肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白的制作方法

专利名称：：肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明属于医药生物
技术领域：
，具体涉及基因克隆、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的纯化、肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白。
背景技术：
：肿瘤血管抑制治疗相关研究及存在的问题肿瘤血管生成是肿瘤迅速增殖的前提条件，抑制肿瘤血管生成是肿瘤治疗的一种重要途径。目前肿瘤血管抑制治疗主要分为以下途径①阻断促进血管生成的调节因子。血管生长刺激因子VEGF等是肿瘤细胞中最常发现的促血管生长因子，也是血管治疗中的主要耙分子。②增强抑制血管生长的调节因子。如增强抑制性细胞因子、生长因子拮抗剂等是肿瘤血管治疗中最直接的手段，目前已有多种抑制调节因子进入临床前期试验阶段。③已形成血管的阻断疗法。诱导肿瘤组织中已存在的血管急性损伤能够有效抑制肿瘤的增殖。④肿瘤血管抑制基因治疗。由于基因治疗的目标是核酸，具有设计简单、特异性强和毒性小等优点，目前已广泛用于实验研究中。尽管目前在肿瘤血管生成方面的研究取得了很大的突破，但仍存在不足之处。首先，肿瘤血管针对性治疗不强。由于检测肿瘤血管特异性的分子标志物存在着很多困难这些分子只存在于肿瘤血管，正常血管中并不存在；表达的量较小，难以检测，更无法纯化。找出肿瘤血管特异性标志物是对肿瘤血管进行靶向治疗的关键。其次，目前进入临床实验多数血管生成抑制分子进入体内表达效率低，不能在肿瘤血管局部维持治疗浓度。只有当这些抑制血管或者肿瘤生成的药物具有耙向性的时候，才能使药物在体内表达效率增高，治疗浓度增大，达到有效治疗。特异性结合多肽的研究现状针对以上的不足，噬菌体随机肽库的应用成功的解决了这一难题并为人们大规模发展和筛选新型抗肿瘤药物提供了强有力的手段。随着噬菌体展示多肽库技术的发展，应用小肽模拟抗原抗体反应已成为发展的趋势。这是因为(l)含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的抗原决定簇；(2)多数情况下，几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分，即蛋白质之间的相互作用是通过局部肽段间的相互作用实现的。这类导向性药物，不仅具有结合特异性和高效性，还克服了单抗效应剂分子量较大，穿透能力弱的缺点。目前，基于导向药物中导向分子小型化的发展趋势，利用噬菌体展示多肽库技术筛选出能够与目的分子结合的短肽，在体外合成编码这一短肽的核苷酸序列，与弹头分子基因融合，表达出具有导向作用的多肽一弹头分子，由短肽发挥导向作用，弹头分子可以是细菌毒素、细胞因子、化疗药物等，这一药物设计策略已显示出良好的应用前景。已有研究显示各种组织器官都存在着组织器官特异性亲和蛋白，因此不同种类的肿瘤血管也会有不同的特异性亲和蛋白，即"异质性"(Molecularheterogeneity)。Pasqualini等人也通过噬菌体随机肽库体内淘洗法并获得了包括脑、肾、肺、胰、皮肤等多种正常组织器官血管内皮结合的不同的噬菌体短肽。WadihArap等采用噬菌体随机肽库技术发现能够与前列腺肿瘤血管特异性结合的小肽"SMSIARL"。AngeloConi等利用基因工程手段，将从噬菌体展示肽库中筛选出的能特异性与氨肽酶(CD13)结合的五肽CNGRC通过一个甘氨酸连到天然人肿瘤坏死因子的氨基4端，实验证明，改建后的融合蛋白在体外肿瘤细胞杀伤实验中具有与天然肿瘤坏死,因子相近的活性，在体内实验中，与天然肿瘤坏死因子相比，改建后的融合蛋白具有更高的量效比，更低的毒副反应。在移植肿瘤生长12天以后，CNGRC-TNF和TNF二者的杀伤活性出现明显差别，说明CNGRC-TNF可能通过作用于肿瘤的新生血管而具有较高的量效比。证实了特异性结合多肽作为导向分子的合理性和可行性。目前筛选多肽的方法有体内筛选和体外筛选两种，体外筛选主要针对目的肿瘤或组织的细胞系进行筛选，方法比较简单，但是无法准确模拟体内环境，筛选出的多肽在应用到体内时靶向效果不好。体内筛选就弥补了这个不足，体内筛选要建出合适的动物模型，方法上比较复杂，但是其来源于体内环境，应用于体内时效果较好。