专利名称：一种siRNA在制备调控肿瘤细胞分裂周期药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一个生存素survivin基因为靶标的小分子干扰RNA(siRNA)在制备调控肿瘤细胞周期药物中的用途。
背景技术：
RNA干扰技术(RNAi)是近几年发展起来的被认为是研究功能基因组最有力工具之一。这种新兴的生物技术为肿瘤分子水平的基因治疗提供了新的技术和方法。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)dsRNA)介导的转录后的基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)现象。通过在多种生物细胞内导入外源或内源的dsRNA可以使内源性mRNA发生特异性降解，从而引起相应基因转录的阻抑。RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。恶性肿瘤是当前威胁人类生命健康的主要杀手之一，目前还没有找到真正有效的根治方法，这迫使科研工作者不断寻找新的技术和方法，试图从根本上攻克癌症。
Survivin是1997年耶鲁大学Aitieric.DC等人在人类基因组库中首先筛选分离出来的IAP(凋亡抑制蛋白)家族的一个成员。它定位于17q25，该基因几乎在所有种类的肿瘤组织中特异性地表达，而正常组织几乎没有表达；该基因在肿瘤细胞中高表达后，不但促进肿瘤细胞抗凋亡、促进肿瘤细胞有丝分裂、参与血管形成和放化疗耐受多种功能，而引起了国内外学者的广泛关注。
有研究者(.Lab Invest，1999，79(11)1327-1333；Am J Pathol，1998，152(1)43-49)对正常增殖细胞中survivin基因的潜在分布进行研究发现包括皮肤表面的角化细胞、肠道的上皮细胞和正常的骨髓细胞在内，在各种有丝分裂细胞系中均没有检测到survivin基因的表达；survivin具有在肿瘤组织中表达特异性强、表达率高，而在正常组织中不表达的特点以及在肿瘤的发生、发展及抗药性等诸多方面所扮演的重要角色而使它很有可能成为肿瘤基因治疗理想的新靶点。
肿瘤的难治还在于肿瘤的天然耐药以及后期治疗时产生的耐受。肿瘤本身高表达survivin能保护化疗药和放射线对肿瘤的杀伤相反，不足量的化疗药或放射线也能诱导survivin的表达，产生对治疗的继发耐受。研究表明，survivin能抑制某些化疗药物、IL-3，TNF-a，X射线诱导的Fas，Caspase，Bax等参与的凋亡信号通路(Cancer Res，1998，58(23)5315-5320；J CancerRes，2000，91(11)1204-1209)。但假如其唯一的BIR区发生C84A的突变，survivin也就丧失对抗化疗药物Taxol诱导的凋亡的抵抗作用。
血管形成过程取决于血管内皮细胞生存和凋亡的平衡。正常情况下，血管内皮细胞中很难检测到survivin。在血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的刺激下，静止的血管内皮表达survivin的能力约可增强4倍，VEGF的许多抗凋亡活性都是通过诱导内皮细胞表达survivin来实现的(Am J Pathol，2001，158(5)1757-1765)。血管生成素一1(angiopoietin-1，Ang-1)是胚胎血管形成过程中维持血管稳定性和管腔形成的关键因子。它没有促进内皮细胞生长，而只促进了血管网的稳定和分枝血管的形成。研究发现，Ang-1可以促进内皮细胞中survivin表达，通过Akt(或蛋白激酶B)途径激活survivin的抗凋亡活性，从而阻止内皮细胞凋亡，在体内血管形成过程中稳定血管结构(J Biol Chem，2000，275(3)9102-9105)。新血管生成是肿瘤生长和转移的必要因素，因此抑制survivin的表达可能对防止肿瘤细胞的浸润、迁移起重要作用。己有多项动物实验证明，反义survivin RNA或survivin突变体可以有效抑制实体瘤的血管形成和肿瘤的侵袭增殖。因此，survivin基因可以作为肿瘤治疗的新靶点。
