IL-15Ra蛋白(SEQIDNO:3)。图10:人野生型IL-15Ra的信号肽的CDS和氨基酸序列(SEQIDNO:4和NO:5),以及成熟肽的CDS和氨基酸序列(SEQIDNO:6和NO:7)。图ll:人野生型IL-15Ra的外显子1至5的核酸序列(SEQIDNO:8-12)。图12:人野生型IL-15Ra的sushi结构域的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:13-14),以及包含sushi结构域的人野生型IL-15Ra片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:15和NO:16)。图13:包含sushi结构域的人野生型IL-15Ra片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:17和NO:18)。图14:人野生型IL-15Ra的铰链区以及该铰链区的片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:19和NO:20)。图15:包含sushi结构域的人野生型IL-15Ra片段和铰链区的片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:21-24)。图16:包含sushi结构域的人野生型IL-15Ra片段和铰链区的片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:25-28)。图17:包含sushi结构域的人野生型IL-15Ra片段和铰链区的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:29-30)。图18:人野生型IL-15Ra的富含糖基化位点的区域的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:31-32)。图19:人野生型IL-15Ra富含糖基化位点的区域的外显子3编码的部分的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:33-34)，以及包含sushi结构域、铰链区以及富含糖基化位点的区域的外显子3编码的部分的IL-15Ra片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:35-36)。图20:人野生型IL-15Ra的可溶性胞外区片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:37-38)。图21:人野生型IL-15Ra的可溶性胞外区的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:39-40)。图22:人IL-15Ra可溶性的、删除信号肽的胞外结构域片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:41-42)。图23:人IL-15Ra可溶性的、删除信号肽的胞外结构域的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:43-44)。图24:人野生型IL-15的核酸序列(SEQIDNO:45)。图25:人野生型IL-15前体蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:46),人野生型成熟IL-15的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:47-48)。图26:两种柔性连接区的核酸和氨基酸序列(连接区20SEQIDNO:49-50;连接区26SEQIDNO:51-52)。图27:Flag标签和Xa结合位点的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:53-56),牛泌乳素前体信号肽的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:57-58),以及IL-15R的核酸序列和泌乳素前体Kozak序列。图28:RLI的核酸和氨基酸序列(本发明的融合蛋白；SEQIDNO:59-60)。RLI融合蛋白=IL-15Ra的信号肽+Flag标签和Xa结合位点+it+sushi+i+rd+11个外显子3编码的aa+连接区26+人野生型成熟IL-15。图29:ILR的核酸和氨基酸序列(本发明的融合蛋白；SEQIDNO:61-62)。ILR融合蛋白=牛泌乳素前体信号肽+Flag标签和Xa结合位点+人野生型成熟IL-15+连接区26+it+sushi+i+rd+11个外显子3编码的氨基酸。图30:人野生型IL-2的核酸序列(SEQIDNO:63)。图31:人野生型成熟IL-2的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:64-65),以及用于将IL-2连接于IL-15Ra的含sushi片段的连接区的才亥酸和氨基酸序列。图32:连接有IL-2的IL-15Ra的含sushi片段的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:66-67)。图33:连接有IL-2的IL-15Ra的含sushi片段(胞外IL-15Ra片段)的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:68-69)。图34:小家鼠IL-15Ra的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:72-73)。图35:小家鼠IL-15Ra胞外区的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:74)、sushi结构域的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:75)、铰链区的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:76)以及尾区的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:77).图36:黑猩猩IL-15Ra的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:78-79)。图37:黑猩猩IL-15Ra胞外区的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:80)、sushi结构域的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:81)、铰链区的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:82)以及尾区的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:83)。图38:褐家鼠IL-15Ra的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:84-85)。图39:褐家鼠IL-15Ra胞外区的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:86)、sushi结构域的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:87)、铰链区的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:88)以及尾区的核酸和氨基酸序列(SEQIDNO:89)。图40:小家鼠IL-15Ra的外显子3的核酸序列(SEQIDNO:90)、黑猩猩IL-15Ra的外显子3的核酸序列(SEQIDNO:91)以及褐家鼠IL-15Ra的外显子3的核酸序列(SEQIDNO:92)。图41:人IL-15Ra的外显子3编码部分的氨基酸序列(SEQIDNO:93)、小家鼠IL-15Ra的外显子3编码部分的氨基酸序列(SEQIDNO:94)、黑猩猩IL-15Ro;的外显子3编码部分的氨基酸序列(SEQIDNO:95)以及褐家鼠IL-15Ra的外显子3编码部分的氨基酸序列(SEQIDNO:96)。图42:人IL-15Ra的外显子2编码部分的氨基酸序列(SEQIDNO:24)、小家鼠IL-15Ra的外显子2编码部分的氨基酸序列(SEQIDNO:97)、黑猩猩IL-15Ra的外显子2编码部分的氨基酸序列(SEQIDNO:98)以及褐家鼠IL-15Ra的外显子2编码部分的氨基酸序列(SEQIDNO:99)。发明的详细描述本发明涉及IL-15Ra,并涉及包含至少一个IL-15Rasushi结构i或的IL-15Rce片段。本发明涉及这样的产物，其能够用于刺激IL-15R/5Ay信号通路，/人而i秀导和/或刺激诸如NK和/或T细胞的IL-15Rj8/7阳性细胞的活化^和/或增殖和/或预防所述细^>凋亡。本发明涉及分离的含sushi多肽，其含有包括在IL-15Ra的胞外区的sushi结构域，即本发明涉及由IL-15Ra胞外区组成的分离的片段，并涉及保留了sushi结构域的所述片段的亚片段。本发明的含sushi多肽能够共价连接于或未共价连接于至少一个IL-15Ri8Ay结合体。本发明更具体地涉及包含至少这样的与至少一个IL-15Ri3Ay结合体直接或间接共价连接的含sushi多肽的共价连接的化合物。这样的化合物与野生型IL-15相比，其生物活性能够增加30至150倍，并且比IL-15与可溶性IL-15Rasushi结构域的自由締合更有凌文。IL-15Ri8/7结合体除了所述至少一个含sushi多肽，本发明的所述共价连接的化合物包含至少一个IL-15R]8Ay结合体。所述IL-15Rj3Ay结合体优选为IL-15或IL-15片段、模拟物或;敫动剂，其中所述IL-15片段、模拟物或激动剂具有不显著低于天然IL-15的与IL-15R)8Ay结合的亲合力。所述IL-15能够是任何IL-15,如人IL-15或非人哺乳动物IL-15或非哺乳动物IL-15。示例性的非人哺乳动物IL-15为猴IL-15或鼠IL-15(如登录号为NM—008357的小鼠IL隱15;登录号为NM—013129的大鼠IL誦15)或兔IL-15(如登录号DQ157152),绵羊IL-15(如登录号NM—001009734)或猪IL-15(如登录号N1VL211390)。示例性的非哺乳动物IL-15为鸡(如登录号NM—204571)。更优选地，所述IL-15是人IL-15。最优选地，所述人IL-15的氨基酸序列是序列SEQIDNO:48。IL-15不与IL-2Ra结合。考虑到本发明所预期的生物和医药用途，所述IL-15片段、模拟物或激动剂优选不与IL-2Ra结合。术语"激动剂"和"模拟物"在此具有其在本领域的普通含义。当化合物诱导的生物响应的水平与天然IL-15诱导的水平类似或比天然IL-15诱导的水平高，则该化合物被称为IL-15激动剂。优选的激动剂是那些诱导甚至更高水平的生物响应的激动剂(超激动剂)。IL-15激动剂通常具有与IL-15Ra和/或IL-15R/3Ay结合的亲合力，该亲合力与天然IL-15的亲合力至少没有显著不同，并且优选显著高于天然IL-15的亲合力。IL-15的模拟物(或mimetope)是指能够模拟IL-15的生物作用的任何化合物。在本发明中，优选的IL-15模拟物或激动剂是那些能够通过IL-15R^Ay信号通路模拟IL-15的生物作用的模拟物或激动剂。因此这样的优选IL-15模拟物具有与IL-15j3复合物结合、并从而通过所述IL-15R0Ay复合物诱导和/或刺激生物信号转导的能力。本发明优选的IL-15模拟物或激动剂具有与IL-15R/3Ay结合的亲合力，该亲合力与天然IL-15的亲合力至少没有显著不同，并且优选;也显著高于天然IL-15的亲合力。适当的激动剂或模拟物已被描述于例如INSERM于2005年2月10日提交的国际PCT申请PCT/EP2005/002367中。含sushi多肽所述至少一个含sushi多肽的氨基酸序列是IL-15Ra胞外区的氨基酸序列(所述IL-15Ra的胞外区包含IL-15Rasushi结构i或)，或是IL-15Ra胞外区片段的氨基酸序列，其中所述片段保留了所述IL-15Ra胞外区的sushi结构域，其中所述sushi结构域定义为开始于第一外显子2编码的半胱氨酸残基(C1)，并终止于第四外显子2编码的半胱氨酸残基(C4)，残基Cl和C4均包括在sushi结构域中，或是保留了所述sushi结构域的全部四个半胱氨酸残基(C1、C2、C3和C4)的变体氨基酸序列。所述定义的可选择定义是，其开始于所述信号肽之后的第一半胱氨酸残基(C1),并且终止于所述信号肽之后的第四半胱氨酸残基(C4)。所述变体氨基酸序列可包含IL-15Rasushi结构域的保守变体序列。这样的IL-15Rasushi结构域的保守变体序列通过氨基酸的至少一次删除和/或至少一次取代和/或至少一次添加书f生自母体sushi结构i或的序列，但保留了下列特征中至少一个特征的能力i.增加IL-15对IL-15R/3的亲合力，ii.诱导和/或刺激对/5/7阳性细胞的抗凋亡作用，并且更具体地，对诸如天然NK和/或T细胞的/3Ay阳性、a阴性细月包的抗凋亡作用，iii.通过IL-15R/3Ay信号通路增强IL-15生物作用的效率，即，诱导和/或刺激/3/y阳性细胞的增殖和/或活化，并且更具体地，诸如天然或休眠NK和/或T细胞的/3Ay阳性、a阴性细胞的增殖和/或活化。优选地，所述保守变体保留了上述iii中所述的特征。测定上述特征的适当的细胞系为IL-15R/3Ay-阳性IL-15Ra-阴性细胞。示例性的这种细胞系为细胞系32D，其能够被/3和7链(如人/3和人7链)转染。或者，能够从生物样品，例如血液样品中纯化天然或休眠NK和/或T细胞。优选地，在IL-15Ra胞外区或IL-15Ra胞外区片段的该序列的全长上，所述变体氨基酸序列与这样的IL-15Ra胞外区或这样的IL-15Ra胞外区片段的氨基酸序列具有至少85%的同一性。更优选地，该序列同一性百分数为至少90%,更优选为至少92%，最优选为至少95%，如至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。这样的变体氨基酸序列特别包含天然存在于动物物种中的IL-15Ra多态性，以及本领域普通技术人员能够产生的保守变体。IL-15Ra:IL-15Ra的外显子1编码IL-15Ra的信号肽。IL-15Ra的外显子2编码IL-15Ra的sushi结构域。外显子3的5，末端部分编码IL-15Ra的被称为铰链区的区域。外显子3以及其它胞外外显子(即外显子4、外显子5和人IL-15ra以及大部分物种的外显子6的5，部分)的其余部分编码也称为IL-15Ra尾区的富含糖基化位点的区域。其余IL-15Ra外显子(即外显子6的3'部分，以及人IL-15m以及大多数物种的外显子7)编码IL-15Ro;的跨膜和胞质内区域。考虑到本发明的医药应用，所述IL-15Ra优选为人IL-15Ra是有利的。所述人IL-15Ra的氨基酸序列最优选为人IL-15Ra序列SEQIDNO:3(267个氨基酸)的序列。人IL-15RaSEQIDNO:3的胞外区具有氨基酸序列SEQIDNO:40(SEQIDNO:3的1..209)。SEQIDNO:40的删除信号肽的形式净皮列为SEQIDNO:44(SEQIDNO:3的31..209)。IL-15Ra的某些人等位基因可在SEQIDNO:3的位置182处具有Thr氨基酸(氨基酸t,由act、acc、aca或acg编码)，而不是Asn氨基酸(氨基酸n，由aat或aac编码)。这样的变体是天然存在的，并且是功能性的。在本申请中，人IL-15Ra的这种等位天然存在的变体意为等^f介于参考人IL-15Ra序列的SEQIDNO:3(氨基酸序列)和SEQIDNO:1或NO:2(cDNA和CDS序列)，并且等价于直接由其衍生的参考人IL-15Ra序列，即SEQIDNO:40或NO:44的胞外区序歹'J(氨基酸序列)以及SEQIDNO:39和NO:43的胞外区序列(CDS序列)。