肿瘤坏死因子是一种多功能的细胞因子，参与机体的免疫代谢调节，对某些癌细胞具有增殖抑制和细胞毒作用。肿瘤坏死因子还是一种感染性介导因子，在机体的炎症中起重要作用。肿瘤坏死因子的生物效应抗肿瘤及抑瘤作用肿瘤坏死因子对多种肿瘤均有杀伤或抑制作用，敏感性因肿瘤细胞类型而异。肿瘤坏死因子的抑瘤机制尚不完全清楚，可能包括①、肿瘤坏死因子为激发性细胞因子，可启动广泛的免疫炎性反应，介导自然杀伤细胞、单核细胞和巨噬细胞对癌细胞的杀伤作用；②、肿瘤坏死因子可作用于血管内皮细胞，使肿瘤的血管变形受损或形成血栓，导致肿瘤发生出血性坏死或营养缺乏而消退；③、肿瘤坏死因子可通过诱导某些肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤细胞增生。抗病毒作用肿瘤坏死因子呈剂量依赖性地抑制病毒介导的细胞病变的发展，对DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用。肿瘤坏死因子可以诱导未感染细胞产生抗病毒能力，还可选择性的杀伤病毒感染的细胞。现已证实，多种病毒等也可刺激肿瘤坏死因子的产生。免疫调节作用肿瘤坏死因子能够增强T细胞产生以IL-2为主的淋巴因子，提高IL-2的表达水平，从而促进T细胞的增殖；还能促进B细胞的增殖、分化和产生抗体。此外，肿瘤坏死因子还能诱导单核-巨噬细胞系统的前体细胞分化，增强其吞噬能力和氧化代谢水平，提高巨噬细胞抗原提呈能力。并可促进骨髓基质细胞和巨噬细胞产生CSF，特别是GM-CSF，可促使骨髓释放中性粒细胞和巨噬细胞。肿瘤坏死因子还可以诱发炎症反应，是一种急性期反应的强力诱导剂。对结缔组织的作用可诱导破骨细胞吸收骨质、促进软骨细胞进行软骨更新，抑制新骨形成。肿瘤坏死因子还可以刺激成纤维细胞和滑膜细胞的增生，引起关节组织的纤维化和增生。肿瘤坏死因子的应用现状由于肿瘤坏死因子的抗肿瘤作用和多种免疫调节作用，肿瘤坏死因子疗法的临床研究已在许多国家开展。动物实验和临床研究均表明肿瘤坏死因子对某些肿瘤具有明显的抑制作用，但是由于副作用较大，限制了它的临床应用。肿瘤坏死因子的副作用包括发热、头痛、恶心、呕吐、全身倦怠、肌肉酸痛等；高剂量时可导致休克、肾功能不全和DIC形成等。建立合理的用药方案及治疗措施，可望降低用量，减轻副作用，达到最佳治疗效果。静脉注射rhTNF可使部分肿瘤缩小，但是副作用大，人体很难耐受。瘤内注射可在局部出现坏死，且副作用较轻，对某些肿瘤的治疗效果优于静脉注射。已报告的有效病例包括肾癌、胃癌、肝癌等，并使转移性大肠癌腹水减少。肿瘤坏死因子与其他药物的联合应用单独使用TNF用量大，不容易获得好的效果，患者常因不能耐受其副作用而中止用药。将其它具有肿瘤抑制作用的细胞因子(如IL-2、IFN等)或某些抗肿瘤药物(如ADM、MMC、DDP)与TNF联合应用，既可减少各种药物的用量、降低毒副作用，又可提高疗效，不失为肿瘤治疗的一种可行方法。肿瘤坏死因子的定位基因突变:根据对TNF结构与功能关系的研究结果，对TNF的核苷酸的置换、插入或删除来定向改变基因的序列，从而达到使TNF增效减毒的目的。用该法已获得了大量的TNF衍生物。尽管对肿瘤坏死因子的改构或者与其他药物联用可在一定程度上降低其全身毒副作用，但其仍然是作用于全身各个脏器，对正常的组织器官仍有毒性。将其靶向定位于某种肿瘤组织或肿瘤新生血管中的研究还较少，特别是针对中国癌症发生率第二位的胃癌新生血管仍然是空白。
发明内容本发明的目的在于，提供一种肿瘤血管导向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白，制备出肿瘤新生血管特异性结合多肽(GX1)与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白，使其既具有新型重组人肿瘤坏死因子高效低毒的优点，又能在胃癌组织新生血管处富集，从而进一步降低新型重组人肿瘤坏死因子的临床用药量，提高量效比，降低胃癌治疗中的毒副作用。本发明的技术方案是肿瘤血管导向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于将合成的胃癌血管特异性结合的小肽GX1与新型人肿瘤坏死因子a融合在大肠杆菌中获得高效表达，其基因的序列如下GAATTCATGTGTGGTAATTCTAATCCTAAGTCGTGCGGATCCCGCCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCGTCTACTTTGGGATCATTGCCTTCTGACTGCAG所述的肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白，其制备方法是1)合成含有酶切位点的小肽CGNSNPKSC(GX1);2)GXl-rmhTNF融合蛋白基因的克隆及构建；3)重组蛋白的诱导表达；4)重组蛋白的纯化；5)重组蛋白的体外生物学活性检测；6)重组蛋白的体内生物学活性检测。