专利名称：抗氧化酶交联的多聚血红蛋白及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及血液代用品，具体涉及修饰的多聚血红蛋白及其制备。
背景技术：
血液中红细胞的可逆氧合功能主要是由血红蛋白来完成的。在哺乳动物中，血红蛋白 是一类由大约6%的血红素和9偶的球蛋白构成的，分子量为64458 dalton。血红蛋白分子 由两个a亚基和两个p亚基构成，每个亚基(a或e)各含有一个血红素和一个球蛋白。
随着临床用血需求的增大以及现有血液供应中所存在的诸如潜在的输血传染危险、紧 急用血时需要配型的繁琐和血液不能长久保存等不利因素，人们不断地投入到血液代用品 的研发中来。
所谓的血液代用品是一种能够给组织供氧的血液制品，可应用于外科手术中损失血液 的替代、急性失血时的输血等等。自从30年代Araberson应用红细胞溶血液为猫输血的实 验开始直至二十世纪80年代才出现了第一代的制品用于临床实验。时至今日，虽然出现了 数种制品进入临床实验，然而仍没有一种制品在临床上得到大规模应用。
现存红细胞代用品可分为三类1)氟碳化合物2)包埋血红蛋白的人工红细胞3)修 饰的血红蛋白。如今进入临床实验研究的多为第3类的修饰血红蛋白。血红蛋白作为原料 制备红细胞代用品需面临多个难关其中包括1)红细胞外的血红蛋白在血浆中的半衰期只 有2-4小时，因而需要克服半衰期短的问题。2)血红蛋白的氧化稳定性。具有携氧功能 的血红蛋白为二价的亚铁血红蛋白，其可自氧化或在存在外源氧化剂的条件下氧化形成三 价的高铁血红蛋白，并进一步形成活性更强的四价铁的血红蛋白。正是这些因素限制了修 饰血红蛋白作为红细胞代用品的使用。这其中后者的影响更为严重，因为在大量失血患者 体内由于失血引起的氧化酶的活性增强，在随后的输血过程中会产生大量的氧自由基从而 造成对机体的损伤。因而如何增加血红蛋白的氧化稳定性、防止或者减轻由于缺血再灌注 带来的损伤也成为研发红细胞代用品的一个重要方面。
发明内容
本发明的目的是克服现有红细胞代用品的缺陷，提供一种抗氧化酶交联的多聚血红蛋 白及其制备。
本发明公开了一种抗氧化酶交联的多聚血红蛋白，是与超氧化物歧化酶和过氧化氢酶 化学交联的多聚血红蛋白，多聚血红蛋白由2-5个血红蛋白分子组成。
上述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白中，过氧化氢酶超氧化物歧化酶血红蛋白的比
例为(50000U-400000U): (2500U-20000U): lg。较佳的，上述比例为(100000U-300000U): (5000U-15000U): lg，最佳的上述比例为300000U : 15000U : lg。 本发明的抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法包括下列步骤
1. 将过氧化氢酶和超氧化物歧化酶按比例加入血红蛋白溶液中；
2. 加入戊二醛进行交联反应；
3. 加入赖氨酸终止交联反应；
4. 将终止反应的溶液进行中空纤维超滤纯化后浓縮并进行无菌过滤处理。 上述血红蛋白溶液中的血红蛋白可来源于哺乳动物的离体血液，较佳的是来源于人的
离体血液，血红蛋白溶液的溶剂为常用溶剂如生理盐水、磷酸缓冲液或乳酸林格氏液等。
上述来源于人的离体血液可以是过期人血，较佳的是过期3-8周的人血，更佳的是过期3-4
周的人血。过保存期限3-4周的过期人血在进行进一步操作前应储存于4°0+-2°(:冰箱中。
所有使用的过期人血都应已在入血库前通过病源检测。
上述步骤2中，戊二醛血红蛋白的摩尔比为8: 1-16:1，较佳的为8: 1-12:1，最佳
的为12: 1。戊二醛以溶液的形式加入，如1.5% (w%)的戊二醛水溶液。交联反应时，可
以HPLC监测分子交联程度。
上述步骤3中，赖氨酸以溶液的形式加入，如2M赖氨酸水溶液。
上述步骤4中，中空纤维超滤的滤出限300kd，以磷酸缓冲液平衡，循环8-IO体积，
直至未修饰血红蛋白含量小于5%。将纯化的修饰血红蛋白溶液浓縮至终浓度7g/dl左右后
进行无菌过滤处理。