人IL-15Rce的SEQIDNO:3的7个外显子的位置如下列表1所述。在这方面，请注意，如下列表l所述，外显子1的位置是1..170，并且外显子2的位置是171..365，而不是登录号U31628的序列中所声称的分别为1..171和172..365。表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>人IL-15Ra的SEQIDNO:3的不同区域和部分的位置如下列表2所示。表2:人IL-15RaSEQIDNO:1中的CDS位信号肽83..172IL-15Ra蛋白173..883信号肽83..172外显子2编码的部分，其含有sushi结构域(it-sushi-i)173..364人IL-15Ra蛋白的部分Sushi结构i或(Cl至C4)铰链区(irdpalvhqrpapp)跨膜部分胞质内部分179..361362..403710..766767..883SEQIDNO:3中的氨基酸位置1..3031..2671..3031..9433..9394..107108..209210..228229..267富含糖基化位点的区域404..709在本申请中，置于第一个数字和第二个之间的双点符号(《..)描述与从"第一个数字"的位置延伸至"第二个数字"的位置的序列相同的分离序列。在本申请中，当序列由"开始"位置和"终止"位置定义时，这些开始和终止位置意为被包括在所述序列中。对于某些生物应用，例如初步检测、研究、开发、化合物或细月包筛选、临床前和临床研究(包括与药理学、毒理学、药代动力学或生物学性质相关的测试以及"风险-效益评估"和安全相关测试)，也能够使用非人哺乳动物IL-15Ra。优选的非人哺乳动物IL-15Ra特别包括猴IL-15Ra(如黑猩猩IL-15Ra)或鼠IL-15Ra(如小鼠IL-15Ra、大鼠IL-15Ra)或兔IL-15Ra或猪IL-15Ra。这种非人哺乳动物IL-15Ra的示例性IL-15Ra氨基酸序列是那些由下列来源的核酸序列编码的氨基酸序列登录号NM一008358(小家鼠IL-15Ra:核酸序列SEQIDNO:72,氨基酸序列SEQIDNO:73);登录号XM—521684(黑猩猩IL-15Ra:核酸序列SEQIDNO:78,氨基酸序列SEQIDNO:79);或者登录号XM—577598(褐家鼠IL-15Ra:核酸序列SEQIDNO:84，氨基酸序列SEQIDNO:85)。示例性的人IL-15Ra外显子2和外显子3的位置和序列请参见图40、41、42。IL-15Ra的胞外区IL-15Ra的胞外区通常定义为IL-15Ra序列由其第一N-末端氨基酸延伸至尾区(或富含糖基化位点的区域)的最后氨基酸的区域。如下文的详细描述，技术人员能够通过例如软件的帮助确定IL-15Ra序列的尾区。所述IL-15Ra的胞外区为人IL-15Ra胞外区或非人哺乳动物IL-15Ra胞外区。在人胞外IL-15Ra区域的氨基酸序列中，优选胞外IL-15Ra区域SEQIDNO:40的氨基酸序列。胞外IL-15Ra区域SEQIDNO:40的氨基酸序列是由外显子1-5以及人IL-15Ra的外显子6的小5，部分编码的。人IL-15Ra的外显子1(SEQIDNO:8)编码IL-15Ra信号肽(核酸序列SEQIDNO:4;氨基酸序列SEQIDNO:5)。外显子2(SEQIDNO:9)包含编码人IL-15Rasushi结构域的序列。外显子2的最后的3，密码子编码铰链区的第一氨基酸。外显子3的5'部分(外显子3的SEQIDNO:10)编码人IL-15Ra的铰链区。外显子3的其余3，部分，加上外显子4(SEQIDNO:11)、外显子5(SEQIDNO:12)以及外显子6的5，部分(SEQIDNO:l的699..709)编码富含糖基化位点的区域(也称为尾区)。序列SEQIDNO:44是IL-15Ra胞外区SEQIDNO:40删除信号肽的形式。在本发明中可使用信号肽，但这是任选的。这样的信号肽能够是IL-15Ra信号肽或者另一蛋白的信号肽。因此，IL-15Ra胞外区的删除信号肽的形式(例如SEQIDNO:44)直接等同于全部IL15Ra胞外序歹'J(例如SEQIDNO:40)。示例性的非人哺乳动物IL-15Rcd包外区具有下列序列SEQIDNO:74(小家鼠IL-15Ra的1..204)、SEQIDNO:80(黑猩猩IL-15Ra的1..286)、SEQIDNO:86(褐家鼠IL-15Rce的1..182)。Sushi结构i或定义所述至少一个含sushi多肽的IL-15Ra或其片段的胞外区含有IL-15Rasushi结构域。IL-15Ra的胞外区含有^皮称为sushi结构域的结构域(Weietal.2001，J.Immunol.167:277-282)。IL-15Ra的sushi结构域具有/5折叠构象。其是由IL-15Ra的外显子2编码的。其开始于第一外显子2编码的半胱氨酸残基(C1),并终止于第四外显子2编码的半胱氨酸残基(C4)。当考虑标准N-末端至C-末端方向的IL-15Ra蛋白序列时，IL-15Ra的sushi结构域能够被定义为开始于信号肽之后的第一半胱氨酸残基(Cl)，并终止于信号肽之后的第四半胱氨酸残基(C4)。残基Cl和C4均包括在sushi序列中。因此，当在由其信号肽序列删除的IL-15Ra序列(例如序列SEQIDNO:44)上识别sushi结构域时，然后将sushi结构域定义为开始于第一半胱氨酸残基(开始于蛋白的N-末端)，并终止于该IL-15Rce序列的第四半胱氨酸残基。还能够通过使用例如下列软件的适当软件分析IL-15Ra的氨基酸序列而确定IL-15Rcesushi结构域Prosite(http:〃us.expasy.org/prosite/),InterProScan(http:〃www.ebi.ac.uk/InterProScan/)，SMART(http:〃elm.eu,org/)。所述sushi结构域的氨基酸序列能够是人IL-15Rasushi结构域或非人哺乳动物sushi结构域的氨基酸序列。在人IL-15Rasushi结构域的氨基酸序列中，优选人IL-15Rasushi结构域SEQIDNO:14的氨基酸序列。例如，人IL-15Ra胞外区的所述片段的氨基酸序列能够是序列SEQIDNO:16(it+人IL-15Rasushi)或NO:18(t+人IL-15Rasushi)。示例性的非人哺乳动物IL-15Rasushi结构域为氨基酸序列SEQIDNO:75(小家鼠IL國15Ra的36..96)、SEQIDNO:81(黑猩猩IL-15Ra的13..73)或SEQIDNO:87(褐家鼠IL-15Ra的24..84)。信号肽信号肽是引导蛋白的转译后输送的较短(15-60个氨基酸长度)的肽链。某些信号肽是在输送蛋白后通过信号肽酶从蛋白中分裂的。信号肽还可被称为靶向信号或信号序列。信号肽的氨基酸序列将细胞溶质中合成的蛋白引导至特定的细胞器，例如细胞核、线粒体基质、内质网、叶绿体以及过氧化物酶体。IL-15Ra的信号肽是约29-33个氨基酸，例如30-32个氨基酸的N-末端序列。其开始于IL-15Ra的第一N-末端氨基酸残基。其通过使用例如下列软件的适当软件分析IL-15Ra的N-末端氨基酸序列而确定SIGCLEAVE(http:〃bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/sigcleave.html),InterProScan(http:〃www.ebi.ac.uk/InterProScan/)，SMART0ittp:〃elm.eu.org/)。小家鼠IL-15Ra的信号肽是32个氨基酸的N-末端氨基酸序列(参见登录号NP—032384;sig—肽1..32)。人IL-15Ra的信号肽，如SEQIDNO:5所示，是含有1个半胱氨酸残基的30个氨基酸的N-末端氨基酸序列。外显子2编码部分的片段IL-15Ra的外显子2含有sushi结构域，即本发明要求的最小结构单元。所述IL-15Ra胞外区的片段能够包含(或能够基本由下列组成)-11^151^胞外区部分，其是由所述IL-15Ra的外显子2编码的，或者-这种外显子2编码部分的片段。根据本发明，所述IL-15Ra胞外区的片段必须包含至少一个IL-15Rce结构域。因此，外显子2编码部分的片段能够是其任何片段，前提是其仍然包含sushi结构域(从残基Cl至残基C4)。例如，人胞外区SEQIDNO:40的外显子2编码部分是由位置31延伸至位置94的序列(即SEQIDNO:24)，即它是it+sushi+i。该外显子2编码部分的片段为t+sushi;it+sushi;t+sushi+i。例如，所述外显子2编码的序列能够是-人胞外IL-15Ra的外显子2编码部分，其为序列SEQIDNO:24,-黑猩猩胞外IL-15Ra的外显子2编码部分，其为序列SEQIDNO:98，-小家鼠胞外IL-15Ra的外显子2编码部分，其为序列SEQIDNO:97,-褐家鼠胞外IL-15Ra的外显子2编码部分，其为序列SEQIDNO:99。这种IL-15Ra胞外区片段的变体包括在本发明的范围内。这样的变体特别包括那些在其序列中具有保守氨基删除和/或取和/或力口成的变体。IL-15Ra胞外区片段的保守变体序列通过氨基酸的至少一次删除和/或至少一次取代和/或至少一次加成而书f生自母体IL-15Ra胞外区片段的序列，并且保留了至少一种下列特征的能力iv.增加IL-15对IL-15R/3Ay的亲合力，v.诱导和/或刺激对/3Ay-阳性细胞的抗凋亡作用，以及更具体地，对诸如天然NK和/或T细胞的/3Ay-阳性、o;-阴性细胞^的抗凋亡作用，vi.通过IL-15R/3/7信号通路增强IL-15生物作用的效率，即，诱导和/或刺激/3Ay-阳性细胞的增殖和/或活化，以及更具体地，诸如天然或休眠NK和/或T细胞的j8/，阳性、a-阴性细胞的增殖和/或活化。优选地，所述保守变体保留了上文iii.中所述的特征。至少85%同一性的氨基酸序列的变体。优选地，所述同一性百分数为至少90%，更优选为至少92%，最优选为至少95%,如至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。例如，开始于SEQIDNO:40的上述外显子2编码部分，对本领;或才支术人员来i兌4艮明显，i+sushi、i+sushi+t、i+sushi+i、it+sushi十t为保守变体，其在技术上等同于母体片段。外显子2-3编码部分的片段根据本发明的非常有利的实施方案，所述IL-15Ra胞外区片段还可包含至少一个来自由所述IL-15Ra的外显子3编码的序列的氨基酸。因此所述IL-15Rce胞外区片段可包含如下、或由下列部分组成-IL-15Ra胞外区部分，其是由所述IL-15Ra的外显子2和3编码的，或者-这种外显子2-3编码部分的片段，其保留了所述sushi结构域。人IL-15Ra的SEQIDNO:3(即人胞外区SEQIDNO:40)的外显子3是核酸序列SEQIDNO:10。SEQIDNO:3的外显子3编码部分是序列SEQIDNO:93,即SEQIDNO:3或SEQIDNO:40的95..127序列部分(即人IL-15Ra序列SEQIDNO:3或NO:40中由位置95延伸至位置127的氨基酸序列，包括位置95和127)。例如，所述外显子3编码的序列能够是-人胞外IL-15Ra的外显子3编码部分，其为序列SEQIDNO:93，画黑猩猩胞外IL國15Rce的外显子3编码部分，其为序列SEQIDNO:95，國小家鼠胞外IL画15Ra的外显子3编码部分，其为序列SEQIDNO:94，-褐家鼠胞外IL-15Ra的外显子3编码部分，其为序列SEQIDNO:96。外显子3编码部分的片段能够是仅有一个氨基酸的片段，优选为至少2个氨基酸的片段，更优选为至少3个氨基酸的片段，还更优选为至少4个氨基酸的片段，最优选为至少5个氨基酸的片段。本发明人证明，IL-15Ra或其片段的外显子3编码部分有利地增加所得化合物在IL-15R/3Ay信号传导以及IL-15RjSAy阳性细胞的增殖和活化方面的亲合力和效率。当含sushi多肽用于产生融合蛋白时，技术人员可能宁愿将外显子3氨基酸的数目限定为最佳的数目，即限定为在一方面增加亲合力和效率与另一方面增加分子大小和构象困难这两方面之间达到较好平衡的氨基酸数目。因此，技术人员可能发现将向所述IL-15Rasushi结构域中加入的外显子3编码氨基酸的数目限定为下列数目是有利的30，优选为25,更优选为20，还更优选为18,最优选为17，如17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6。因此，外显子3编码的氨基酸的最优选数目是那些由每一上述较低限与每一上述较高限的组合产生的间隔。示例性的外显子3编码部分的优选片段是源自人IL-15Ra的SEQIDNO:3(或SEQIDNO:40)的外显子3编码部分的所有片l殳，即由位置95延伸至位置127的部分，包括位置95和127(即SEQIDNO:3或NO:40的序列95..127)。因此本发明的优选化合物包含至少一个含sushi多肽，其除了所述sushi结构域之外还包含至少一个来自SEQIDNO:3的由位置95延伸至位置127(包括位置95和127)的序列的氨基酸。其最优选地包含-优选数目的这种氨基酸(即"至少2个氨基酸，更优选为至少3个氨基酸，还更优选为至少4个氨基酸，最优选为至少5个氨基酸")，或者-最优选数目的这种氨基酸(即由"至少2个氨基酸，更优选为至少3个氨基酸，还更优选为至少4个氨基酸，最优选为至少5个氨基酸"与"至多30,优选至多25,更优选至多20,还更优选至多18，最优选至多17，如17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6"产生的任意组合)。因此，所述IL-15Ra胞外区片段有利地包含IL-15Ra胞外区部分，它是由所述IL-15Rce的外显子2或其如上文所定义的保守变体编码的，并且还包含至少一个来自所述IL-15Ra的外显子3编码的序列的氨基酸更具体地，所述IL-15Ra胞外区片段能够包含(能够基本由下列部分组成)國由所述IL誦15Ra的外显子2和3编码的IL-15Ra胞外区部分，或其保守变体，或者-由所述IL-15Ra的外显子2编码的IL-15Ra胞外区部分，以及由所述IL-15Ra的外显子3编码的IL-15Rce胞外区部分的片段。还更具体地，所述IL-15Rce胞外区片段能够包含(能够基本由下列部分组成)-由所述IL-15Ra的外显子2和3编码的IL-15Ra胞外区部分，或其保守变体，或者-这样的外显子2-3编码部分的片段或这样的外显子2-3编码的变体的片段，隐含的条件是这样的片段保留了sushi结构域。上文给出的保守变体的定义为对外显子2-3编码部分的保守变体提供细节上必要的改动，即，它是衍生自母体外显子2-3编码的序列的序列，所述衍生是通过氨基酸的至少一次删除和/或至少一次取代和/或至少一次添加，并保留了至少一种下列特征的能力vii.增加IL-15对IL-15R/3Ay的亲合力，viii.诱导和/或刺激对|3/7-阳性细胞的抗凋亡作用，以及更具体地，对诸如天然NK和/或T细胞的j8Ay-阳性、a-阴性细胞的抗凋亡作用，ix.通过IL-15R/3Ay信号通^各增强IL-15生物作用的效率，即，诱导和/或刺激/3Ay-阳性细胞的增殖和/或活化，以及更具体地，诸如天然或休眠NK和/或T细胞的j3Ay-阳性、a-阴'l"生细胞的增殖和/或活化。优选地，所述保守变体保留了上文iii.中所述的特征。至少85%同一性的氨基酸序列的变体。优选地，所述同一性百分数为至少90%，更优选为至少92%,最优选为至少95%，如至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。铰链区(位于sushi结构域之后，由外显子2的3，部分和外显子3的5，部分编码，或由外显子3的5'部分编码)本发明人证明，IL-15Ra的铰链区更特别地与该信号传导效率的增加、以及该IL-15Ri8Ay-阳性细胞的增殖和活化的增加有关。因此，根据本发明的非常有利的实施方案，所述IL-15Ra胞外区片段除了所述IL-15Rasushi结构域之外，还能够包含IL-15Ra铰链区或IL-15Ra铰链区的片段。IL-15Ra铰链区被定义为开始于sushi结构域之后的第一氨基酸残基(当考虑标准N-末端至C-末端方向的IL-15Ra序列时)，并且终止于第一潜在糖基化位点之前的最后氨基酸残基的氨基酸序列。