所述的GXl-rmhTNF融合蛋白基因的克隆及构建中pBV220-rmhTNF质粒，它的克隆位点是EcoRl,BamHl和Pstl;按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码GXi导向肽的含有酶切位点的核酸片断5'AATTCATGTGTGGTAATTCTAATCCTAAGTCGTGCG3'将合成的片断于93'C变性10min，退火，再与用EcoRl和BamHl处理过的pBV220连接。所述的重组蛋白的诱导表达，将重组好的质粒转化感受态工程菌大肠杆菌DH56a细胞，随机挑选克隆，以EcoRl和Pstl双酶切鉴定，筛选；正确的克隆于LB中3(TC活化振摇培养12小时，次日以1:100比例接种LB(含Amp100ug/ml)培养基，30。C继续培养至OD650nm=0.6时，迅速升高温度至42°C，培养4h;3000ipm离心15min收集菌体。所述的重组蛋白的纯化，按1克菌体加7ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，4。C搅拌均匀后，用0.2mg/ml溶菌酶裂解菌体，12000rpm，离心20min，收集上清，加固体硫酸铵至45°/。饱和度，4"静置lh，12000rpm，离心15min，收集上清；再加固体硫酸铵至65%饱和度，4匸静置Ih,12000卬m，离心15min，收集沉淀；用60倍体积的A液20mMPBpH6.5，hnMEDTA透析15小时，中间换液四次；透析后的上清用A液充分平衡的Q-SepharoseFastFlow层析纯化，洗脱B液为0.2MNaCl，20mMPBpH6.5，lmMEDTA，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱峰，测定活性；取活性峰对50倍体积的C液20mMTrisClTrisClpH8.5透析过夜，中间换液三到四次；透析后上清用C液充分平衡的SP-sepharoseFastFlow层析纯化，洗脱D液为20mMTris，ClpH8.5，1MNaCl，连续梯度洗脱4-5个柱床体积，收集洗脱峰，进行活性测定和电泳检测。重组蛋白的体外生物学活性检测，按经典的L929细胞毒法进行。重组蛋白的体内生物学活性检测，按建立BALB/C裸鼠SGC7901皮下成瘤模型，以GXl-rmhTNF为受试药物，rmhTNF、天然人肿瘤坏死因子(hTNF)、注射用生理盐水、阿霉素为对照药物，以实验结束时瘤体重量为检测指标，计算抑瘤率,确定受试药物的抑瘤效果；以实验前后裸鼠体重为检测指标，计算体重变化率，确定受试药物的毒副反应。本发明的特点是选择了首次在动物模型体内筛选到能够与胃癌新生血管特异高效结合的多肽GX1，应用基因合成及克隆技术，构建了新的胃癌新生血管特异性结合多肽(GX1)与新型重组人肿瘤坏死因子的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。制备出肿瘤新生血管特异性结合多肽(GX1)与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白，通过溶酶体裂菌法，硫酸铵浓度的调整以及纯化洗脱浓度的改变，进一步提高了纯化目的蛋白的活性，使其活性提高到5.97X10SlU/ml。在其后的动物实验疗效验证中，增加了天然TNF对照组，进一步提高其治疗效果的说服力。通过动物实验发现其既具有新型重组人肿瘤坏死因子高效低毒的优点，又能在胃癌组织新生血管处富集，从而进一步降低新型重组人肿瘤坏死因子的临床用药量，提高量效比，降低胃癌治疗中的毒副作用。图1是实施例重组蛋白体内抑瘤试验中的肿瘤大小变化趋势图2是实施例重组蛋白体内抑瘤试验中动物给药后体重变化趋势图。图3是实施例重组蛋白基因测序结果；图4是重组蛋白的体外生物学活性检测MM图。具体实施例方式以下结合实施例附图对本发明作进一步的详细描述。