上述步骤4后，还可包括加入冻干保存剂抗坏血酸和葡萄糖，抗坏血酸的终浓度为 0. 1-0. 5g/L，较佳为0. 1-0. 3g/L,最佳为0. lg/L，葡萄糖的终浓度为1-5%,较佳为1-3%, 最佳为3%，冻干后-2(TC长期保存。
前述血红蛋白溶液可通过下述方法获得
A.将哺乳动物血液离心，分离并洗涤红细胞；B. 将红细胞与去离子水混匀制备红细胞溶血液；
C. 离心，取上清以Tris-HC1缓冲液平衡后进行离子交换层析，洗脱收集后进行超 滤处理，得到纯化的无基质血红蛋白溶液。
上述步骤B中红细胞与去离子水的体积比为1: (5-9)，优选l: (7-9)，最优选l: 9。 上述步骤C中Tris-HC1缓冲液为50mM、 pH8. 0-8. 5的Tris-HC1缓冲液，较佳采用 pH8. 0-8. 2的Tris-HC1缓冲液，最佳采用pH8. 2的Tris-HCl缓冲液。 本发明对多聚血红蛋白进行了表面修饰，获得了表面修饰的氧合血红蛋白。更具体的 说，所进行的表面修饰是化学交联具有抗氧化作用的酶类。所应用的酶是超氧化物歧化酶、 过氧化氢酶。本发明的抗氧化酶交联的多聚血红蛋白具有在室温24X:下更低的自氧化速率 和更强的抗氧化性，可抗外源性氧化剂，制品中高铁血红蛋白的含量低于8%。本发明的抗氧 化酶交联的多聚血红蛋白应用时无需交叉配型及实验室检测，具有广泛的适用性。
图1: 37'C孵育8小时检测制品自氧化稳定性
图2:超滤前交联抗氧化酶的多聚血红蛋白的分子量分布
HPLC: C他lg/L; TSK-Gel 3000SWXL，流速0.8ml/min 图3:中空纤维超滤循环8-IO体积后分子量分布
HPLC: Cnb lg/L; TSK-Gel 3000SWXL，流速0.8ml/min 图4:抗氧化酶交联多聚血红蛋白注射小鼠后72小时内清除量的免疫印迹
1 一 6:分别代表Oh、 6h、 12h、 24h、 48h和72h的PolyHb-SOD-CAT量;7:阳性对
照8:阴性对照
具体实施例方式
以下列举具体实例进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。
实施例1 无基质血红蛋白的制备 1、获取和保存过期红细胞
过保存期限3-4周的过期人血在进行进一步操作前储存于4°C+-2。C冰箱中。所有过期 人血都已在入库前通过病源检测。
2、 洗涤红细胞的制备
将过期血液分入数个无菌处理过的离心管中，3500rpm离心IO分钟。取出后，吸出上 层血浆和中层白细胞，下层红细胞以0.9%生理盐水混匀，3500rpm离心10分钟。弃上清， 下层红细胞再以生理盐水洗涤，重复三次，获得洗涤红细胞。
3、 洗涤红细胞的裂解和离心去基质
将所获洗涤红细胞与去离子水以体积比l: 9充分混匀得到红细胞溶血液。再将溶血液 倒入高速离心容器中，9000rpm离心50分钟，弃沉淀，取上清血红蛋白溶液作进一步处理。
4、 血红蛋白的纯化
上清血红蛋白溶液以Tris-HC1 (50mM, PH8.2)平衡后进行离子交换层析，洗脱收集后 进行超滤处理，滤出限30kd。得到纯化的无基质血红蛋白溶液。
实施例2抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备
1、 抗氧化酶交联血红蛋白
以300000U过氧化氢酶15000U超氧化物歧化酶lg血红蛋白的比例向纯化的血红 蛋白溶液中加入两种抗氧化酶。摩尔比12: 1 (戊二醛血红蛋白)加入1.5%戊二醛，以 HPLC监测分子交联程度。当达到所需交联程度后，向溶液中加入2M赖氨酸溶液终止交联反 应。
2、 修饰血红蛋白的纯化
终止反应的多聚血红蛋白溶液进行中空纤维超滤，滤出限300kd，以磷酸缓冲液平衡， 循环8-10体积，直至未修饰血红蛋白含量小于5%。将纯化的修饰血红蛋白溶液浓縮至终浓 度7g/dl，并进行无菌过滤处理。(超滤前后交联抗氧化酶的多聚血红蛋白的分子量分布如 图2和图3)
3、 抗氧化修饰血红蛋白的冻干保存
分别加入冻干保存剂抗坏血酸、葡萄糖至终浓度O. lg/L和3%，冻干后-2(TC长期保存。 实施例3抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备