使用用于识别潜在0-糖基化位点的软件NetOGlyc(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc-3.1/)以及用于识别潜在N-糖基化位点的软件NetNGlyc(http:〃www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)确定潜在糖基化位点的位置。在人IL-15Ra中，铰链区的氨基酸序列由14个氨基酸组成，其位于该IL-15Ra的sushi结构域之后相对于所述sushi结构域的C-末端位置，即所述IL-15Ra铰链区开始于所述(C4)半胱氨酸残基之后的第一氨基酸，并终止于第14氨基酸(以标准的"从N-末端至C-末端"方向计数)。在人IL-15Ra的SEQIDNO:3(其胞外区为序列SEQIDNO:40)中，所述人IL-15Ra铰链区的氨基酸序列是序列SEQIDNO:20。其含有一个由外显子2(氨基酸i)编码的氨基酸，以及由外显子3编码的13个氨基酸。在小家鼠IL-15Ra的SEQIDNO:73中，4交链区具有序列SEQIDNO:76。在黑猩猩IL-15Ra的SEQIDNO:79中，铰链区具有序列SEQIDNO:82。在褐家鼠IL-15Ra的SEQIDNO:85中，铰链区具有序列SEQIDNO:88。因此所述至少一个含sushi多肽可包含sushi结构域SEQIDNO:75和铰链区SEQIDNO:76(小家鼠)、sushi结构域SEQIDNO:81和铰链区SEQIDNO:82(黑猩猩)或者sushi结构域SEQIDNO:87和铰链区SEQIDNO:88(褐家鼠)。有利地，所述至少一个含sushi多肽优选包含人sushi结构域SEQIDNO:14,以及人铰链区SEQIDNO:20(例如铰链区SEQIDNO:20之前的SEQIDNO:16或NO:18)。优选地，所述至少一个含sushi多肽包含，或者是，任选由其N-末端i和/或t删除的多肽SEQIDNO:30(it+sushi+hinge)。或者所述IL-15Ra胞外区片段除了sushi结构域之外能够包含铰链区片段。本文的铰链区片段意为所述铰链区的少至仅一个氨基酸的任何片段。优选地，铰链区片段包含至少2个氨基酸，更优选包含至少3个氨基酸。因此IL-15Ra铰链区片段能够是1个(如氨基酸i)、2个(如氨基酸ir)、3个(如氨基酸ird)、4个(如氨基酸irdp)、5个(如氨基酸irdpa)、6个(如氨基酸irdpa)、7个(如氨基酸irdpal)、8个(如氨基酸irdpalv)、9个(如氨基酸irdpalvh)、10个、11个、12个、13个或14个氨基酸的片段。有利地，所述至少一个含sushi多肽优选地包含人sushi结构域SEQIDNO:14，以及铰链区片段SEQIDNO:20。所述IL-15Ra铰链区片段的氨基酸序列包含、或者是i或ir或ird。含sushi多肽SEQIDNO:22、24和26包含sushi结构域SEQIDNO:14以及铰链区SEQIDNO:20的"i"片段。含sushi多肽SEQIDNO:28包含结构域SEQIDNO:14以及铰链区SEQIDNO:20的"ird"片段。所述人IL-15Rcd包外区片段基酸序列除了所述sushi结构域和铰链区之外，可更具体地包含下列氨基酸序列-已知为富含糖基化位点的区域、或者尾区的胞外IL-15Ra区域的氨基酸序列，或者-其片段。富含糖基化位点的区域，也称为尾区(由外显子3的3，部分编码，由其它胞外外显子编码)IL-15Ra的富含糖基化位点的区域是含有数个潜在糖基化位点的区域。有时它是指IL-15Ra的"尾部"区域。其开始于铰链区之后的第一氨基酸残基(当以标准的"N-末端至C-末端"方向考虑序列时)，并终止于IL-15Ra的跨膜区域之前的最后氨基酸残基。其包含数个潜在的糖基化位点。通过用诸i口TopPred(http://biowed.pasteur.fr/seqanal/interfaces/topred.html)、TMpred(http:〃www.ch.embnet.org/software/TMPRED—form.html)的适当软件分析IL-15Ra的氨基酸序列而确定跨膜结构域。人IL-15Ra尾区包含数个O-糖基化位点和一个N-糖基化位点。人IL-15Ra尾区SEQIDNO:32由所述人IL-15Ra的外显子3的3'部分、外显子4、外显子5以及外显子6的5，部分编码。示例性的非人哺乳动物IL-15Ra胞外区尾区为氨基酸序列SEQIDNO:77(小家鼠)、SEQIDNO:83(黑猩猩)或SEQIDNO:89(褐家鼠)。36本文富含糖基化位点的区域的片段或亚片段(或尾区的片段或亚片段)意为所述区域的少至仅一个氨基酸的任何片段或亚片段。优选地，所述片段或亚片段包含至少2个氨基酸，更优选地包含至少3个氨基酸。因此所述IL-15Ra胞外区片段的氨基酸序列可包含-IL-15Ra的富含糖基化位点的区域的外显子3编码部分，或者-这样的外显子3编码部分的片段。人IL-15Ra的富含糖基化位点的区域的外显子3编码部分的优选氨基酸序列是SEQIDNO:34的氨基酸序列。本发明的含sushi多肽有利地为多肽SEQIDNO:36(任选的由第一C-末端i和/或t氨基酸删除的)。如前所述，能够使用技术人员认为适当的外显子3编码部分的任何片段，如至少一个氨基酸、优选至少2个氨基酸、更优选至少3个氨基酸的任何片段。不同于外显子l、2、3的胞外外显子不同于外显子l、2、3的胞外IL-15Rce外显子编码尾区的C-末端片段。这样的部分或其片段可进一步增强本发明化合物的效率。因此所述IL-15Ra胞外区片段的氨基酸序列还可包含由外显子4和/或外显子5和/或外显子6编码的胞外IL-15Ra部分或这样的部分的任何片段。人IL-15Ra的SEQIDNO:3的外显子位置在此示于上文表1中。这样的含sushi多肽的示例性氨基酸序列为序列SEQIDNO:38,或者删除信号肽的SEQNO:42，或者删除信号肽的SEQNO:44。示例性的含sushi多肽是那些含有sushi结构域、铰链区和IL-15Ra的全尾部(如人IL-15Ra尾部SEQIDNO:32;黑猩猩IL-15Ra尾部SEQIDNO:83;小家鼠IL-15Ra尾部SEQIDNO:77;褐家鼠IL-15Ra尾部SEQIDNO:89)、以及任选的信号肽的多肽，。IL-15生物作用在生物体或细胞水平，本发明产物的特征在于其诱导和/或刺激IL-15的生物作用。其刺激那些由IL-15、IL-15模拟物和/或IL-15激动剂赋予的、诱导的或刺激的生物作用。本发明产物(即本文所述的分离形式的含sushi多肽，并且更具体地为本发明的化合物)可因此被认为是IL-15生物作用的激动剂。本发明产物的一个特別的和有利的显著特征是其能够诱导和/或刺激IL-15R/3Ay信号通路，并且更具体地通过IL-15R/3Ay信号通路刺激IL-15生物作用。因此在分子水平，本发明的产物的更具体的特征在于，其增加IL誦15R)8Ay信号通路的效率。其使得那些表达IL-15R/3Ay复合物的细胞对IL-15的作用敏感。更具体地，其使得那些表达IL-15R/3复合物^f旦不表达IL-15Ra的细胞(IL-15Rp/y+IL-15RoT细胞)对IL-15的作用敏感。本发明的某些产物不增强IL-15Rc^5Ay信号通路的效率，因此是IL-15R/3Ay特异性的。尤其是本发明的ILR融合蛋白(氨基酸序列SEQIDNO:62;以及核酸序列SEQIDNO:61)。本发明的某些其它产物能够增强IL-15Ri8/7和IL-15Ro^3信号通路的效率。尤其是本发明的RLI融合蛋白(氨基酸序列SEQIDNO:60;以及核酸序列SEQIDNO:59)。本发明还显示IL-15Ra的sushi结构域对于转呈递是关4建的。其从而具有在癌症治疗和/或减轻和/或预防领域中尤其有用的和尤其需要的医药用途，这是通过疫苗给药，例如给予包含含有至少一个IL-15Rasushi结构域的至少一个化合物的组合物。IL-15是刺激淋巴细胞(例如T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、树突细胞)增殖和/或存活、和/或其对抗肿瘤细胞的活性的细胞因子。IL-15与佐细胞和淋巴样细胞之间的交叉感知有关。它在用于发展NK细胞、NKT细胞和CD8+记忆T细胞的周围组织中是必不可少的。它是能够诱导CD34+造血细胞分化的最强大的生理学因子。所述IL-15生物作用是由IL-15和/或IL-15才莫拟物和/或IL-15;敫动剂赋予的、诱导的或刺激的生物作用。技术人员能够选择他/她认为适当的或方便评价或监控的任何IL-15生物响应。优选地，所述IL-15生物作用是由IL-15和/或IL-15才莫拟物和/或IL-15激动剂对IL-15Rj3Ay+IL-15Ra'细胞赋予的、诱导的或刺激的生物作用。通常的IL-15生物响应是IL-15每文感性细胞的增殖和/或活化。IL-15每文感性细胞的实例为T细胞、CD8+T细月包、NK细J包、树突细胞，加入IL-15和/或IL-15才莫拟物和/或IL-15激动剂会i秀导和/或刺激其增殖，和/或加入IL-15和/或IL-15模拟物和/或IL-15激动剂会诱导和/或刺激其活化(如诱导抗肿瘤活性)。这样的细胞能够例如采集自哺乳动物有机体。IL-15敏感性细胞的其它实例包括已知的细胞系，例如CTL-L2小鼠细胞毒性T淋巴瘤细胞系(ATCC登录号TIB-214)或TFl-(3细胞。TF1-Z细胞可通过用/3链转染TF-1细胞而得到。TF-1细胞得自美国典型培养物保藏中心ATCC;P.O.Box1549;Manassas,VA20108;U.S.A.;c/http:〃www.lgcpromochem.com/atcc/，ATCC登录号CRL-2003。然后能够使用IL-2R/3重组逆转录病毒感染TF-1细胞以便在含有G418的培养基中选择后产生TF-1卩。优选地，所述IL-15敏感性细胞为IL-15Rj3+IL-15R"-细胞。IL-15R/5/7+IL-15R&细胞的实例包括人Mo-7细胞系或休眠NK和/或T细月包。休眠NK和/或T细胞对技术人员是可得的。它们能够例如通过纯化诸如血液样品的细胞样品而得到。休眠NK和T细胞能够从健康成年供者的血液中分离，如下将全血进行高速离心以得到白细胞层。将该白细胞层在密度梯度(Histopaque,Sigma)上离心以得到外周血淋巴细胞。然后使用NK细胞阴性分离试剂盒(Dynal,BiotechASA,Oslo,Norway)将休眠NK细胞从外周血淋巴细胞中分离。或者，使用T细胞阴性分离试剂盒(Dynal,BiotechASA,Oslo,Norway)将休眠T细胞从外周血淋巴细胞中分离。IL-15R/3/7+IL-15R(/细胞的其它实例包括IL-15Ra-细胞，其是由IL-15R/3Ay转化或转染的，优选是由人IL-15R/3Ay转化或转染的。例如，鼠32D细胞系(ATCCCRL-11346)能够被j3和7链转染，优选被人/3和7链转染。j8链(即IL-15R/3链，也指IL-2R/3链)是技术人员已知的和可得到的。在/3链中，优选人]3链。使用才交正读码聚合酶Pfu(Stratag^ien。600390)和作为同义引物的5，GAGAGACTGGATGGACCC3，(SEQIDNO:70)、以及作为反义引物的5，AAGAAACTAACTCTTAAAGAGGC3，(SEQIDNO:71)，按照人IL-2R/3序列(NCBI登录号K03122),通过RT-PCR可由HuT102(ATCCTIB-162)的RNA得到/3链模板。使用ZeroBluntPCR克隆试剂盒(InVitrogen,目录号K2700-20)或TOPOXLPCR克隆试剂盒(InVitrogen，目录号K4750-10)将PCR产物有效地克隆。然后将用于IL-2R/3基因的cDNA亚克隆至泛向逆转录病毒表达系统(BDBiosciencesClontechn。631512)的pLXRN逆转录病毒表达载体的多克隆位点，并如试剂盒中所述转染至GP2-293细胞以产生重组逆转录病毒。7链(即IL-15R7链，也指IL-2R/y链)是技术人员已知的并可得的。在7链中，优选人7链。寸吏用才交正读码聚合酶Pfu和作为同义引物的5，GAAGAGCAAGCGCCATGTTG3，(SEQIDNO:100)和作为反义引物的5，TCAGGTTTCAGGCTTTAGGG3，(SEQIDNO:101)，按照人白细胞介素-2受体7序列(NCBI登录号D11086),通过RT-PCR可由TF1(ATCCCRL2003)或HuT102(ATCCTIB162)的RNA得到下链模板。使用ZeroBluntPCR克隆试剂盒或TOPOXLPCR克隆试剂盒将PCR产物有效地克隆。然后将用于IL-2R7基因的cDNA亚克隆至pcDNA3.1/HYGRO(InVitrogen)以产生pcDNAIL-2R7/HYGRO质粒。IL-2R/3重组逆转录病毒能够用于感染32D细胞以便在含有G418的培养基中选择后产生32DP。然后能够通过电穿孔技术将pcDNAIL-2R7/HYGRO质粒转染至32Dp细胞，以便在含有潮霉素的培养基中选择后产生32DPy。作为选择，技术人员可选择评价或监控信号通路中更下游的IL-15生物响应，例如酪氨酸激酶(如Jak-1/Jak-3;Lck;Syk)的活化、MAP激酶的活化或核转运事件(如磷酸化Stat-3和/或Stat-5的转运)。然后所述IL15生物响应可以是非细胞响应。另外的元件(信号肽、分子标签、蛋白水解位点等等)本发明化合物可包含信号肽。该信号肽能够直接或间接与所述至少一个含sushi多肽连接或与所述至少一个IL-15Rj3Ay结合体连接。所述信号肽能够与所述化合物共价连接。信号肽有助于从细胞分泌蛋白。该信号肽可以例如是直接或间接与所述片段连接的IL-15Ra的信号肽，例如人IL-15Ra的信号肽(如人IL-15Ra的信号肽，即序列SEQIDNO:5)，或者是直接或间接与所述片段连接的另一蛋白的信号肽(例如牛泌乳素前体的信号肽SEQIDNO:58)。示例性的信号肽为國人野生型IL-15Ra的前导序列(SEQIDNO:4)编码的肽，即人野生型IL-15Ro;的最初30个N-末端氨基酸(SEQIDNO:5)，或者-牛泌乳素前体的前导序列(SEQIDNO:57)编码的肽，即牛泌乳素前体的最初31个N-末端氨基酸(SEQIDNO:58)。也可使用技术人员认为合适的其它信号肽。此外，能够改变IL-15前导序列中的某些核苷酸而不改变氨基酸序列。此外，可进行不影响序列作为信号肽的能力的氨基酸变化。本发明的含sushi多肽可与衍生该含sushi多肽的IL-15Ra的信号肽直接连接。然而这种含sushi多肽可以-与这样的"天然"信号肽间接连接，或画与不来自衍生所述含sushi多肽的IL-15Ra的信号肽直接或间接连接。本发明化合物还可包含至少一个分子标签和/或至少一个蛋白水解位点。例如，分子标签和/或蛋白水解位点能够位于信号肽和sushi结构域之间，或者信号肽和IL-15R/5Ay结合体之间。所述分子标签和/或蛋白水解位点可与所述至少一个含sushi多肽或与所述IL-15R/3Ay结合体直接或间接连接。分子标签的实例特别包括FLAG⑧标签。蛋白水解位点的实例特别包括Xa结合位点。FLAG⑧(注册商标)八肽(Hoppetal"Bio/Technology6:1204，1988)不改变融合蛋白的生物活性，是高度抗原的，并提供通过特异性单克隆抗体而可逆结合的表位，这能够实现被表达融合蛋白的快速检测和轻易的纯化。FLAG⑧序列还可被牛粘膜肠激酶在紧随AspLys对之后的残基处特异性裂解。覆有该肽的融合蛋白还可抵抗大肠杆菌中的细胞内降解。已沉淀了与FLAG⑧序列结合的鼠单克隆抗体，其ATCC登录号为HB9259。使用该抗体纯化包含FLAG⑧序列的融合蛋白的方法如第5，011，912号美国专利所述。编码Flag表位和因子Xa结合位点的序列的实例包括SEQIDNO:53和NO:55(分别为氨基酸序列SEQIDNO:54和NO:56)。氨基酸在本发明的上下文中，"氨基酸残基"意为本领域技术人员已知的任何氨基酸残基(参见如Sewald"a/.,2002(42);IUPAC命名法，http:〃www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/)。