实施例新的肿瘤血管特异性结合多肽(GX1)与新型重组人肿瘤坏死因子融合基因的全序列测定，PBV-GXl-rmhTNF测序结果为GAATTCATGTGTGGTAATTCTAATCCTAAGTCGTGCGGATCCCGCCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCGTCTACTTTGGGATCATTGCCTTCTGACTGCAG制备如上所述的肿瘤血管导向性肽GX1与新型人肿瘤坏死因子融合蛋白的方法按以下步骤1)合成含有酶切位点的小肽CGNSNPKSC(GX1);2)GXl-rmhTNF融合蛋白基因的克隆及构建；pBV220-rmhTNF质粒由第四军医大学生物技术中心获得，它的克隆位点是EcoRl,BamHl和Pstl。按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码GX1导向肽的核酸片断5'AATTCATGTGTGGTAATTCTAATCCTAAGTCGTGCG3'将合成的片断于93"C变性10min，退火，再与用EcoRl和BamHl处理过的pBV220连接。3)重组蛋白的诱导表达将重组好的质粒转化感受态大肠杆菌DH5a细胞，.随机挑选克隆，以EcoRl和Pstl双酶切鉴定，筛选；正确的克隆于LB中30'C活化振摇培养12小时后，以1:100比例接种LB(含Amp100ug/ml)培养基，30。C继续培养至OD65。nm-0.6时，迅速升高温度至42°C，培养4h。3000rpm离心15min收集菌体。经SDS-PAGE分析，发现诱导后在分子量大约18，000Dalton处有一条新生蛋白带，用鼠抗人TNF抗体为一抗，酶标兔抗鼠IgG为二抗，进行Westernblot分析，证实了该新生蛋白带能够与抗TNF抗体发生特异性结合。4)重组蛋白的纯化按1克菌体加7ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，4'C搅拌均匀后，用溶菌酶(0.2mg/ml)裂解菌体，12000rpm,离心20min,收集上清，加固体硫酸铵至45%饱和度，4'C静置lh，12000rpm，离心15min，收集上清；再加固体硫酸铵至65%饱和度，4。C静置lh，12000rpm，离心15min，收集沉淀；用60倍体积的A液20mMPBpH6.5，ImMEDTA透析15小时，中间换液四次；透析后的上清用A液充分平衡的Q-SepharoseFastFlow层析纯化，洗脱B液为0.2MNaCl，20mMPBpH6.5，lmMEDTA，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱峰，测定活性。取活性峰对50倍体积的C液20mMTrisClpH8.5透析过夜，中间换液三到四次；透析后上清用C液充分平衡的SP-sepharoseFastFlow层析纯化，洗脱D液为20mMTris*ClpH8.5，1MNaCl，连续梯度洗脱4-5个柱床体积，收集洗脱峰，进行活性测定和电泳检测。SDS-PAGE凝胶电泳检测并经凝胶成像系统分析，纯度大于95%。5)重组蛋白的体外生物学活性检测新的肿瘤新生血管特异性结合多肽与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的生物活性检测按经典的L929细胞毒法进行。测定方法如下L929细胞用加有10X小牛血清的DMEM培养基培养，用胰酶消化细胞后，在显微镜下计数，调整细胞浓度为1.0X10S细胞/m1,并将细胞接种于96孔培养板中，每孔100nl(1.0Xl(^细胞/孔)，37°C，5%0)2培养过夜至细胞贴满板壁80%,或至细胞贴满板壁85%%及90%都可以。TNF标准品每个剂量各测两个孔，每孔加0.1ml，以后各孔用含3%小牛血清(FBS)的DMEM培养液做4倍梯度稀释，即标准品起始浓度为1001U/ml，以后依次为251U/ml，6.251U/ml，1.561U/ml，0.391U/ml，0.11U/ml，0.0251U/ml，0.006251U/ml。样品则根据实际情况预稀释至起始浓度约为1001U/ml，再做4倍梯度稀释，终体积均为100ul/孔(以上操作均在96孔板中操作)。置于37°C,5XC02孵箱中，培养16h。用结晶紫染色，测0Ds7ton值，(双孔加样测两点值的平均)以稀释倍数的对数值为横坐标，ODs7o^为纵坐标做图，以标准品的最低OD570皿和最高OD570^之平均值做一平行于X轴的直钱交于曲线，以样品对应曲线与该直线交点在X轴上读出半效量的稀释度，按下式计算效价样品活性(1U/ml):标准晶效价x(样品预稀释倍数/标准晶预稀释倍数)x(标准晶半效量稀释度/样品相当于标准品半效量的稀释度)。