最早的针对survivin的RNAi研究报导于2003年，Carvalho等用小分子干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)转染HeLa细胞，60h后蛋白印迹结果显示治疗组中己检测不到survivin的表达，细胞增殖明显受抑，部分细胞有丝分裂受到阻滞，出现凋亡(J Cell Sci，2003，116(14)2987-2998)。随着RNAi技术的不断完善，由原来直接导入外源的siRNA，发展到真核表达载体转录产生siRNA，以及用于RNAi的病毒载体的出现，大大提高了转染效率和干扰效率。Cheng等用靶向survivin基因的RNAi真核载体转染肝细胞癌SMMC7721细胞，发现转染细胞中几乎没有survivin基因的表达，转染细胞自发的凋亡增加，G2/M期细胞比例减少，细胞增殖减慢(World J Gastroenterol 2005，11(5)756-759)。目前针对survivin的RNAi研究进展迅速，体外实验显示了良好的效果，相信不远的将来会有更为丰富和完善的研究结果出现。
应用RNA干扰技术，以小分子RNA作为靶向药物，有针对性地对survivin基因的转录后表达进行干扰，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的有丝分裂，抑制肿瘤转移时的血管形成和降低肿瘤细胞放化疗的耐受性，多层次，多途径对肿瘤进行抑制，这可能成为了一种新的肿瘤治疗策略。而且survivin基因选择性地表达在几乎所有种类的肿瘤组织中，而正常组织几乎不表达，则可使这种基因治疗对正常组织和细胞的毒副作用降到最低，应用RNAi特异地抑制survivin等肿瘤相关基因的表达有望成为一种新的肿瘤基因治疗方式。
发明内容
本发明公开了一种高效的针对survivin基因的广谱的小分子干扰RNA(siRNA)调控肿瘤细胞分裂周期药物，由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成 正义链5′-AAAGCAUUCGUCCGGUUGCtt-3′， 反义链3′-ttUUUCGUAAGCAGGCCAACG-5′ 其中X代表tt、TT或UU。t代表脱氧胸腺嘧啶dT。
X优选代表tt。
本发明的小分子干扰RNA是主要针对survivin基因开放阅读框(ORF)的功能保守区设计的双链siRNA，药理试验证明本发明的小分子干扰RNA具有广谱的抗肿瘤作用，对肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌细胞在体外均有抑制作用，该序列的正义链与survivin基因的mRNA结合，干扰survivin基因mRNA的翻译，从而抑制肿瘤细胞分裂，使肿瘤细胞分裂阻滞在G2/M期，达到治疗肿瘤的目的。本发明是一种全新作用机制的抗肿瘤新型药物，可能为肿瘤的治疗带来了新的希望。
本发明所述的肿瘤疾病包括肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌细胞。
在临床使用中，可以将本发明小分子干扰RNA(简称CPUsiRNA4)溶于不含RNA酶的无菌水中，轻轻混匀，建议CPUsiRNA4为10微克/微升。取适量CPUsiRNA4与小分子干扰RNA转染试剂RNAi-Mate混合，在室温温育30分钟，以形成CPUsiRNA4-RNAi-Mate复合物。将制备好的CPUsiRNA4-RNAi-Mate复合物按5-500nmol/kg静脉给药，一天一次，20天左右一个疗程。
图1是PCR检测本发明小分子干扰RNA对肺癌细胞株A549、肝癌细胞株SMMC7721和宫颈癌细胞株Hela的survivin基因的mRNA水平的抑制 图2是Westernblot检测本发明小分子干扰RNA对肺癌细胞株A549、肝癌细胞株SMMC7721和宫颈癌细胞株Hela的Survivin蛋白质的抑制 图3是流式细胞仪检测本发明小分子干扰RNA抑制肺癌细胞株A549、肝癌细胞株SMMC7721和宫颈癌细胞株Hela分裂，使它们阻滞在G2/M期