其包括天然存在的氨基酸(包括例如，使用三字母编码，Ala、bAla、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val)、以及罕见的和/或合成的氨基酸及其书亍生物(包括例如Aad、Abu、Acp、Ahe、Aib、Apm、Dbu、Des、Dpm、Hyl、MeLys、MeVal、Nva、HAO、NCap、Abu、Aib、MeXaa等等(参见如(Mtiller"a/"1993;Aurora"a/"1998;Obrecht"a/.,1999;MaisonWa/.,2001;FormaggioWa/.,2003;Nowick"a/.，2003;.(43-竭。所述氨基酸残基或其衍生物能够是其任何异构体，尤其是任<可手性异构体，如L-或D-亚型。这里的氨基酸衍生物意为本领域已知的任何氨基酸衍生物(参见^口Sewald"a/.,2002(42);IUPAC命名法，http:〃www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/)。例如，氨基酸衍生物包括可由具有诸如烷基侧链的另外侧链和/或杂原子取代的天然氨基酸衍生的残基。氨基酸衍生物的其它实例包括带有化学修饰的氨基酸，如发现于模拟肽或肽模拟物中的氨基酸，所述模拟肽或肽模拟物是含有非肽结构要素、能够模拟或对抗天然母体肽的生物作用的化合物。肽模拟物通常不再具有典型的肽特征，如可被酶裂解的肽4走。优选地，所述氨基酸属于非必需氨基酸类。优选的非必需氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸。通过选择那些以较低量存在于待给药的患者中的氨基酸可精确选择适当的氨基酸。能够以患者中所述氨基酸水平的函数确定剂量和给药方案。优选的剂量和给药方案是那些旨在将患者的氨基酸水平增加至正常标准水平的剂量和给药方案。将所述至少一个含sushi多肽与所述至少一个IL-15RjgAy结合体连接本发明所述至少一个含sushi多肽可直接连接于所述至少一个IL-15R/3Ay结合体。或者，本发明所述至少一个含sushi多肽以及所述至少一个IL-15R/3Ay结合体蛋白可由"连接区"氨基酸序列分隔，所述"连接区"氨基酸序列的长度足以确保所述蛋白形成适当的二级和三级结构。优选地，所述连接区是肽连接区，其包括至少一个、但少于30个氨基酸，如2至30个氨基酸的肽连接区、优选10至30个氨基酸的肽连接区、更优选15至30个氨基酸的肽连接区、还更优选19至27个氨基酸的肽连接区、最优选20至26个氨基酸的肽连接区。优选的连接区是那些允许化合物采取适当构象(即通过IL-15RjSA/信号通路而允许适当信号传导活性的构象)的连接区。适当连接区的实例包括柔性连接区。最合适的连接区序列(1)会采取柔性延伸的构象，(2)不会显示与融合蛋白的功能性结构域相互作用形成有序二级结构的倾向，并且(3)会具有最小的疏水性或带电特性，所述疏水性或带电特性会促进与功能性蛋白结构域相互作用。柔性蛋白区域中通常的表面氨基酸包括Gly、Asn和Ser(即G、N或S)。事实上，可预期含有Gly、Asn和Ser的氨基酸序列的任何变换均满足上述连接区序列的标准。其它近中性氨基酸，例如Thr、Ala、Leu、Gln(即T、A、L、Q)也可用于连接区序列。可改变连接区序列的长度而不显著影响融合蛋白的生物活性。示例性的连接区序列描述于第5,073,627号和第5,108,910号美国专利。更具体地适用于本发明的示例性柔性连接区包括那些由序列SEQIDNO:49或NO:51编码的柔性连接区(分别为氨基酸序列SEQIDNO:50-也称为连接区20,以及NO:52-也称为连接区26)。在本发明化合物中，所述至少一个含sushi多肽的序列能够位于相对于所述至少一个IL-15R/5/7结合体的序列的N-末端位置中。或者，所述至少一个含sushi多肽的序列能够位于相对于所述至少一个IL-15R/3Ay结合体的序列的C-末端位置中。本发明化合物能够是融合蛋白。融合蛋白是包含两个或多个源自不同或异种蛋白或肽的区域的多肽。使用常规的片段酶切和连接技术从期望的序列制备融合蛋白。可使用应用合成寡核苷酸的PCR技术来制备和/或扩增期望的片段。重叠合成代表期望序列的寡核苷酸也能够用于制备编码融合蛋白的DNA构建体。融合蛋白能够包含数个序列，包括前导(或信号肽)序列、连接区序列、亮氨酸拉链序列或其它形成低聚物的序列、以及编码高度抗原部分的序列，所述编码高度抗原部分的序列提供用于融合蛋白的轻易纯化或快速检测的方法。示例性的本发明化合物是这样的融合蛋白，其包含含sushi多肽SEQIDNO:30(it+sushi+铰链)和人野生型IL-15SEQIDNO:48,任44选地通过连接区连接在一起。其它示例性的本发明化合物是融合蛋白，其包含-信号肽SEQIDNO:5，-Flag标签和Xa结合位点序列SEQIDNO:54，-含sushi多肽SEQIDNO:30(it+sushi+铰链)，-连接区SEQIDNO:50，以及-人野生型IL-15的SEQIDNO:48，即由SEQIDNO:60编码的RLI融合蛋白。其它示例性的本发明化合物是融合蛋白，其包含-信号肽SEQIDNO:58，-Flag标签和Xa结合位点序列SEQIDNO:56，-人野生型IL-15的SEQIDNO:48，-连接区SEQIDNO:52，-含sushi多肽SEQIDNO:30(it+sushi+铰链)，即ILR融合蛋白SEQIDNO:62。能够通过技术人员认为合适的任何方式产生本发明化合物，所述方式例如，化学多肽合成或多肽生物合成。现在化学多肽合成是4艮常规的(参见例如Andersson"a/.，2000，Biopolymers(PeptideScience)55:227-250)，并JU艮多公司专门进4亍这种合成。优选地，通过固相肽合成(SPPS)技术，使用标准FMOC方案(参见例如Carpino"a/.,1970,J.Am.Chem.Soc.92(19):5748-5749;Carpinoetal.，1972，J.Org.Chem.37(22):3404-3409)合成本发明^i合物。或者，技术人员可选择用生物方法通过体外或体内翻译编码这种化合物的核酸而产生所述化合物。核酸、载体、宿主细胞本发明因此还涉及编码产物的核酸(DNA或RNA)，所述产物旨在刺激IL-15R/3Ay信号通路、从而诱导和/或刺激诸如NK和/或T细胞的IL-15R/3/7-阳性细胞的活化和/或增殖。更具体地，本发明的核酸编码本文所定义的本发明的分离的含sushi多肽，或编码本文所定义的共价连接的本发明化合物(即，含有至少一个直接或间接与至少一个IL-15Ri8A/结合体共价连接的含sushi多肽)。所述编码与通用遗传密码一致，适当考虑其简并性。本发明的核酸能够任选地包含在载体内，如转染型载体或表达型载体内。本发明的核酸可操作地连接于诸如转录启动子或增强子的适当的转录或翻译调节序列、任选的控制转录的操纵基因序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译起始与终止的适当序列。这种载体的实例包才舌pEFl/myc-His(InVitrogen，V921-20)、pcDNA3.1(InVitrogen，V800画20)。本发明的核酸还可与能够促进被翻译的多肽胞外分泌的前导序列连接。这种前导序列的实例包括来自大鼠泌乳素前体的前导序列(SEQIDNO:57)或来自IL-15Ra的前导序列，例如人IL-15Rcd言号肽CDS的SEQIDNO:4。这些核酸的序列还可在其3'末端包含终止密码子(TAG、TGA、TAA)。本发明涉及编码所述本发明化合物之一的每一核酸。位于权利要求部分之前的表4表明这些核酸的相应SEQIDNO:。例如-编码所述人IL-15Ra的核酸能够包含序列SEQIDN0:2;-编码所述人胞外IL-15Ra的核酸能够包含序列SEQIDNO:39;-编码所述人sushi结构域的核酸能够包含序列SEQIDNO:13;-编码所述人尾区的核酸能够包含序列SEQIDNO:31;-编码所述人尾区的所述外显子3编码部分的核酸能够包含序列SEQIDNO:33;-编码所述人IL-15的核酸能够包含序列SEQIDNO:47;-编码共价连接的本发明化合物的核酸能够包含序列SEQIDNO:59(RLI融合蛋白)或SEQIDNO:61(ILR融合蛋白)。本发明的核酸能够在其5，端包含Kozak序列，例如来自人野生型IL-15R的Kozak序列，如gccgcc;或来自牛泌乳素前体的Kozak序歹寸，如gccacc。本发明的核酸能够在其3，端包含终止密码子(如tag、tga或taa)。本发明还涉及包含本发明的核酸的任何载体。优选地，这样的载体是杆状病毒载体所述载体能够例如是转染型载体或表达型载体。细胞。本文所用的"转染的"或"转染"意为向真核细胞中引入一个或多个外源核酸。转染包括通过标准物理和化学转染技术引入诸如质粒的棵核酸，所述物理和化学转染技术包括磷酸钙沉淀、葡聚糖硫酸酯沉淀、电穿孔、脂质体介导的核酸转移、诸如微粒轰击的基因枪方法等等。转染还包括通过生物学方法向细胞中引入核酸，所述生物学方法包括病毒转导或感染(受体介导的和非受体介导的)。本文所用的"转化的"或"转化"意为向原核细胞中引入一个或多个外源核酸。转化包括引入棵核酸以及诸如噬菌体的核酸载体。适当的宿主细胞包括在适当的启动子控制下的原核生物、酵母或高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阳性和革兰氏阴性有机体，例如大肠杆菌(^scAen'cA/aco〃)、牙古草4干菌(5ac/〃wsi/6"'"51)、鼠伤寒沙门菌(Sa/附o"e〃a(y/^/附wn'M附)，以及4干菌属(5fl"'〃/ws)、，1单月包菌属(尸化wc/omowa力、链霉菌属(5Y^p,omyc&s)和葡萄球菌属(5"/apA少/ococci/51)中的各种其它物种。适当的宿主细胞的实例还包括诸如酿酒酵母(SaccAflramyces""v^ae)的酵母，以及诸如哺乳动物或昆虫来源的确立细胞抹的高级真核细胞。适当的高级真核细胞的实例包括哺乳动物细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，如中国卵巢仓鼠细胞系CHO/dhfr-(CHOduk-)(ATCCn。CRL-9096);或者例如上皮细胞系，如猿上皮细胞系COS-7(ATCCn。CRL1651),或人细胞系，如293c18人肾细胞系(ATCCn。CRL-10852)或FreeStyle293-F人肾细胞系(InVitrogenn°R790-07)。所述宿主细胞可以是真核细胞、哺乳动物细胞(人细胞或诸如CHO细胞的非人细胞)、酵母细胞或原核细胞(例如大肠杆菌)。最优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，这是由于在本发明中这种细胞更有效(与任何糖基化问题无关)。生物和医药应用本发明的产物特别包含本文所定义的分离形式的所述含sushi多肽，以及其共价连接形式，所述共价连接形式在此称为共价连接的本发明化合物(即包含与至少一个IL-15R/5Ay结合体直接或间接共价连接的至少一个含sushi多肽的化合物)。本发明的产物还包括编码这种多肽和化合物的核酸、包含这种核酸的载体、以及被这种核酸和这种载体转化或转染的宿主细胞。本发明的产物可用于扩大淋巴细胞子集，例如特定的T/NK子集。本发明因此涉及本发明的产物作为扩大诸如NK细胞、NK-T细胞、CD8+记忆细胞的一个或数个淋巴细胞群的试剂的用途，以及涉及用于这种用途的佐剂、组合物和试剂盒，其包括含有至少一种本发明产物的药物组合物和药物。所述至少一个含sushi多肽和所述至少一个IL-15Rj8Ay结合体能够以组合形式使用，例如以共价结合的本发明化合物的形式使用，或者以单独的形式使用。本发明因此涉及作为用于同时、单独或顺序使用的组合制剂，即以一整套组件(kit-of-parts)形式的-所述至少一个如本文所定义的IL-15Rj8Ay结合体，以及-所述至少一个如本文所定义的含sushi多肽，或其相应的核酸、载体、宿主细月包。本发明因此涉及这样的制剂，其为包括药物组合物和药物的佐剂、组合物或试剂盒。本申请因此涉及其中期望IL-15活性增加的疾病状态或疾病的预防和/或緩解和/或治疗，所述疾病状态或疾病例如特别是癌或免疫缺陷。这样的预防和/或緩解和/或治疗可以通过刺激淋巴细胞(例如T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、树突细胞)的增殖和/或存活和/或其对抗肿瘤细胞的活性起作用。本发明的预防和/或緩解和/或治疗方法包括将本发明的产物给予有需要的患者。本发明还涉及用于这样的预防和/或緩解和/或治疗的佐剂、组合物、药物组合物、药物以及疫苗。本发明的药物组合物、药物以及疫苗包括至少一种本发明的产物，以及任选的药物可接受赋形剂和/或载体和/或稀释剂和/或佐剂。本发明更具体地涉及佐剂。这样的佐剂特别适用于诱导和/或刺激免疫反应，其包括分离的IL-15Rasushi结构域或其保守变体。这样的佐剂可以是用于抗孩t生物(抗病毒、抗菌、抗真菌)疫苗或抗肿瘤疫苗的佐剂。本发明还涉及-能够特别用于诱导和/或刺激IL-15生物作用的组合物，其包括分离的IL-15Rasushi结构域或其保守变体，-分离的IL-15Rasushi结构域或其保守变体在制备用于免疫治疗组合物的佐剂中的用途，-分离的IL-15Rasushi结构域或其保守变体在制备用于诱导和/或刺激IL-15生物作用的组合物中的用途。本申请因此涉及包含至少一个如本文所定义的含sushi多肽以及任选的药物可接受赋形剂和/或载体和/或稀释剂和/或佐剂的药物或疫苗。这样的药物或疫苗用于其中期望IL-15活性增加的疾病状态或疾病的预防和/或治疗和/或緩解，所述疾病状态或疾病例如特别是癌或免疫缺陷。这样的药物或疫苗可以通过刺激淋巴细胞(例如T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、树突细胞)的增殖和/或存活和/或其对抗肿瘤细l包的活性起作用。本发明更具体地涉及抗肿瘤药物或疫苗，所述药物和疫苗通过刺激表达IL-15R/3Ay但不表达IL-15Ra的NK和CD8+T细胞的增殖而赋予其预防和/或緩解和/或治疗作用。这样的抗肺瘤药物或疫苗因此用于这样的患者其NK和/或CD8+T细胞群没有足够的活性赋予有效的抗肿瘤监视和清除。这样的抗肿瘤药物或疫苗更具体地用于这样的患者其没有足够的或没有足够活性的表达IL-15R/3Ay但不表达IL-15Ra的NK和/或CD8+T细胞群。本发明的抗肿瘤药物或疫苗可包含分离的IL-15Rasushi结构域或其保守变体。本发明优选的抗肿瘤药物或疫苗包含國至少一个如本文所定义的IL-15Rj3Ay结合体，如IL-15，以及-至少一个如本文所定义的含sushi多肽，例如分离的IL-15Rasushi结构域或其保守变体。优选地，诸如IL-15的至少一个IL-15R/3Ay结合体和诸如分离的IL-15Rasushi结构域的所述至少一个含sushi多肽或其保守变体在融合蛋白中是连接的，从而形成本发明的共价连接的化合物。本发明还涉及预防和/或緩解和/或治疗涉及免疫缺陷的疾病或疾病状态。本发明更具体地涉及预防和/或緩解和/或治疗涉及HIV相关的免疫缺陷的疾病或疾病状态。该预防和/或緩解和/或治疗包括将本发明的产物给予有需要的患者。本发明涉及用于这样的预防和/或緩解和/或治疗的药物和/或组合物。本发明因此涉及用于免疫治疗组合物的佐剂，其特征在于其包含下列要素中至少一个要素-本发明的化合物，-本发明的核酸，-本发明的载体，-本发明的宿主细胞。有利地，所述佐剂改善CD8记忆响应。在本申请中，《免疫治疗》包涵通过诱导和/或刺激免疫反应而进行治疗、緩解和/或预防。术语《免疫治疗组合物》因此包涵预防疫苗以及緩解和/或治疗"疫苗"。术语《佐剂》用于定义能够被加入至组合物以改善免疫反应(先天免疫反应和/或适应免疫反应)的物质。在本发明中，其还包涵能够寻皮加入至组合物以改善该组合物随时间，即免疫反应(记忆CD8+T细胞)持续时间期间，进行的效率的物质。本发明化合物可作为佐剂化合物而用于组合物，但也能够本身作为活性物质起作用。其确实能够独立地并且自发地诱导和/或刺激IL-15R/3/7-阳性细胞的增殖和活化，以及更具体的NK和/或T细胞/人天然NK和/或T细胞的分化。术语《活性物质》旨在定义能够引起免疫反应的物质。作为用于免疫治疗组合物的佐剂，本发明化合物改善免疫反应(先天免疫反应；适应免疫反应)的强度和/或改善免疫反应的持续时间(其改善TCD8记忆响应)。作为用于免疫治疗组合物的活性试剂，本发明化合物诱导的免疫反应比其它NK/T细胞刺激剂诱导的免疫反应具有更高的强度和/或更长的持续时间。