体外活性实验显示TNF标准品对L929细胞杀伤活性达到5.0X1081U/ml,GXl-rmhTNF融合蛋白对L929细胞有明显的杀伤活性，活性为5.97X1081U/ml。6)重组蛋白的体内生物学活性检测的具体步骤为a)将25只体重介于18-20克之间的裸鼠在无菌操作条件下，于右侧背部皮下接2X10Vml的SGC7901胃癌细胞；随后将接种后的动物随机分成4组，即GXl-rmhTNF5X105U/kg实验组，rmhTNF5X105U/kg禾tlhTNF5X105U/kg阿霉素2mg/ml阳性对照组，生理盐水阴性对照组；b)于治疗前称体重；接种瘤株后第15天分别按上述各组动物给药剂量和给药方法进行治疗，均于尾静脉注射GXl-rmhTNF，rmhTNF，hTNF和生理盐水，连续治疗6次12天；c)末次给药后24小时，再次称量体重，然后用颈椎脱臼法处死动物，迅速分离出肿瘤组织称其湿重，根据公式计算出肿瘤生长抑制率，并进行统计分析。肿瘤生长抑制率可按下列公式计算-ffl^啦—对照组瘤重均值一治疗组瘤重均值v醇抑瘤率对照组瘤重均值-X100%同时计算小鼠治疗前后体重变化，作为衡量治疗药物毒副作用的指标。体重变化率二M^MMzMIMMx画治疗前体重均值图i是实施例重组蛋白体内抑瘤试验中动物给药后肿瘤大小变化趋势图。纵坐标是动物肿瘤体积，横坐标是给药的时间。图2是实施例重组蛋白体内抑瘤试验中动物给药后体重变化趋势图。纵坐标是动物体重，横坐标是给药的时间。体内试验显示GXl-rmhTNF对裸鼠移植瘤SGC7卯1的生长具有明显的抑制作用。GXl-rmhTNF组抑瘤率达到56.15%，与生理盐水组(NS)对比有明显差异(P<0.05)。并且给药后GXl-rmhTNF组(GXl-TNF)与对照药物rmhTNF组，hTNF组相比，体重(animalweight)减轻明显小于对照药物组，说明其全身毒副作用低于rmhTNF如图1-2所示。图3是实施例重组蛋白基因测序图图4是实施例重组蛋白体外活性检测图。纵坐标是OD值，横坐标是样品和标准品的稀释度。体外活性实验显示纯化的GXl-rmhTNF生物学活性达到5.97X1081U/ml,与TNF标准品相当。达到临床用药活性要求。表l是重组蛋白的抑瘤效果。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*P<0.05本发明选用了能特异性与肿瘤新生血管结合的多肽GX1，应用基因重组的方法，将其与rmhTNF氨基端融合，并在大肠杆菌中获得表达。在成功构建、表达融合基因的基础上，参照rmhTNF的纯化方法，建立了成本低廉的纯化工艺，融合蛋白的条件，利用两步硫酸铵沉淀，阴阳离子交换层析的方法，纯化出该融合蛋白，其纯度大于95%。在体外杀伤试验中，该融合蛋白GXl-rmhTNF对L929细胞具有剂量依赖性的、明显的杀伤作用，活性达到5.97xl08lU/ml。在动物肿瘤模型中，该融合蛋白GXl-rmhTNF对裸鼠移植瘤SGC7901有显著的抑制作用(肿瘤抑制率为56.15%),明显高于对照组。并且毒副作用低于rmhTNF。经实验证明，本发明的效果如下-1)利用基因工程方法将人工合成的编码GX1的寡核苷酸片段与rmhTNF5'端连接，构建了GXl-rmhTNF融合基因的克隆载体，DNA序列测定证实完全正确。2)构建的GXl-rmhTOF融合基因的原核表达载体，经温度诱导，在大肠杆菌中获得高效表达。经免疫印迹证实该融合蛋白与抗TNF抗体有特异性结合能力。3)纯化了GXl-rmhTNF融合蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度大于95%。4)体外活性实验显示GXl-rmhTNF融合蛋白对L929细胞有明显的杀伤活性，活性达到5.97X1081U/ml。体内试验显示GXl-rmhTNF对裸鼠移植瘤SGC7901的生长具有明显的抑制作用。GXl-rmhTNF组抑瘤率达到56.15%，与生理盐水组对比有明显差异(P0.05)。并且给药后GXl-rmhTNF组与对照药物rmhTNF组相比，体重减轻明显小于对照药物组，说明其全身毒副作用低于rmhTNF本发明采用改进的噬菌体随机肽库体内筛选技术成功在体内筛选出能够与胃癌血管特异性相结合的环状小肽GX1，将它作为导向分子抑制肿瘤血管的生长，从而抑制肿瘤生长。