具体实施例方式 实施例1 siRNA的设计与合成 仪器OligoPilot II DNA/RNA Synthesizer(瑞典Pharmacia公司)，HP-1100型高效液相色谱仪(美国惠普公司)，DU2640紫外分光光度计(美国Backman公司)。
材料和试剂合成柱(6.3mL)，分子筛(3A Sigma)，30HL载体(批号256723)，RNA Pac PA100分析柱(美国Dionex公司)，5种核苷酸单体(A，U，C，G，dT)，乙腈，二氯乙酸，四唑，N2甲基咪唑，除注明厂家外，其余为瑞典Pharmacia公司产品。
siRNA的设计根据survivin基因开放阅读框(ORF)的序列，设计小分子干扰RNACPUsiRNA4和1对负对照siRNA，将他们的序列在人类EST数据库中比对，确定没有与他们相同的其它基因序列。CPUsiRNA4正义链5′-AGCAUUCGUCCGGUUGCGCtt-3′，反义链3′-ttUCGUAAGCAGGCCAACGCG-5′。负对照siRNA的正义链5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’，反义链5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’。siRNA的设计后送上海吉马公司合成。
siRNA的化学合成用乙腈将5种单体(A，U，C，G，dT)配制成0.2mol/L溶液，分别将5种单体、乙腈、二氯乙酸、四唑安装到合成仪相应位置，其中单体、乙腈、四唑应加入适当分子筛。合成步骤(1)利用二氯乙酸处理结合于固相载体的核苷酸或寡核苷酸，脱去其5’羟基官能团上的二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基团，露出反应性的5’端；(2)偶联反应由四唑催化完成，形成3’→5’磷酸酯链；(3)封闭反应将未反应5’羟基在N2甲基咪唑催化下由乙酸酐来完成。RNA合成仪按照设计好的程序合成出CPUsiRNA4和负对照siRNA的单链RNA。应用紫外分光光度计检测D 260nm值，并计算产量。
合成粗产品的HPLC色谱分析色谱柱DNA 2Pac PA 2100(4mm×250mm)；样品20OD/m L，进样的量20μL；流动相A25mmol/L Tris，1mmol/LEDTA，10％乙腈，pH8；流动相B25mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，3mol/L NH4Cl，pH 8；洗脱梯度流动相B在40min内从10％到70％；流速1mL/min；检测波长260nm；柱温50℃。
合成的单链RNA的正义链和反义链后，退火成双链的CPUsiRNA4和负对照siRNA，之后进行HPLC纯化的纯度大于97％的双链CPUsiRNA4和负对照siRNA。
实施例2 抗肿瘤药效学试验 材料和方法 肺癌A549、胃癌SGC7901、肝癌SMMC7721、乳腺癌MDA-MB-231、宫颈癌Hela细胞株由本实验室保存，转染试剂Lipofectamin TM 2000购自Invitrogen公司，Taq DNA聚合酶，dNTP、DNA Marker和蛋白质Marker购于Takara公司。Survivin蛋白的兔抗人抗体，HRP-羊抗兔IgG抗体、DAB显色试剂盒购于武汉博士德公司。
细胞培养肺癌A549、胃癌SGC7901、肝癌SMMC7721、乳腺癌MDA-MB-231、宫颈癌Hela细胞株在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，37℃，5％ CO2的培养箱中培养。
MTT法将2.5×106/L细胞接种于96孔板，每孔180μl，每组平行3孔，并设立空白，阴性药对照。44h后，弃去上清，每孔加20μL新配制的5g/L MTT，孵育4h，弃去上清液，加150μL DMSO溶解，混匀后用Bio-Rad型号的酶标仪490nm波长测定。