因此，无论是用作与所诱导的另一免疫反应关联的佐剂诱导，或是用作独立地并且自发地诱导免疫反应的活性物质，本发明化合物改善免疫反应的强度和/或持续时间。其有利地-诱导改善的先天免疫反应，-诱导改善的适应免疫反应以及更具体的改善的CD8记忆响应。本申请还涉及佐剂组合物，其包含下列要素中至少一个要素-本文所定义的本发明化合物，-本发明的核酸，-本发明的载体，51-本发明的宿主细胞。本申请还涉及产生用于免疫治疗组合物的佐剂的方法，其特征在于其包含提供可溶性IL-15Ra分子或保留了其sushi结构域的片段，将其共价连接于选自IL-15、IL-15片段、激动剂或模拟物的IL-15R/3/7结合单元，所述IL-15Rj8结合单元与IL-15R|8/7结合的亲合力不显著低于天然IL-15与IL-15R/3Ay结合的亲合力(能够与天然IL-15和/或IL-2竟争结合IL-15R/3/7),并且所述IL-15R/3Ay结合单元优选地不与IL-2Rce结合，从而由此得到化合物是用于免疫治疗组合物的佐剂。本发明还涉及包含至少一个含有如本文所定义的IL-15Rasushi结构域的多肽的组合物、药物组合物或药物，即其中所述至少一个含sushi多肽的氨基酸序列是人IL-15Ra胞外区、或保留了所述IL-15Ra的sushi结构域的片段的氨基酸序列，其中所述IL-15Rasushi结构域被定义为开始于第一外显子2编码的半胱氨酸残基(C1)并且终止于第四外显子2编码的半胱氨酸残基(C4),sushi序列中包括残基Cl和C4，与这样的IL-15Ra或IL-15Ra片段序列具有至少85%的同一性，前提是保留所述sushi结构域中所有四个半胱氨酸残基(C1、C2、C3和C4)。所述同一性百分数优选为至少90%,还更优选为至少92%,最优选为95%，如至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。本发明更具体地涉及组合物、药物组合物或药物，其包含至少一个含有如本文所定义的IL-15Rasushi结构域的多肽，其中所述至少一个含sushi多肽包含、或由下列部分组成由外显子2和3编码的胞外IL-15Ro;部分，或保留sushi结构域的所述部分的片段。本发明优选地涉及组合物、药物组合物或药物，其包含-人IL-15Ra片段，其氨基酸序列是SEQIDNO:3的从位置l延伸至位置127的氨基酸，或者-保留了所述片段的sushi结构域的亚片段，其中國所述sushi结构域被定义为开始于第一外显子2编码的半胱氨酸残基(C1)并终止于第四外显子2编码的半胱氨酸残基(C4)，该sushi结构域中包括残基CI和C4，并且-所述信号肽的氨基酸序列为所述SEQIDN0:3的从位置l延伸至位置30的序列，或者-所述片段或亚片段的变体，其在所述片段或亚片段全长上的氨基酸序列同一性为至少85%。所述同一性百分数优选为至少90%，还更优选为至少92%，最优选为至少95%,如至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。这样的组合物、药物组合物或药物还可包含至少一个IL-15Rj8Ay结合体，例如本文所定义的IL-15或IL-15片,殳或变体。所述至少一个IL-15R/3/7结合体能够不与所述至少一个含sushi多肽共价连接，即能够以游离形式置于所述组合物中，和/或能够与所述至少一个含sushi多肽共价连接。在后一情况下，本发明的组合物、药物组合物或药物实际上包含如本文所定义的本发明化合物。这样的药物组合物或药物能够用于引起IL-15生物作用，并且更具体地用于诱导和/或刺激IL-15Rj3Ay-阳性细胞的增殖和/或活化。这样的药物组合物或药物能够用于诱导和/或刺激NK和/或T免疫反应的增殖和/或活化。这样的药物组合物或药物能够用于预防性和/或緩解性和/或治疗性疫苗组合物。这样的药物组合物或药物能够用于预防和/或緩解和/或治疗传染性疾病，和/或用于预防和/或緩解和/或治疗免疫缺陷(例如HIV诱导的免疫缺陷)，和/或用于预防和/或緩解和/或治疗肿瘤发展或存在(并且然后可以进一步含有至少一种肿瘤抗原)，和/或用于预防和/或緩解和/或治疗X-SCID。根据本发明的有利实施方案，所述至少一个含sushi多肽与IL-15R/3Ay结合体共价连接。最优选地，该IL-i5Rj8/7结合体不结合IL-2Ra。根据本发明的优选实施方案，所述至少一个含sushi多肽与IL-15R/3Ay结合体共价连接，所述IL-15R|8Ay结合体是IL-15或IL-15片段、模拟物或激动剂，其与IL-15R/Ay结合的亲合力不显著低于天然IL-15与IL-15R/3Ay结合的亲合力(即能够与天然IL-15和/或IL-2竟争结合IL-15R/5Ay的片段、模拟物或激动剂)。本发明因此更具体地涉及用于刺激IL-15R/3Ay信号通路，从而诱导和/或刺激诸如NK和/或T细胞的IL-15R/3Ay-阳性细胞的活化和/或增殖的药物组合物，其特征在于其包含下列要素中至少一个要素-本发明的化合物，-本发明的核酸，-本发明的载体，-本发明的宿主细胞。这样的药物组合物还可包含药物上适当的赋形剂(载体、稀释剂、赋形剂、添加剂、pH调节剂、乳化剂或分散剂、防腐剂、表面活性剂、胶凝剂以及緩冲剂和其它稳定剂和增溶剂等等)。本发明还涉及用于刺激IL-15Rj3/7信号通路、从而诱导和/或刺激诸如NK和/或T细胞的IL-15R|3Ay-阳性细胞的活化和/或增殖的药物，其特征在于其包含下列要素中至少一个要素-本发明的化合物，-本发明的核酸，-本发明的载体，-本发明的宿主细胞。所述药物优选为免疫治疗组合物。这样的药物最优选为预防性和/或緩解性和/或治疗性疫苗组合物。所述药物还可包含生理上适当的赋形剂(载体、稀释剂、赋形剂、添加剂、pH调节剂、乳化剂或分散剂、防腐剂、表面活性剂、胶凝剂以及緩冲剂和其它稳定剂和增溶剂等等)。适当的的药物可接受的赋形剂和制剂包括所有已知的药物可接受的赋开j剂和制剂，例3o在"Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明顿药物科学与实践)，，，20thedition,MackPublishingCo.;以及"PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems(药物剂型和药物递送系统)"，Ansel,PopovichandAllenJr.，LippincottWilliamsandWilkins中4笛述的那些。通常，载体的性质取决于所用的具体给药方式。例如，肠胃外制剂除了一种或多种造影剂之外通常包含可注射用液体作为赋形剂，所述可注射用液体包括药物上和生理上可接受的液体，包括水、生理盐水、平衡盐溶液、缓沖液、含水葡萄糖、甘油、乙醇、芝麻油、其组合等等。介质还可含有常规的药物附属材料，例如调节渗透压的药物可接受盐、緩冲剂、防腐剂等等。载体和组合物能够是无菌的，并且制剂适合于给药方式。对于固体组合物(如粉剂、丸剂、片剂或胶嚢剂形式)，常规的无毒栽体能够包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、糖精钠、纤维素、碳酸镁、或硬脂酸镁。除了生物中性载体外，待给药的药物组合物能够含有少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH緩沖剂等等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。组合物能够是液体溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶嚢剂、持续释放制剂或粉剂。能够用传统的粘合剂和栽体，例如甘油三酸酯，配制纟且合物。本发明的组合物或药物可用于通过IL-15R/3/7信号通i各诱导和/或刺激IL-15生物作用。其尤其可用于诱导和/或刺激先天免疫反应(NK细胞)，和/或适应性免疫(T细胞，以及更具体的TCD8+记忆细胞)。根据本发明的非常有利的实施方案，所述药物能够用于预防和/或緩解和/或治疗肿瘤发展或存在。所述肿瘤能够例如是黑素瘤、淋巴瘤、癌(如子宫颈癌)、乳癌、卵巢癌、胰腺瘤。有利地，所述抗肿瘤药物是通过转呈递起作用的抗肿瘤疫苗。本发明的抗肿瘤药物还能够包含至少一种肿瘤抗原。所述至少一种肿瘤抗原能够是可溶性形式，或与本发明化合物连接(通过共价连接或通过另外形式的连接)。有利地，以载有这种抗原的树突细胞的形式，如以表达所述至少一种肿瘤抗原的遗传学构建的树突细胞的形式提供所述至少一种肿瘤抗原。肿瘤抗原是由MHCI分子在肿瘤细胞表面呈递的抗原。肿瘤抗原还能够以例如突变的受体的形式存在于肿瘤表面，在这种情况下它们会被B细胞识别。肿瘤抗原有时能够仅由肿瘤细胞而不被正常细胞呈递。在这种情况下，它们被称为肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤特异性移植抗原(TSTA)或肿瘤排异抗原(TRA),并通常源自肿瘤特异性突变。通常当感染性病毒使得细胞成为永生并表达病毒抗原时出现TSA。非被病毒诱导的TSA是B细胞淋巴瘤上的BCR或T细胞淋巴瘤上的TCR的独特型。更常见的是由肿瘤细胞和正常细胞呈递的抗原，并且它们被称为肿瘤相关抗原(TAA)。TAA发现于肿瘤细胞和胎儿期的正常细胞上(癌胚抗原)、出生后选择的器官中、或在TAA浓度大大小于在肿瘤细胞中的浓度的许多细胞中。癌基因可在致癌病毒中表达。大多数癌基因实际上存在于宿主细胞中，其中它们表现为调节细胞生长。当被病毒转导并在病毒启动子的控制下表达时，宿主细胞基因的产物，即原癌基因的产物，有助于肿瘤细胞的未调节生长。由于原癌基因所编码的蛋白通常由正常细胞表达，其在肿瘤细胞上的过表达会使其能够作为肿瘤相关抗原。识别这些抗原的细胞毒性T淋巴细胞可能能够在肿瘤细胞增殖或转移之前^5皮坏肿瘤细胞。然而，肿瘤细胞可向下调节I类MHC表达。的粘着分子。某些肿瘤细胞通过产生诸如TGF/3的抑制细胞免疫性的抑制性细^^因子而活3夭地抑制免疫反应。肿瘤抗原的实例特别包括-细胞周期调节剂，例如依赖细胞周期蛋白的激酶4(黑素瘤)，-信号转导蛋白，例如/3-连环蛋白(黑素瘤)，國凋亡调节剂，例如caspase画8(鳞状细胞癌)，-睾丸蛋白，例如MAGE抗原(黑素瘤、乳腺肿瘤、胶质瘤)，如MAGE國1(登录号P43355)、MAGE-2(登录号P43356)、MAGE-3(登录号P43357)、MAGE-4(登录号P43358)、MAGE-6(登录号P43360)、MAGE-8(登录号P43361)、MAGE-9(登录号P43362)、MAGE-10(登录号P43363)、MAGE-11(登录号P43364)、MAGE-12(登录号P43365),-黑色素合成中涉及的化合物(黑素瘤)，例如酪氨酸酶(登录号P14679),-BCR独特型，例如表面Ig独特型(淋巴瘤)，-酪氨酸激酶受体，例如Her-2/neu、MUC-1(乳癌和卵巢癌)，-低糖基化粘蛋白类，例如MUC-1(乳腺肿瘤和胰腺肿瘤)，画病毒基因产物，例如HPVE6和E7(宫颈癌)。本发明的组合物或药物能够用于预防和/或緩解和/或治疗感染性疾病(被诸如病毒、细菌、酵母、真菌等等的微生物感染)。本发明的组合物或药物能够用于预防和/或緩解和/或治疗免疫缺陷(如由诸如抗肺瘤治疗或移植前治疗的具体治疗的副作用诱导的免疫缺陷；或由诸如HIV的病毒诱导的免疫缺陷)。本发明的组合物或药物能够用于预防和/或緩解和/或治疗SCID-X(X染色体连锁性严重联合免疫缺陷，其与IL-15R机能障碍相关)。包括至少一种本发明产物的药物组合物制剂是本领域技术中公知的。所述组合物给药的细节也是本领域技术中公知的。治疗患者的医师在其它参数中必须考虑年龄、一般状况和病状。可通过对具体化合物适当的任何方法(如口服、静脉内、肠胃外、经皮、经粘膜)、或通过手术或移植(如采用固体的或半固体的生物相容性和可再吸收基质形式的化合物)在期望所述化合物起作用的位点或在该位点附近给予患者根据本发明的方法识别的对治疗有用的化合物。本领域技术人员可确定适当的治疗剂量，并且治疗剂量是体重的函数。本发明还涉及用化合物通过治疗和/或緩解和/或预防对需要该化合物的患者或非人动物进行治疗的方法。本发明还涉及对需要该化合物的患者进行治疗的方法(通过治疗57和/或緩解和/或预防进行治疗)，该方法是通过给以本发明的产物、组合物或药物。本发明还涉及诱导和/或刺激IL-15R/3Ay-阳性细胞的增殖和/或活化的方法，其特征在于其包括-使IL-15Rj8Ay-阳性细胞与至少一个下列要素接触，从而诱导和/或刺激所述IL-15R/3/，阳性细胞的增殖和/或活化-本发明的化合物，-本发明的核酸，-本发明的载体，-本发明的宿主细胞。在能够实现所述IL-15Ri8Ay-阳性细胞的增殖和/或活化的条件下进行所述接触。这样的条件特别包括持续时间以及环境条件(温度、空气、培养基)。这些条件的调节在本领域普通技术人员的能力范围内。本发明还涉及诱导和/或刺激IL-15R/3Ay-阳性细胞的增殖和/或活化的体外方法，其特征在于其包括-提供包含IL-15Rj8Ay-阳性细胞的细胞样品，-使所述样品与至少一个下列要素在能够实现所述接触的环境条件下接触一段时间，以诱导和/或刺激所述IL-15R/3Ay-阳性细胞的增殖和/或活化-本发明的化合物，-本发明的核酸，-本发明的载体，-本发明的宿主细胞。本发明还涉及产生活化NK和/或T细胞的方法，其特征在于其包括-使休眠NK和/或T细胞与至少一个下列要素在能够实现所述接触的环境条件下接触一段时间，以诱导包含在所述样品中的所述休眠NK和/或T细胞的活化-本发明的化合物，-本发明的核酸，-本发明的载体，-本发明的宿主细胞。本发明还涉及产生活化NK和/或T细胞的体外方法，其特征在于其包括-提供包含休眠NK和/或T细胞的细胞样品，-使所述样品与至少一个下列要素在能够实现所述接触的环境条件下接触一段时间，以诱导包含在所述样品中的所述休眠NK和/或T细胞的活化-本发明的化合物，-本发明的核酸，-本发明的载体，-本发明的宿主细胞。诱导和/或刺激IL-15R(8Ay-阳性细胞的增殖和/或活化的方法中，以及在产生活化的NK和/或T细胞的方法中，被接触的细胞可以是细胞系。或者它们能够是由生物体(如人患者)采集的离体细胞，并旨在经体外处理后送回该生物体或另外的生物体(如同一患者)。因此，本发明包涵所述方法的离体实施方案，以及其在通过治疗和/或緩解和/或预防而进行的治疗过程中的实施。在本申请中，通常不宣称"终止，，密码子(TAG、TGA或TAA)被包含在CDS内。术语"包含(comprising)"是"包括(including)"或"含有(containing)"的同义词，其是开放的，并且不排除另外的、未述及的要素、成分或方法步骤，而术语"由……组成(consistingof)"是封闭术语，其排除任何未明确述及的另外的要素、步骤或成分。术语"基本上由……组成(essentiallyconsistingof)"是部分开》文术语，其不排除另外的、未述及的要素、步骤或成分，前提是这些另外的要素、部分或成分不从本质上影响本发明的基本的和新颖的性质。因此术语"包含(comprising)"(或"comprise(s)")包括术^吾"由......组成(consistingof)"("consist(s)of，)以及术语"基本上由……组成(essentiallyconsistingof)"("essentiallyconsist(s)of，)。因此，本申请中的术语"包含(comprising)"(或"comprise(s)")意为更具体地包涵术语"由……组成(consistingof)"("consist(s)of，)以及术i吾"基本上由......组成(essentiallyconsistingof)"("essentiallyconsist(s)of，)。本文所用的术语"显著地"具有统计学领域(如t检验、z检验、卡方值或F比值等等)的通常含义，即为了比较一个值与另一个值，并确定这些值是否彼此不同。因此术语"显著地，，包涵下面的事实技术人员会考虑标准偏差(若有)，其以频率分布测量数据分布的量。期望的p值通常设置为5%的a水平，或者更严格的1%的a水平。本文引用的所有参考文献的相关公开中每一种均以参考的方式明确并入。以举例说明的方式，而不是以限制的方式提供下列实施例。实施例实验步骤细胞培养和细胞因子-重组人IL-15(rlL-15)来自PeprotechInc(RockyHill，NJ)。在含有10。