过氧化氢酶超氧化物歧化酶血红蛋白的比例为200000 U: 10000U: lg，其余步骤 同实施例2。
实施例4抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备
过氧化氢酶超氧化物歧化酶血红蛋白的比例为100000: 50001): lg，其余步骤同实
施例2。
实施例5抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备
过氧化氢酶超氧化物歧化酶血红蛋白的比例为50000: 2500U: lg，其余步骤同实
施例2。
实施例6抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备
过氧化氢酶超氧化物歧化酶血红蛋白的比例为400000: 20000U: lg，其余步骤同
实施例2。
实施例7抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的自氧化稳定性测试
测试方法实施例2制备的抗氧化酶交联的多聚血红蛋白(口PolyHb-酶)与多聚血红 蛋白(BPolyHb)分别37'C孵育8小时，检测MetHb%; Hb浓度为7g/dl
测试结果37'C孵育8小时后多聚血红蛋白(BPolyHb)的MetHbW上升幅度明显大于 抗氧化酶交联的多聚血红蛋白(口PolyHb-酶)，抗氧化酶交联的多聚血红蛋白(口PolyHb-酶)具有较好的抗氧化能力。(实施例2的测试结果见图1)
实施例8抗氧化酶交联的多聚血红蛋白注射小鼠后72小时内清除量的免疫印迹 (Western Blot) 试验方法
1、 健康昆明小鼠6-8周龄，按血量20%注射实施例2制备的抗氧化酶交联的多聚血红 蛋白，按时间间隔0h、 6h、 12h、 24h、 48h和72h分别取血，离心取血浆。
2、 SDS-PAGE电泳，10%分离胶；
3、 半干法转膜印迹，Abcam羊抗人Hb—抗孵育，兔抗羊IgG二抗孵育，胶片曝光显色。 试验结果如图4所示，1-6:分别代表0h、6h、12h、24h、48h和72h的PolyHb-SOD-CAT;
7:阳性对照8:阴性对照；可以看到注射样品后48h仍能被检测到，注射72h后未被检测
到，抗氧化酶交联的多聚血红蛋白在小鼠体内存留时间超过48小时。
权利要求
1.一种抗氧化酶交联的多聚血红蛋白，是与超氧化物歧化酶和过氧化氢酶化学交联的多聚血红蛋白，多聚血红蛋白由2-5个血红蛋白分子组成。
2. 如权利要求l所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白，其特征在于，所述抗氧化酶交联的 多聚血红蛋白中，过氧化氢酶超氧化物歧化酶血红蛋白的比例为(50000U-400000U ):(2500U-20000U): lg。
3. 如权利要求2所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白，其特征在于，所述过氧化氢酶超 氧化物歧化酶血红蛋白的比例为(100000U-300000U): (5000U-15000U): lg。
4. 如权利要求3所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白，其特征在于，所述过氧化氢酶超氧化物歧化酶血红蛋白的比例为300000U : 15000U : lg。
5. 如权利要求1-4中任一权利要求所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，包括下列步骤A. 将过氧化氢酶和超氧化物歧化酶按比例加入血红蛋白溶液中；B. 加入戊二醛进行交联反应；C. 加入赖氨酸终止交联反应；D. 将终止反应的溶液进行中空纤维超滤纯化后浓縮并进行无菌过滤处理。
6. 如权利要求5所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述血红蛋白溶液中的血红蛋白来源于哺乳动物的离体血液。