RT-PCR按Trizol说明书进行培养细胞总RNA抽提RT采用说明书M-MLV逆转录酶体系，PCR扩增采用20μL反应体系。PCR扩增条件为94℃变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环。
Westernblot检测干扰效应转染后48h取出六孔板，吸干RPMI-1640培养液，加入500μL胰酶的溶液，待细胞消化后加入1mL PBS溶液，反复吹打将细胞冲下来，把细胞悬液转入1.5mL EP管中，1000r/min离心5min收集细胞沉淀，加入60μL预冷的细胞裂解液，反复吹打将细胞充分混匀，冰浴中放置40min，10000r/min 4℃离心10min，取上清置于-70℃保存。蛋白的分离采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，12％的分离胶和5％的浓缩胶，细胞蛋白采用稀释的5×蛋白质的上样缓冲溶液，经100℃ 4min变性后加样，上样量均为20μL，恒压120V至溴酚蓝迁移至凝胶底部，取下凝胶，置转膜缓冲液中平衡10min，覆盖经处理的PVDF膜，采用半干转移系统，按1毫安/每平方厘米恒流转移3h将蛋白转移至膜上，将PVDF膜置于含10％小牛血清的1×PBS溶液中4℃封闭1小时，取出PVDF膜后在适当位置剪开(根据目的蛋白和对照蛋白大致的电泳位置)，分别加入用含0.1％小牛血清白蛋白1×PBST溶液作1∶1000稀释Survivin蛋白的一抗室温振荡孵育10h，用大量的PBST溶液洗涤三次，每次10min，再加入用含10％小牛血清的1×PBST溶液作1∶1000稀释的Survivin蛋白的二抗，室温振荡孵育1h，用大量的PBST洗涤三次，每次10min。吸干膜上的溶液，加入DAB显色液，显色5min。
流式细胞术检测细胞周期变化转染方法同前，转染干扰载体48h后，细胞用胰蛋白酶消化后1min，PBS洗两遍，加入1mL乙醇固定过夜，去乙醇，PBS洗两遍，加入100μL浓度为10μg/mL的PI，混匀后室温避光孵育30min，在反应管中加400μL PBS，上机检测细胞周期变化。
统计学处理统计结果以.x±s表示，用SPSS13.0统计学软件进行分析，数据两两比较采用配对资料t检验，多组之间比较用ANOVA进行。
结果 细胞分裂的抑制 本发明的小分子干扰RNA作用后的肿瘤细胞株肺癌A549、胃癌SGC7901、肝癌SMMC7721、乳腺癌MDA-MB-231、宫颈癌Hela分裂明显减少、细胞的生长也受到明显抑制，小分子干扰RNA CPUsiRNA4在12.5nM至400nM对肺癌A549、胃癌SGC7901、肝癌SMMC7721、乳腺癌MDA-MB-231、宫颈癌Hela的抑制作用逐渐增强，CPUsiRNA4作用48小时后，MTT法检测的对肿瘤细胞的抑制率结果，见表1。用临床上常用的抗肿瘤的顺铂作为CPUsiRNA4的药效对照药物，顺铂在5μM至80μM对肿瘤肺癌A549、胃癌SGC7901、肝癌SMMC7721、乳腺癌MDA-MB-231、宫颈癌Hela的抑制作用逐渐增强，作用48小时后，MTT法检测的对肿瘤细胞的抑制率结果，见表2。
表1 CPUsiRNA4作用于肿瘤细胞48小时的抑制率
n＝6，mean±SD，重复3次，*为P<0.05(有显著差异)；**为P<0.01(有极显著差异) 表2 顺铂作用于肿瘤细胞48小时的抑制率
n＝6，mean±SD，重复3次，*为P<0.05(有显著差异)；**为P<0.01(有极显著差异) RT-PCR检测survivin基因的mRNA的转录 见图1，图中第1，2，3泳道分别是没加药的肿瘤A549、SMMC7721和Hela细胞的RT-PCR检测结果，第4，5，6泳道是分别是加了有效的本发明的小分干扰RNA siRNA4 100nM 48小时的肿瘤A549、SMMC7721和Hela细胞的RT-PCR检测结果。虽然它们都能扩增出450bpsurvivin基因的带，但4，5，6泳道的条带明显更淡，这表明survivin基因在mRNA的转录受到了一定的抑制。