/o热灭活的胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺以及1ng/mlGM-CSF(R&DSystems;Abington,UK)的RPMI1640培养基中培养Mo-7髓样白血病细胞系(表达IL-l5R/3Ay、但不表达IL-l5Ra的人细胞系)以及TF-l红白血病人细胞系(表达IL-15Ra和IL-15R>但不表达IL-15R/3的细胞系；ATCCCRL-2003)。在添加有250|ug/ml遗传霉素的相同培养基中培养TFl-卩细胞(22)。在含有6%FCS、2mM谷氨酰胺、10ng/mlrIL-2(Chiron;Emeryville,CA)的RPMI1640培养基中培养Kit225人T淋巴瘤细胞系(IL-2依赖细胞系)。在含有10%FCS、0.4ng/mlm-IL-3、10pg/mlb-巯基乙醇、250pg/ml遗传霉素的RPMI中培养小鼠32DiS细胞系，其表达内源性小鼠IL-15Ry链和转染的人IL-15Ri3链(可得自ATCCCRL-11346的32D细胞系)。'sIL誦15Ra國IL2、sIL-15Ra画sushi画IL醒2和sIL-15Ra-sushi—在CHO细胞中表达并如(23)所述制备sIL-15Ra-IL-2。制备类似的构建体，其中所述IL-15Ra的sushi结构域(成熟编码序列的氨基酸l-66)与人IL-2分子连接(sIL-15Ra-sushi-IL-2)。通过PCR扩增IL-15Ra的sushi结构域。将PCR产物纯化，用BamHI和HindIII(Fermentas、Vilnius、Lithuania)酶切，并连4妄到pQE30表达载体。在IPTG诱导下在大肠杆菌SG"0W细胞中进行表达。在细胞裂解后，将包涵体洗涤，溶于6mM盐酸胍、pH7.4的20mM磷酸钠、20mM咪唑、150mM氯化钠和1mMDTT。将IL-15Ra-sushi捕获在用增溶緩冲液加1mM还原谷胱甘肽和0.2mM氧化谷胱甘肽平衡的Ni-NTA琼脂糖柱(Qiagen)上。将其在柱緩沖液中通过从6M至0M盐酸胍梯度再折叠(24)并用250mM咪唑洗脱。RLI和ILR融合蛋白-融合蛋白的构建体如图2E所示。对于RLI,人IL-15Rocsushi结构域(aal-77)和人IL-15通过连接区20(SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ;SEQIDNO:50)分隔，或者对于ILR则通过连接区26(SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ;SEQIDNO:52)分隔。在信号肽(sp)和编码序列之间加入编码Flag表位和因子Xa结合位点的序列(对于RLI，DYKDDDDKIEGR，SEQIDNO:54;对于ILR,TTRDYKDDDDKIEGR，SEQIDNO:56)。对于RLI,使用人IL-15Ra的内源性sp(SEQIDNO:5),以及对于ILR,使用牛泌乳素前体的sp(SEQIDNO:58)。将这些构建体插入至pFastBac1(InVitrogen)表达载体的BamHI和HindIII位点之间以产生两个表达载体，使用Bac至Bac表达系统(InVitrogen)将其重组在杆状病毒DNA中。使用重组杆状病毒感染SF9细胞(ATCCCRL-1711),融合蛋白表达在SF900II培养基(GibcoTMInvitrogenCorp.)中并在感染4天后收集。通过ELISA,使用抗IL-15mAb247(R&DSystems)作为捕获抗体、以及抗FlagM2过氧化物酶偶联物(Sigma;StLouis,MO)作为显色抗体测量融合蛋白的浓度。表面等离子共振(SPR)研究-使用BIACore2000生物传感器(BIACore，Uppsala,Sweden)进行这些实验。将rIL-15共价连接于CM5传感器芯片，并监控增加浓度的sIL-15Rot-IL-2、sIL隱15Rot画sushi-IL-2或sIL誦15Ra-sushi的结合。使用BIAlogue动力学评价软件进行传感图的分析。增殖测定-如(19)所述，通过卩H]-胸香并入，在脱除细胞因子的培养基中4小时、培养48小时并与[311]-胸苷培养16小时后，测量Mo-7、TF-1(3和Kit225细胞对rIL-15、rlL-2、RLI或ILR的增殖响应。凋亡-使用FACScan流式细胞仪和膜联蛋白V-FITC凋亡4企测试剂盒(BDBiosciencesPharmingen,France)进4亍膜联蛋白V测定。细月包因子饥饿后，将细胞以1ml中5x105细胞/孔种在多孔板中，并在添加有各种反应物(rIL-15、sIL-15Rot-sushi和RLI融合蛋白)的培养基中培养。使用CellQuest软件获得并分析数据。结合测定和内在化-用[1251]-碘标记人rIL-15、sIL-15Ra-sushi和RLI融合蛋白，随后如前所述(19)进行结合实验。对于内在化，在4°C下将细胞用标记的sIL-15Ra國sushi或RLI平衡，并将温度转到37。C。在不同的时间间隔，将两种样品洗涤并离心。将细胞沉淀的一种用pH2.5的0.2M甘氨酸-HCl緩冲液处理，而另一种在4。C下用pH7.4的PBS处理5分钟。离心后，由用PBS处理的细胞沉淀测定总配体结合，而由用酸性pH处理的细胞的上清液和沉淀中分别测定膜结合分数和内在化分数。sIL-15Ra-Sushi+:如对融合蛋白RLI和ILR所述，将Flag-因子Xa标900II(InVitrogen,Cergy-Pontoise,France)中。通过用碌u酸铵沉淀将上清液浓缩至90%饱和度并上样到抗Flag琼脂糖免疫亲合柱上(Sigma-Aldrich,Saint-QuentinFallavier，France)。如前所述(Lehoursetal.Eur.CytokineNetw.11(2000)，207-5)，在用氯胺-T方法进行碘化之后，通过SDS-PAGE测定sIL-15Ra-Sushi+的纯度为100%,表观分子量为12kDa。通过基于双会啉-4-羧酸(BCA)的蛋白测定(Pierce,PerbioScience,Brebi6res，France)而测定其浓度。结果IL-15Ra与IL-15的结合主要是由于sushi结构域一先前的研究(25)显示除去由IL-15R的外显子2编码的"sushi"结构域导致IL-15与膜锚定的IL-15Ra的结合的完全消除，这表明sushi结构域对于结合是必需的。为了直接测量sushi结构域在IL-15结合中的贡献，制备了含有全部胞外结构域或仅含有N-末端sushi结构域的可溶形式的IL-15Ra，并在竟争测定中通过使用表面等离子共振(SPR)技术测定了其IL-15结合。如图1A所示，CHO细胞中产生的并包含与人IL-2分子(用作纯化的标签)结合的全部IL-15Rce胞外结构域的sIL-15Ra-IL-2融合蛋白以高亲合力与il-15结合(kon-3.7xio5M"s";koff=1.4xi(r5s-1;Kd=38pM)。连接IL-15Ra的sushi结构域到人IL-2上的类似构建体也结合IL-15(图1B)，但亲合力低10倍，这主要是由于更快的离开速率(kon=3.1x1()5m"s";koff=1.3x10—4s";Kd=420pM)。可溶性sushi结构域也产生于大肠杆菌中。该sIL-15Ra-sushi也以较低的亲合力与IL-15结合(kon-2.5xK^M-V1;koff=3.8xl(T4s";Kd=1.5nM)(图IC)。这些结果表明sushi结构域是IL-15的结合亲合力的主要原因，但其不完全重新构成全长胞外结构域所显示的高亲合力结合。如图1E所示，延伸至称为铰链区的由外显子3编码的最初13个氨基酸的可溶性sushi结构域与含有未延伸的sushi结构域的sIL-15Ra-Sushi-IL-2相比，显示结合亲合力增加4倍，并且比全长可溶性IL-15Ra的亲合力仅^氐3倍，所有3个构建体均产生于具有类似折63叠能力的真核体系中。这些结果表明，延伸至铰链区的sushi结构域几乎完全重新构成全长胞外结构域所显示的高亲合力结合。传感图的分析结果给出对于各种可溶性IL-15Ra蛋白所计算的对IL-15的亲合力常数(Ko),以及统计学检验常数(x2),如下表3所示表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>可溶性IL-15Ra蛋白抑制IL-15与膜锚定的IL-15Ra的结合-检测了IL-15Ra的三种可溶形式胜过放射性碘标记的IL-15与人细胞系TF-1表达的IL-15Ra的结合的能力，所述人细胞系TF-1还表达IL-15R/y链，但不表达IL-15R/3链(图1D)。所述三种蛋白完全抑制IL-15与TF-1细胞的结合，其各自的IC50类似于通过SPR技术测量的Kd:100pM(sIL-15R(画IL國2)、270pM(sIL-15Ra-sushi誦IL-2)以及1.3nM(sIL國15RO"Sushi)。sIL-15Ra-sushi通过IL-15R^y复合物增加IL-15驱动的细胞增殖—由于在大肠杆菌中很容易以高收率得到可溶性sushi结构域，其谬皮选择用于所有的进一步研究。在第一实例中，在仅表达IL-15R0/7复合物的细胞系上(人Mo-7细胞系以及表达内源小鼠IL-15R链和转染的人IL-15R/3链的小鼠32D/细胞系)对其进行检测。如所期待的，Mo-7细胞系响应于纳摩尔浓度的rIL-15或rlL-2而增殖(图2A和2B)。出乎意料地，在测定中加入固定浓度的sIL-15Ra-sushi(10nM)增加了增殖响应，对较低浓度的rIL-15其变化为约4倍。单独的sIL-15Ra-sushi不诱导任何增殖响应。在32D/3上得到类似的结果，变化为约10倍。通过sIL-15Ra-sushi不影响rlL-2驱动的Mo-7细胞增殖的事实评Y介特异性(图2B)。图2C显示sIL-15Ra-sushi剂量依赖地增强固定浓度的rIL-15(1nM)的作用，其IC50(3.5nM)类似于其对IL-15的Kd，而固定浓度的rIL-15(1nM)单独仅诱导较小的增殖作用。RLI和ILR融合蛋白通过IL-15R3"复合物是有效的细胞增殖诱导剂为了评价sushi对IL-15生物活性的协同效应是否在单独分子上转移，精心制作了编码连接IL-15和sushi结构域的融合蛋白的分子构建体。对于两种构建体，在IL-15的C末端和sushi结构域的N末端之间(ILR)或相反(RLI)引入柔性连接区(图2E)。图2F中显示了示例说明这些蛋白的结构的分子模型。在Mo-7细胞增殖方面检测了这两种融合蛋白。如图2D所示，两种蛋白均诱导Mo-7细胞增殖的剂量依赖诱导，其EC50类似(约25pM)并远低于单独rIL-15的EC50(3nM)，或rIL-15与sIL-15Ra-sushi的等摩尔混合物的EC50(0.9nM)。这些结果进一步证实了sIL-15Ra-sushi对IL-15作用的协同效应，并表明用共价连接区稳定IL-15:sIL-15Ra-sushi复合物显著增强该协同效应。sIL-15Ra-sushi增加IL-15诱导的凋亡预防，并且RLI有效地预防细胞凋亡-细胞因子去除后，凋亡Mo-7细胞的分数在48小时内由10%升至80%(图3A，曲线a和b)。当在时间O加入时，rIL-15(5nM)将该凋亡降至70%(图3A，曲线c)。单独的sIL-15Ra-sushi(10nM)不起作用(图3Ab)。然而，其显著增强rIL-15的抗凋亡作用(48小时，35%凋亡)(图3A,曲线c)。动力学分析(图3B)和剂量响应曲线(图3C)证实了sIL-15Ra-sushi对IL-15预防凋亡的协同效应。rIL-15起作用的IC50为约1.5nM，与IL-15p/y受体的饱和一致。该IC50比在10nMsIL-15Ra-sushi存在下低约10倍(170pM)。RLI融合蛋白显著预防凋亡(图3B)。在摩尔浓度基础上，其甚至比IL-15:sIL-15Ra-sushi締合物更活泼，IC50为约40pM(图3C)。sIL-15Ra-sushi增加IL-15与Mo-7细胞的结合，并且RLI融合蛋白与Mo-7细胞结合并被Mo-7细胞内在化-如所期待的，Mo-7细胞以中等亲合力与IL-15结合(Kd-13.5nM)，最大结合能力为800位点/细胞(图4A)。加入sIL-15Ra-sushi(10nM)增加IL-15结合的亲合力(Kd-7nM)而不显著影响最大结合能力(1180位点/细胞)。当使用放射性碘化的RLI融合蛋白时(图4B)，发现其与类似数目的受体位点结合(730位点/细胞)，并且结合亲合力(Kd-780pM)显著高于IL-15。图4C显示RLI能够被有效地和快速地内在化<sIL-15Ra-sushi不影响IL-15驱动的细胞增殖，也不通过高亲合力IL-15Ra/(3/Y复合物抑制凋亡-人淋巴瘤细胞系Kit225表达内源性IL-15Ra、j3和y链，并且人TF-1卩细胞系表达内源性IL-15Ra和y链加转染的人IL-15R(3链。因此，如图5A和5B所示，这些细胞系响应于低的皮摩尔浓度的IL-15而增殖(EC50分别为19pM和21pM)。与对于Mo-7或32D卩细胞所发现的相反，向IL-15中加入等摩尔浓度的sIL-15Ra-sushi不显著影响IL-15对任一细胞类型的剂量响应曲线。ILR融合蛋白对所述两种细胞系的活性与rIL-15类似。RLI对Kit225细胞的活性也与rIL-15类似，但L对TF-ip细胞的效率比rIL-15高16倍(EC5(^1.2pM)。进一步分析了sIL-15Ra-sushi和RLI对细月包因子剥夺所诱导的TF-lp细胞凋亡的影响。柱状图示于图5C(曲线a、b、c和d)，而动力学和剂量响应曲线分别示于图5D和5E。rIL-15剂量和时间相互依赖地抑制TF-ip凋亡。单独的sIL-15Ra-sushi没有影响并且不改变IL-15的影响。ILR融合蛋白的活性与rIL-15类似，而RLI具有比rIL-15高约3倍的保护效果(对于RLI，IC50=2.5pM,而对于rIL-15或sIL-15Ra-sushi加rIL-15,IC50=6.5pM)。IL-15、sIL-15Ra-sushi和RLI与TFlp细胞结合—在IL-15Ra彌hi不影响TF-1(3的IL-15增殖的范围内，我们研究了很宽浓度范围内其对于IL-15结合的影响(图6A)。饱和结合曲线的Scatchard分析表明两类IL-15结合位点的存在，与少数高亲合力结合位点(IL-15Rot/p/"y复合物，Kd=22pM,Bmax=100位点/细胞)加更大量的中等亲合力结合位点(IL-15R(3/y复合物，Kd=30nM，2800位点/细胞)的存在一致。sIL-15Ra-sushi诱导IL-15结合的增加，这在Scatchard分析下主要是由于IL-15与中等亲合力成分结合的亲合力增加(Kd:3.5nM)。为了更具体地检验sIL-15Ra对高亲合力成分的影响，在低浓度的放射性标记的IL-15下分析了其影响。如图6B所示，在高至25nM的浓度下，sIL-15Ra-sushi不影响低浓度(200pM)的主要靶向高亲合力受体的IL-15的结合C图6B)。;故射性标记的sIL-15Rot-sushi与TF-ip细胞的结合(图6C)揭示了特异性结合成分，其严格依赖于rlL-15的存在。在lnMrlL-15的存在下，反映sIL-15Ra-sushi结合的Kd为3.5nM，该值与其对IL-15的亲合力一致，最大结合能力(3300位点/细胞)与IL-15中等结合位点的数目一致。如图6D进一步显示，放射性标记的sIL-15Ra-sushi祐L有效地内在化。；改射性标记的RLI融合蛋白还与TFlp细胞结合(图6E)。观察到单独的特异性结合成分，Kd为250pM,并且最大能力(4000位点/细胞)再次与IL-15中等亲合力结合位点相当。一旦结合，RLI也i皮有效地内在化(图6F)。讨论以前显示删除人IL-15Ra的外显子2会完全消除IL-15结合，这表明sushi结构域在细胞因子识别中的关键作用(25)。本发明显示，除去IL-15Ra胞外部分的C-末端尾部(外显子3至5)(在sIL-15Ra-IL-2融合蛋白的环境中)导致其与IL-15结合的亲合力下降10倍，如通过SPR所示；以及其亲合力下降3.5倍，如在竟争测定中所示。才艮据热力学，亲合力下降10倍^皮计算为对应于IL-15与IL-15Ra相互作用的自由能的10%损失。因此由外显子2编码的N-末端结构域(sushi结构域)带有大部分(90%)、但不是全部的IL-15结合能力。