7. 如权利要求6所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述血红 蛋白溶液中的血红蛋白来源于人的离体血液。
8. 如权利要求7所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述来源 于人的离体血液为过期人血。
9. 如权利要求5所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤 B中，戊二醛血红蛋白的摩尔比为8: 1-16:1。
10. 如权利要求5所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤 B中，交联反应时，采用HPLC监测分子交联程度。
11. 如权利要求5所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述戊二 醛为质量百分比1. 5%的戊二醛水溶液。
12. 如权利要求5所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述赖氨 酸为2M的赖氨酸水溶液。
13. 如权利要求5所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤D中，中空纤维超滤的滤出限300kd，以磷酸缓冲液平衡，循环8-IO体积，直至未修 饰血红蛋白的含量小于5%，将纯化的修饰血红蛋白溶液浓縮至终浓度7g/dl左右后进 行无菌过滤处理。
14. 如权利要求5所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤 D后，还包括加入冻干保存剂抗坏血酸和葡萄糖，冻干后-2(TC保存。
15. 如权利要求14所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述抗坏 血酸的终浓度为0. 1-0. 5g/L,所述葡萄糖的终重量百分比浓度为1-5%。
16. 如权利要求5所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述血红 蛋白溶液可通过下述方法获得A. 将哺乳动物血液离心，分离并洗涤红细胞；B. 将红细胞与去离子水混匀制备红细胞溶血液；C. 离心，取上清以Tris-HC1缓冲液平衡后进行离子交换层析，洗脱收集后进行超滤 处理，得到纯化的无基质血红蛋白溶液。
17. 如权利要求16所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤 B中，红细胞与去离子水的体积比为1: (5-9)，步骤C中Tris-HCl缓冲液为50mM p朋.0-8. 5的Tris-HC1缓冲液。
18. 如权利要求17所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤 B中，红细胞与去离子水的体积比为1: (7-9)，步骤C中Tris-HC1缓冲液为50mM、 pH8. 0-8. 2的Tris-HC1缓冲液。
19. 如权利要求18所述抗氧化酶交联的多聚血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤 B中，红细胞与去离子水的体积比为1: 9，步骤C中Tris-HCl缓冲液为50mM pH8.2 的Tris-HCl缓冲液。
全文摘要
本发明涉及血液代用品，公开了一种抗氧化酶交联的多聚血红蛋白，是与超氧化物歧化酶和过氧化氢酶化学交联的多聚血红蛋白。本发明的抗氧化酶交联的多聚血红蛋白具有更低的自氧化速率和更强的抗氧化性，可抗外源性氧化剂，在应用时无需交叉配型及实验室检测，具有广泛的适用性。
文档编号C07K14/795GK101357940SQ200810200068
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月18日 优先权日2008年9月18日
发明者任亚娜, 洁 杨, 杨懿铭, 王永彬, 范华骅, 谢如锋 申请人:上海市血液中心