Western blot检测小分干扰RNA对survivin表达的抑制情况 见图2，图中第1，2，3泳道分别是没加药的肿瘤A549、SMMC7721和Hela细胞的Westernblot检测结果，第4，5，6泳道是分别是加了本发明小分干扰RNA siRNA4 100nM 48小时的肿瘤A549、SMMC7721和Hela细胞的Westernblot检测结果。虽然它们都能印出15kD的Survivin蛋白的带，但4，5，6泳道的条带明显更淡，这表明survivin基因在蛋白质的翻译受到了一定的抑制。
流式细胞仪检测细胞周期变化的实验结果 图3中，a，b，c分别是没加药的肿瘤A549、SMMC7721和Hela细胞的流式细胞仪检测细胞周期变化的实验结果，d，e，f泳道是分别是加了本发明的小分干扰RNA siRNA4 50nM 48小时的肿瘤A549、SMMC7721和Hela细胞的流式细胞仪检测细胞周期变化的实验结果。转染的小分干扰RNA CPUsiRNA4 50nM 48小时后，用流式细胞仪检测细胞周期变化显示肿瘤细胞A549、Be17402和HL60分裂明显受到抑制，分别有37.6％、30.1％和20.1％的细胞被阻滞在G2/M期。
一种siRNA在制备调控肿瘤细胞周期药物中的用途
<110>申请人姓名宜春学院
<120>发明名称一种siRNA在制备调控肿瘤细胞周期药物中的用途
<160>序列表中序列的个数6
<210>序列相对应的序列标识符1
<211>序列长度21
<212>序列的类型RNA
<213>生物体人工序列
<400>序列标识符1
AAAGCAUUCGUCCGGUUGCtt
<210>序列相对应的序列标识符2
<211>序列长度21
<212>序列的类型RNA
<213>生物体人工序列
<400>序列标识符2
GCAACCGGACGAAUGCUUUtt
<210>序列相对应的序列标识符3
<211>序列长度21
<212>序列的类型RNA
<213>生物体人工序列
<400>序列标识符3
AAAGCAUUCGUCCGGUUGCTT
<210>序列相对应的序列标识符4
<211>序列长度21
<212>序列的类型RNA
<213>生物体人工序列
<400>序列标识符4
GCAACCGGACGAAUGCUUUTT
<210>序列相对应的序列标识符5
<211>序列长度21
<212>序列的类型RNA
<213>生物体人工序列
<400>序列标识符5
AAAGCAUUCGUCCGGUUGCUU
<210>序列相对应的序列标识符6
<211>序列长度21
<212>序列的类型RNA
<213>生物体人工序列
<400>序列标识符6
GCAACCGGACGAAUGCUUUUU
权利要求
1、一种双链小分子干扰RNA，其特征是由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成
正义链5′-AAAGCAUUCGUCCGGUUGCtt-3′，
反义链3′-ttUUUCGUAAGCAGGCCAACG-5′
其中X代表tt、TT或UU。
2、权利要求1的双链小分子干扰RNA，其中X代表tt，t为脱氧胸腺嘧啶。
3、权利要求1或要求2的双链小分子干扰RNA在制备调控肿瘤细胞周期药物中的用途。
4、权利要求3的用途，其中肿瘤是肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌细胞。
全文摘要
本发明涉及一种小分子干扰RNA在制备调控肿瘤细胞分裂周期药物中的用途，这种小分子干扰RNA可以沉没survivin基因表达，高效的调控肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌细胞的周期，显著抑制肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌细胞的细胞分裂。这种小分子干扰RNA可以制备抑制肿瘤细胞分裂的药物。
文档编号C07H21/02GK101456887SQ20081013660
公开日2009年6月17日 申请日期2008年12月24日 优先权日2008年12月24日
发明者陆云华 申请人:宜春学院