来自我们实验室的最近数据表明外显子3编码的结构域也有助于IL-15结合。大肠杆菌中产生的sIL-15Ra-sushi具有的亲合力比CHO细胞中产生的sIL-15Ra-sushi-IL-2的亲合力j氐3至4倍。由于sushi结构i或不含有任何N-或0-连接的糖基化的潜在位点(2)，因此该差异不能通过两种蛋白的糖基化状态的差异来解释。因此，这有可能是由于这两种蛋白的结构折叠的差异。当与IL-15竟争结合膜IL-15Ra时，发现sIL-15Ra-sushi通过增强IL-15作用而赋予激动剂效应，所述IL-15作用是经过IL-15(3/y复合物。对仅表达中等亲合力IL-15受体(Mo-7，32DP)或表达高亲合力和中等亲合力IL-15受体(TF-1(3，Kit225)的细胞的研究显示sIL-15Ra-sushi的激动剂作用特别指向IL-15RP"复合物(i)当不存在IL-15时其不具有影响，(ii)当存在IL-15时其与TF-lp细胞的单一亲合力类型的结合位点结合，所述结合位点的密度与中等IL-15结合位点的密度相当，(iii)在Mo-7细胞和TF-1(3细胞上，其增加IL-15对于IL-15R(3/y复合物的亲合力，但不影响TF-ip细胞上IL-15与高亲合力复合物的结合，(iv)其通过IL-15R卩/y增强Mo-7细胞上IL-15生物作用(增殖、预防凋亡)的效率，但不影响TF-lp细胞上通过高亲合力受体介导的相同生物作用。sIL-15Ra-sushi—旦与IL-15偶联结合于Mo-7细胞上的IL-15R(3/y，就;故有效地细胞内在化，该事实进一步支持了该激动剂作用的功能性。在ILR和RLI融合蛋白的环境中增强了其潜能(i)RLI与IL-15Rp/y结合的亲合力比IL-15本身好几乎20倍，(ii)RLI的结合之后跟随融合蛋白的快速内在化，(iii)在功能测定中，RLI或ILR融合蛋白比IL-15有效得多。这两种融合蛋白在Mo-7细胞上的剂量响应曲线与Kit225或TF-1(3细胞上IL-15通过高亲合力受体的剂量响应曲线相当，这表明这些融合蛋白在仅表达中等亲合力受体的细胞上几乎完全重新构成高亲合力响应。68因此所述结果表明sIL-15Ra-sushi和IL-15形成复合物，协同增加其对IL-15Rp/y受体的结合亲合力。相反，一旦IL-15已经与膜高亲合力受体复合物締合，则sIL-15Ra-sushi不能影响IL-15结合与生物活性。然而，不能排除，并且应该检验sIL-15Ra-sushi是否仍然能够与已经与该高亲合力复合物结合的IL-15结合，所述检验是使用主要表达高亲合力受体的细胞、即表达类似水平的这三种受体亚单位的细胞的可用度。我们的实-睑室以前显示了COS细胞中表达的sIL-15Ra或由IL-15Ra阳性细胞天然产生的sIL-15Ra表现为有效的拮抗剂，其以高亲合力与IL-15结合(Kd:166pM)并在低浓度(IC50为3pM至10pM)抑制IL-15诱导的Kit225细胞增殖(19)。这些结果与本发明相反，本发明显示sIL-15Ra-sushi不影响Kit225细胞或TF-lp细胞的增殖，并且是Mo-7细力包上的激动剂。另一相反的结果是最近的报道，显示rIL-15与重组人sIL-15Ra(缺乏外显子3)-Fc同型二聚体嵌合体的混合物会诱导Mo-7细胞上的抗凋亡效应，而单独的rIL-15在相同的剂量下没有影响(26)。为了解释这些作用的差异，在本申请的图7中提出了模型。在高亲合力IL-15响应的环境中，sIL-15Ra作为膜IL-15Ra的竟争物用于募集IL-15(图7A)。相反，sIL-15Ra-sushi与IL-15的复合物能够与膜IL-15R卩々締合并增强IL-15的生物效应(图7B)。为了解释sIL-15Ra-sushi在高亲合力受体的环境中不存在抑制效应，有两种选择(图7C)。根据第一选择，sIL-15Ra-sushi对IL-15具有比sIL-15Ra(Kd=160pM)低的亲合力(Kd-1.5nM,本文)(19),因此不能有效;也在Kit225或TF-lp细胞上与膜IL-15Ra竟争。才艮据第二选4奪，sIL-15Ra-sushi能够与膜IL-15Ra竟争与IL-15结合并与IL-15Rp/y形成类似于在Mo-7细胞上形成的复合物。这种复合物效率较低，这是由于它们需要较高浓度的IL-15才能活化(IC50-750pM，而对于高亲合力受体，IC50=20pM,图2和5)。然而，由于在Kit225或TF-lp细胞中IL-15Rp/y过量于IL-15Ra,这种复合物的较低效率可被其较高密度(TF-ip细胞上约3，000中等亲合力受体代替100高亲合力受体，参见图6)所补偿。这不会导致生物效应的可观测的变化。我们观测到sIL-15Ra-sushi不影响IL-15在TF-1(3细胞上的高亲合力结合(图6B),这在某种程度上倾向于第一选择。sIL-15Rot和sIL-15Ra-sushi之间的功能差异表明sIL-15Ra的C末端尾部在与膜IL-15Ra的竟争中、并因此在sIL-15Ra的拮抗剂作用中起关#:作用。该尾部或者阻止可溶性IL-15Ra与IL-15R(3/y締合，或者允许这种締合，但导致IL-15R(3/Y对于其机能不适当的构象。在可溶性普通Y链的情况下已提出了类似的机理(27)。通过除去该可溶性Y链(对应于Y链的全部胞外部分)的C-末端部分或通过WSXWS基序的突变而消除该可溶性Y链的抑制活性，所述C-末端部分和WSXWS基序是不涉及细胞因子结合的两个区域。Sushi的激动剂效应暗示对于细胞因子的广大IL-6家族中的可溶性受体(即sIL-6R、sIL-llR、sCNTFR和IL-12p40亚单位)所述的、激动剂效应(28)。然而，对于IL-15R，不能期待这样的激动剂作用，这是由于yc家族中目前所述的所有可溶性受体(sIL-2Ra、sIL-2Rp、sIL-4R)以及sIL-15Ra本身作为细胞因子拮抗剂起作用(19,29)。本结果因此将IL-15Ra的可溶性sushi结构域识别为该家族中意外的和有效的5敫动剂。细胞因子跨信号转导(tmnssignaling)的概念首先被用在IL-6的情况中，其中显示可溶性IL-6R可增强IL-6响应细月包对IL-6作用的敏感性并可使表达gpl30但不表达膜IL-6R的细胞对IL-6响应(30)。该概念已被扩展至gpl30细胞因子家族的其它成员(IL-11R、CNTFR、CLC)(31-34)。在IL-15的情况下，已显示了细胞因子转呈递的机理(12),其中由单核细胞/树突细胞产生的IL-15与由相同细胞表达的膜IL-15Ra締合并能够刺激IL-15Rp/Y+IL-15RoT旁观者细胞的增殖。最近的才艮道提出转呈递是体内的支配性机理，这使得由相同细胞表达IL-15和IL-15Ra成为必要(13、14、35、36)。其与跨信号转导概念有某些相似性，其中转呈递的IL-15/IL-15Ra复合物能够使IL-15R卩//IL-15Ra-细胞对IL-15的生理浓度敏感。在这方面，膜IL-15Ra通过增加IL-15对IL-15Rp/y复合物的亲合力和发信号的效率而作为IL-15作用的;敫动剂(12)。我们的数据显示，sIL-15Ra-sushi的行为是类似的并4吏IL-15Rp//IL-15Ra—细胞对IL-15的作用敏感。这暗示膜IL-15Ra的sushi结构域对转呈递是关键的。我们已显示由IL-15Ra表达细胞产生的并包涵IL-15Ra全部胞外部分的sIL-15Ra可抑制IL-15作用(19)。它很可能建立负反馈机理，限制IL-15的生物效应。相反，本研究中描述的sIL-15Ra-sushi显示激动剂效应。若这种可溶性sushi是由IL-15Ra表达细胞产生的，则其能够参与IL-15转呈递机理。这种天然产生的可溶性sushi结构域的存在还未被描述过，但被下列事实支持(i)已描述了膜IL-15Ra的不同亚型，包括某些连接sushi结构域于S争膜结构域的缺乏尾部(由外显子3至5编码)的亚型(3、25、37),以及(ii)已证明了它们中某些的可溶性对应物通过脱落的产生(19)。因it匕，sIL-15Ra和sIL-15Ra-sushi可能具有相反的调节效应，并且因此二者均参与调整比-15生物作用的大小和持续时间。本发明还显示，在IL-15的情况下使用柔性连接区以产生诸如ILR或RLI的融合蛋白是有效的方法。产生了带有sushi结构域的IL-15的分子模型(图2)，其帮助设计能够连接IL-15的C-末端与sushi的N-末端(ILR融合蛋白)或相反(RLI融合蛋白)的柔性连接区。该模型还预测所述连接区不遮盖IL-15中涉及与IL-15Rp和y链连接的区域。如上文所讨论的，这两种融合蛋白证明比IL-15以及IL-15加sIL-15Ra-sushi的组合在活化Mo-7细胞上的IL-15Rp/y复合物方面活泼得多。在TF-113细胞上，以及在高亲合力受体活化的环境中，ILR融合蛋白与IL-15同样活泼，并且RLI融合蛋白甚至更活泼IO倍，其EC50在诱导细月包增殖中低至1.2pM。由于其高活性，这些超-IL-15融合蛋白看来构成用于扩充淋巴细胞子集的有用工具，尤其是那些细胞(NK、CD8记忆T细胞)，其中IL-15的转呈递^皮暗示为生理学活化过程(13)。它们因此是针对患有癌、免疫缺陷或感染性疾病的患者的治疗的治疗策略中非常有效的佐剂分子。1.Grabstein,K.H.，Eisenman,J,，Shanebeck,K.，Rauch，C.,Srinivasan,S.,Fung,V.，Beers,C.,Richardson,J.,Schoenbom,M.A.，Ahdieh,M.，andetal.(1994)264，965-9682.Giri，J.G,，Ahdieh,M.，Eisenman，J.，Shanebeck,K,，Grabstein,K.，Kumaki，S.,Namen,A.，Park,L.S.，Cosman，D.，andAnderson,D.(1994)五m6oJ13,2822-28303.Anderson,D.M.，Kumaki，S.,Ahdieh,M.,Bertles，J.，Tometsko,M.,Loomis,A.,Giri,J.,Copeland,N.G.，Gilbert,D.J.,Jenkins,N.A.，andetal,(1995)J历o/CAem270，29862-298694.Burton,J,D.,Bamford,R.N.，Peters,C.,Grant,A.J.，Kurys,G.，Goldman,C.K.,Breiman,J.,Roessler,E.,andWaldmann,T.A.(1994)iVoc胸"ca"".t/"91,4935-49395.Carson，W.E.，Giri,J.G.,Lindemann,M.J.，Linett,M.L.,Ahdieh,M.,Paxton，R.,Anderson,D,，Eisenmann,J.，Grabstein,K,，andCaligiuri,M.A.(1994)J五jc;180,1395-14036.Wilkinson,P.C.，andLiew，F.Y.(1995)/~181，1255-12597.Kennedy，M.K.，Glaccum,M.,Brown,S.N.，Butz,E.A.，Viney，J.L.，Embers,M.，Matsuki，N.,Charrier,K.,Sedger，L.,Willis,C.R.,Brasel，K.，Morrissey，P.J.，Stocking,K.,Schuh，J.C.，Joyce,S.，andPeschon，J.J.(2000)191,771-7808.Lodolce，丄P.，Burkett，P.R.，Boone，D.L，Chien，M.,andMa，A.(2001)/￡jc/7M^/194，1187-11949.Marks-Konczalik，J.，Dubois,S.,Losi,J.M.，Sabzevari,H.,Yamada，N.，Feigenbaum，L,Waldmann,T.A.,andTagaya,Y.(2000)尸麼扁細d》"J97，11445-1145010.Ku,C.C.,Murakami,M.，Sakamoto,A.，Kappler，J.，andMarmck，P.(2000)288,675-67811.Li,X.C.，Demirci,G.，Ferrari-Lacraz，S.，Groves,C.,Coyle,A.,Malek，T.R.,andStrom,T.B.(2001)M/MW7，114-11812.Dubois,S.，Mariner,J.，Waldmann，T.A.，andTagaya,Y。C200"/mmwmXy17,537-54713.Burkett,P.R.，Koka,R.，Chien,M.，Chai，S.，Chan,F.,Ma，A。，andBoone，D.L.(2003)Pracf/S^100，4724-472914.Schluns,K.S.，Nowak，E.C.，Cabrera-Hernandez,A,，Puddington,L,,Lefrancois,L.，andAguila,H.L.(2004)M^/Jcad<Scz.t/"101，5616-562115.Kobayashi,H.，Dubois,S.，Sato,N.，Sabzevari,H.，Sakai，Y。,Waldmann,T.A.,andTagaya,Y.(2005)5/oo</105,721-72716.Norman,D.G.，Barlow,P.N.，Baron,M.，Day,A.J,，Sim，R,B.,andCampbell,I.D.(1991)J編編219，717-72517.Schulz,O,，Sewell,H.F.,andShakib，F.(1998)JE"jc;187，271-27518.Sheu,B.C.，Hsu，S.M.，Ho,H.N.,Lien,H.C,，Huang,S。C。，andLin，R.H.(2001)C匿w61,237-24219.Mortier，E.，Bernard,J.，Plet,A.，andJacques,Y.(2004)//mm画/173，1681-168820.Ruchatz，H.,Leung,B.P.，Wei,X.Q.,Mclnnes，I.B.，andLiew，F.Y.(1998)//www"o/160，5654-566021.Smith,X.G.，Bolton,E.M.,Ruchatz，H.，Wei，X.,Liew,F.Y.，andBradley,J.A.(2000)J/mm画/165，3444-345022.Farner，N.L，Gan，J.,deJong,J.L.,Leary，T.P.,Fenske,T.S.，Buckley,P.，Dunlap，S.，andSondel，P.M.(1997)C,to9，316-32723.Bernard,J.,Harb，C.，Mortier,E.,Quemener，A.,Meloen，R,H.,Vermot-Desroches,C.，Wijdeness，J.,vanDijken,P.,Grotzinger,J.,Slootstra,J.W.，Plet，A.，andJacques,Y.(2004)/5zo/CAe附279,24313-2432224.Matsumoto，M.,Misawa,S.,Tsumoto,K.,Kumagai，I.,Hayashi,H.，andKobayashi,Y.(2003)iVoto'w_Pwn/31,64-717325.Dubois,S.，Magrangeas,F.,Lehours,P.，Raher，S.，Bernard,J.,Boisteau,O.，Leroy,S.,Minvielle,S.,Godard,A.,andJacques,Y.(1999)/^o/C&m274，26978-2698426.Giron-Michel,J.,Giuliani,M.,Fogli，M,，Brouty-Boye,D.，Ferrini,S,，Baychelier，F.，Eid,P.,LebousseKerdiles,C.,Durali,D.,Biassoni,R.，Charpentier,B.，Vasquez,A.，Chouaib,S.，Caignard，A.，Moretta，L,andAzzarone，B.(2005)27.Meissner，U.，Blum,H.,Schnare，M.，Rollinghoff,M.，andGessner，A.(2001)97,183-19128.Jones,S.A.,andRose-John,S.(2002)5z'oc/n'm丑z.o/A少51v4Ca1592,251-26329.Heaney，M.L,，andGolde，D.W.(1998)/Zet/A:oc5zo/64，135-14630.Rose-John,S.，andHeinrich,P.C.(1994)5i'o由m/300(Pt2)，281-29031.Pflanz，S,,Tacken，I.,Grotzinger，J.,Jacques,Y.,Minvielle,S.，Dahmen，H.，Heinrich，P.C.，andMuller-Newen,G.(1999)i^5S丄C450,117-12232.Davis,S.,Aldrich，T.H.，Ip，N.Y.，Stahl，N.,Scherer，S.,Farruggella，T.，DiStefano,P.S.，Curtis,R,，Panayotatos,N.,Gascan，H.,andetal.(1993)259,1736-173933.Karow,J.,Hudson,K.R.,Hall，M.A.，Vernallis，A.B.，Taylor,J.A.,Gossler，A.,andHeath,J.K.(1996)所oc/^;w/318(Pt2)，489-49534.Elson,G.C.，Lelievre,E.,Guillet,C.,Chevalier,S.，Plun-Favreau,H.,Froger，J.，Suard，I.，deCoignac,A.B.,Delneste,Y.,Bonnefoy,J.Y.，Gauchat,J.F.,andGascan,H.(2000)iVe"msc/3，867-87235.Sandau,M.M.，Schluns,K.S.，Lefrancois，L.,andJameson,S.C.(2004)J/m淤i/"o/173，6537-654136.Koka,R.,Burkett，P.R.，Chien，M,,Chai,S.,Chan,F.，Lodolce,J.P.,Boone，D.L.,andMa，A,(2003)/Ex;M^/197,977-98437.Bulanova,E.,Budagian，V,，Orinska,Z.，Krause，H.,Paus，R,，andB函ne隱Paus，S.(2003)//mm歸/170，5045-505538.Fischer,M.,Goldschmitt,J.，Peschel，C.,Brakenhoff,J.P.，Kallen，K.J.，Wollmer,A.，Grotzinger,J.，andRose-John,S.(1997)胸5/o欣/mo/15,142-145表4:SEOIDNO列表hlL-15Rc^人IL-15Ro;hlL-2=人IL-2<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>权利要求1.用于刺激IL-15Rβ/γ信号通路、从而诱导和/或刺激诸如NK和/或T细胞的IL-15Rβ/γ阳性细胞的活化和/或增殖的化合物，其特征在于其包含直接或间接共价连接到至少一个含有IL-15Rα胞外区的sushi结构域的多肽上的至少一个IL-15Rβ/γ结合体，其中-所述至少一个IL-15Rβ/γ结合体是IL-15，或者是IL-15片段、模拟物或激动剂，其中所述IL-15片段、模拟物或激动剂结合IL-15Rβ/γ的亲合力不显著低于天然IL-15结合IL-15Rβ/γ的亲合力，以及-所述至少一个含sushi多肽的氨基酸序列是IL-15Rα胞外区的氨基酸序列，或是IL-15Rα胞外区片段的氨基酸序列，其中所述片段保留了所述IL-15Rα胞外区的sushi结构域，其中所述sushi结构域定义为起始于第一外显子2编码的半胱氨酸残基(C1)，并终止于第四外显子2编码的半胱氨酸残基(C4)，残基C1和C4均包括在所述sushi结构域中，或是变体氨基酸序列，其在所述胞外区或胞外区片段的氨基酸序列全长上与这样的IL-15Rα胞外区或这样的IL-15Rα胞外区片段的氨基酸序列具有至少85％的同一性，前提是所述sushi结构域的所述4个半胱氨酸残基(C1、C2、C3和C4)的每一个均保留在所述变体序列中。2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于所述IL-15Ra是人IL-15Ra、或猴IL-15Ra、或鼠IL-15Ra、或兔IL-15Ra、或猪IL-15Ra。3.如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于所述IL-15Ra胞外区的所述氨基酸序列是人IL-15Ra胞外区SEQIDNO:40的序列、黑猩猩IL-15Ra胞外区SEQIDNO:80的序列、小家鼠IL-15Ra胞外区SEQIDNO:74的序列或IL-15Ra胞外区SEQIDNO:86的序列。4.如权利要求1至3中任一权利要求所述的化合物，其特^E在于所述sushi结构域的氨基酸序列是人IL-15Rasushi结构域SEQIDNO:14的序列、黑猩猩IL-15Rasushi结构域SEQIDNO:81的序列、小家鼠IL-15Rasushi结构域SEQIDNO:75的序列或IL-15Rasushi结构域SEQIDNO:87的序列。5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的化合物，其特征在于所述IL-15Ra胞外区片段包含-由所述IL-15Rce的外显子2和3编码的IL-15Ra胞外区部分，或-保留所述sushi结构域的这种外显子2至3编码部分的片^:。6.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述外显子2编码的序列是國人胞外IL画15Ra的外显子2编码部分，为序列SEQIDNO:24，-黑猩猩胞外IL-15Ra的外显子2编码部分，为序列SEQIDNO:98，-小家鼠胞外IL-15Ra的外显子2编码部分，为序列SEQIDNO:97，-褐家鼠胞外IL-15Ra的外显子2编码部分，为序列SEQIDNO:99。7.如权利要求5或6所述的化合物，其特征在于所述外显子3编码的序列是-人胞外IL-15Ra的外显子3编码部分，为序列SEQIDNO:93，画黑猩猩胞外iL-15Ra的外显子3编码部分，为序列SEQIDNO:95，画小家鼠胞外IL-15Rce的外显子3编码部分，为序列SEQIDNO:94，-褐家鼠胞外IL-15Ra的外显子3编码部分，为序列SEQIDNO:96。8.如权利要求1至6中任一权利要求所述的化合物，其特征在于所述IL-15Ra胞外区片,爻由下列部分组成-由所述IL-15Ra的外显子2编码的IL-15Ra胞外区部分，或-保留所述sushi结构域的这种外显子2编码部分的片段。9.如权利要求1至7中任一权利要求所述的化合物，其特征在于所述IL-15Ra胞外区片段包含由所述IL-15Ra的外显子2编码的IL-15Rce胞外区部分，并且还包含至少一个来自由所述IL-15Ra的外显子3编码的序列的氨基酸。10.如权利要求9所述的化合物，其特征在于所述IL-15Ra月包外区片段由下列部分组成-由所述IL-15Ra的外显子2和3编码的IL-15Ra胞外区部分，或-由所述IL-15Ra的外显子2编码的IL-15Ra胞外区部分，以及由所述IL-15Ra的外显子3编码的所述IL-15Ra胞外区部分的片,殳。11.如权利要求1至10中任一权利要求所述的化合物，其特征在于，所述IL-15Ra胞外区片段是还包含下列成分的IL-15Ra片段-所述IL-15Ra的铰链区，或-所述铰链区的片段，其中所述IL-15Ra铰链区的氨基酸序列是■人IL-15Ra铰链序列SEQIDNO:20，画黑猩猩IL画15Ra铰链序列SEQIDNO:82，國小家鼠IL画15Ra铰链序列SEQIDNO:76,或-褐家鼠IL-15Ra铰链序列SEQIDNO:88。12.如权利要求11所述的化合物，其特征在于所述至少一个含sushi多肽是多肽SEQIDNO:30。13.如权利要求11所述的化合物，其特征在于所述人IL-15Ra铰链区片段的氨基酸序列包含i或ir或ird。14.如权利要求13所述的化合物，其特征在于所述至少一个含sushi多肽是SEQIDNO:22、24、26、28的多肽。15.如权利要求1至7、9至11中任一权利要求所述的化合物，其特征在于所述人IL-15Ra胞外区片段还包含-人IL-15Ra的富含糖基化位点的区域的外显子3编码部分，所述外显子3编码部分是序列SEQIDNO:34，或-SEQIDNO:34的片段。16.如权利要求15所述的化合物，其特征在于所述至少一个含sushi多肽是多肽SEQIDNO:36。17.如权利要求5-7、9-11、13、15所述的化合物，其特征在于所述IL-15Ra胞外区片段还包含-由不同于外显子1、2、3的一个或数个IL-15Ra胞外外显子编码的胞外IL-15Ra部分，或-这种部分的片段。18.如权利要求1至17中任一权利要求所述的化合物，其特征在于其包含与所述至少一个含sushi多肽、或与所述至少一个IL-15Rj8/7结合体直接或间接连接的信号肽。19.如权利要求1至18中任一权利要求所述的化合物，其特征在于所述IL-15是人IL-15。20.如权利要求19所述的化合物，其特征在于所述人IL-15的氨基酸序列是序列SEQIDNO:48。21.如权利要求1至20中任一权利要求所述的化合物，其特征在于所述至少一个IL-15R]3Ay结合体不与IL-2Rce结合。22.如权利要求1至21中任一权利要求所述的化合物，其特征在于所述至少一个含sushi多肽直接连接于所述至少一个IL-15R]8Ay结合体。23.如权利要求1至21中任一权利要求所述的化合物，其特征在于所述至少一个含sushi多肽间接连接于所述至少一个IL-15R/3Ay结合体。24.如权利要求23所述的化合物，其特征在于所述至少一个含sushi多肽通过含有至少一个氨基酸、但少于30个氨基酸的肽连接区与所述至少一个IL-15Rj3Ay结合体连接。25.如权利要求24所述的化合物，其特征在于所述肽连接区的氨基酸序列是序列SEQIDNO:50或NO:52。26.如权利要求1至25中任一权利要求所述的化合物，其特征在于，所述至少一个含sushi多肽位于相对于所述至少一个IL-15Ri8Ay结合体的N-末端位置。27.如权利要求1至25中任一权利要求所述的化合物，其特征在于所述至少一个含sushi多肽位于相对于所述至少一个IL-15R//7结合体的C-末端位置。28.如权利要求1至7、9至12、18至21、23至25、26中任一权利要求所述的化合物，其特征在于其氨基酸序列是序列SEQIDNO:60。29.如权利要求1至7、9至12、18至21、23至25、27中任一^L利要求所述的化合物，其特征在于其氨基酸序列是序列SEQIDNO:62。30.编码用于刺激IL-15R]8Ay信号通路、从而诱导和/或刺激_渚如NK和/或T细胞的IL-15RjSAy-阳性细胞的活化和/或增殖的化合物的核酸，其特征在于其依照通用遗传密码、适当考虑其简并性而编码;〖又利要求1至29中任一权利要求所述的化合物。31.载体，其特征在于其包含至少一个如权利要求30所述的核酸。32.宿主细胞，其由权利要求30的核酸和/或权利要求31的载体转化或转染。33.如权利要求32所述的宿主细胞，其特征在于其为哺乳动物细胞。34.用于免疫治疗组合物的佐剂，其特征在于其包含下列要素中至少一个要素-权利要求1至29中任一权利要求所述的化合物，-权利要求30所述的核酸，-权利要求31所述的载体，-权利要求32或33所述的宿主细胞。35.如权利要求34所述的佐剂，其特征在于其改善CD8记忆响应。36.药物组合物，其特征在于其包含下列要素中至少一个要素-权利要求1至29中任一权利要求所述的化合物，-权利要求30所述的核酸，-权利要求31所述的载体，-权利要求32或33所述的宿主细胞。37.药物，其特征在于其包含下列要素中至少一个要素-权利要求1至29中任一权利要求所述的化合物，-权利要求30所述的核酸，-权利要求31所述的载体，-权利要求32或33所述的宿主细胞。38.如权利要求37所述的药物，其特征在于其为预防性和/或緩解性和/或治疗性疫苗组合物。39.如权利要求37或38所述的药物，其特征在于其用于预防和/或緩解和/或治疗肿瘤发展或存在。40.如权利要求39所述的药物，其特征在于其还包含至少一个肿瘤抗原。41.如权利要求37或38所述的药物，其特征在于其用于预防和/或緩解和/或治疗感染性疾病。42.如权利要求37或38所述的药物，其特征在于其用于预防和/或緩解和/或治疗免疫缺陷。43.如权利要求37或38所述的药物，其特征在于其用于预防和/或緩解和/或治疗SCID-X。44.用于诱导和/或刺激IL-15R/5/7-阳性细胞的增殖和/或活化的体外方法，其特征在于其包含-提供包含IL-15R/3Ay-阳性细胞的细胞样品，-使所述样品与至少一个下列要素在能够实现所述接触的环境条件下接触一段时间，以诱导和/或刺激所述IL-15Ri3-阳性细胞的增殖和/或活化-权利要求1至29中任一权利要求所述的化合物，-权利要求30所述的核酸，-权利要求31所述的载体，-权利要求32或33所述的宿主细胞。45.产生活化NK细胞和/或T细胞的体外方法，其特征在于其包含'.-提供包含休眠NK细胞和/或T细胞的细胞样品，-使所述样品与至少一个下列要素在能够实现所述接触的环境条件下接触一段时间，以诱导包含在所述样品中的所述休眠NK和/或T细胞的活化-权利要求1至29中任一权利要求所述的化合物，-权利要求30所述的核酸，-权利要求31所述的载体，-权利要求32或33所述的宿主细胞。46.组合物，其特征在于其包含隱至少一个IL-15R/5/7结合体，以及-至少一个包含IL-15Ra胞外区sushi结构域的多肽，其中所述至少一个IL-15R|3Ay结合体不与所述至少一个包含IL-15Ra胞外区sushi结构域的多肽共价连接，其中-.國所述至少一个IL-15R/3Ay结合体是IL-15,或者是IL-15片段、模拟物或激动剂，其中所述IL-15片段、模拟物或激动剂结合IL-15R/3/7的亲合力不显著低于天然IL-15结合IL-15R]3Ay的亲合力，以及-所述至少一个含sushi多肽的氨基酸序列是IL-15Ra胞外区的氨基酸序列，或是IL-15Ra胞外区片段的氨基酸序列，其中所述片段保留了所述IL-15Ra胞外区的sushi结构域，其中所述sushi结构域定义为开始于第一外显子2编码的半胱氨酸残基(C1),并终止于第四外显子2编码的半胱氨酸残基(C4),残基Cl和C4均包括在所述sushi结构域中，或是变体氨基酸序列，其在所述胞外区或胞外区片段的氨基酸序列的全长上与这样的IL-15Ra胞外区或这样的IL-15Ra胞外区片段的氨基酸序列具有至少85%的同一性，前提是所述sushi结构域的所述4个半胱氨酸残基(C1、C2、C3和C4)的每一个均保留在所述变体序列中。47.至少一个含有IL-15Ro;胞外区的sushi结构域的多肽在制备用于诱导和/或刺激NK和/或T免疫反应的增殖和/或活化的药物中的用途，其中所述至少一个含sushi多肽的氨基酸序列是IL-15Rce胞外区的氨基酸序列，或是IL-15Ra胞外区片段的氨基酸序列，其中所述片段保留了所述IL-15Ra胞外区的sushi结构域，其中所述sushi结构域定义为开始于第一外显子2编码的半胱氨酸残基(C1),并终止于第四外显子2编码的半胱氨酸残基(C4),残基Cl和C4均包括在所述sushi结构域中，或是变体氨基酸序列，其在所述胞外区或胞外区片段的氨基酸序列的全长上与这样的IL-15Ra胞外区或这样的IL-15Ra胞外区片段的氨基酸序列具有至少85%的同一性，前提是所述sushi结构域的所述4个半胱氨酸残基(C1、C2、C3和C4)的每一个均保留在所述变体序列中。全文摘要本发明涉及刺激IL-15Rβ/γ信号通路、从而诱导和/或刺激诸如NK细胞和/或T细胞的IL-15Rβ/γ阳性细胞的活化和/或增殖。适当的化合物包括包含至少一个IL-15Rβ/γ结合体的化合物，所述结合体与至少一个含有IL-15Rα胞外区的sushi结构域的多肽直接或间接共价连接。文档编号C07K14/715GK101360827SQ200680048358公开日2009年2月4日申请日期2006年10月6日优先权日2005年10月20日发明者帕特里夏·武塞欧,扬尼克·雅克,爱尔文·莫提尔,艾瑞恩·卢莱特,阿涅丝·凯梅内申请人:国立医学与健康研究所