权利要求1、肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于将合成的胃癌血管特异性结合的小肽GX1与新型人肿瘤坏死因子α融合在大肠杆菌中获得高效表达，其基因的序列如下GAATTCATGTGTGGTAATTCTAATCCTAAGTCGTGCGGATCCCGCAAACGTAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCTTCTGACTGCAG2、根据权利要求1所述的肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白，其制备方法是1)合成含有酶切位点的小肽CGNSNPKSC(GXl);2)GXl-rmhTNF融合蛋白基因的克隆及构建；3)重组蛋白的诱导表达；4)重组蛋白的纯化；5)重组蛋白的体外生物学活性检测；6)重组蛋白的体内生物学活性检测。3、根据权利要求3所述的肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，其特征在于所述的GXl-rmhTNF融合蛋白基因的克隆及构建中pBV220-rmhTNF质粒，它的克隆位点是EcoRl,BamHl和Pstl;按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码GXl导向肽的含有酶切位点的核酸片断5'AATTCATGTGTGGTAATTCTAATCCTAAGTCGTGCG3'将合成的片断于93'C变性10min，退火，再与用EcoRl和BamHl处理过的pBV220连接。4、根据权利要求3所述的肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，其特征在于所述的重组蛋白的诱导表达，将重组好的质粒转化感受态工程菌大肠杆菌DH5a细胞，随机挑选克隆，以EcoRl和Pstl双酶切鉴定，筛选；正确的克隆于LB中3(TC活化振摇培养12小时，次日以1:100比例接种LB(含Amp100ng/ml)培养基，30。C继续培养至OD65。nm=0.6时，迅速升高温度至42°C，培养4h;3000rpm离心15min收集菌体。5、根据权利要求3所述的肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，其特征在于所述的重组蛋白的纯化，按1克菌体加7ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，4'C搅拌均匀后，用0.2mg/ml溶菌酶裂解菌体，12000卬m，离心20min，收集上清，加固体硫酸铵至45%饱和度，4'C静置lh，12000rpm，离心15min，收集上清；再加固体硫酸铵至65%饱和度，4'C静置lh，12000rpm，离心15min，收集沉淀；用60倍体积的A液20mMPBpH6.5，ImMEDTA透析15小时，中间换液四次；透析后的上清用A液充分平衡的Q-SepharoseFastFlow层析纯化，洗脱B液为0.2MNaCl，20mMPBpH6.5，ImMEDTA，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱峰，测定活性；取活性峰对50倍体积的C液20mMTrisCITrisCIpH8.5透析过夜，中间换液三到四次；透析后上清用C液充分平衡的SP-sepharoseFastFlow层析纯化，洗脱D液为20mMTrisCIpH8.5，1MNaCl，连续梯度洗脱4-5个柱床体积，收集洗脱峰，进行活性测定和电泳检测。6、根据权利要求3所述的肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，其特征在于重组蛋白的体外生物学活性检测，按经典的L929细胞毒法进行。7、根据权利要求3所述的肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，其特征在于重组蛋白的体内生物学活性检测，按建立BALB/C裸鼠SGC7卯I皮下成瘤模型，以GXl-rmhTNF为受试药物，rmhTNF、天然人肿瘤坏死因子(hTNF)、注射用生理盐水、阿霉素为对照药物，以实验结束时瘤体重量为检测指标，计算抑瘤率，确定受试药物的抑瘤效果；以实验前后裸鼠体重为检测指标，计算体重变化率，确定受试药物的毒副反应。全文摘要本发明属于医药生物
技术领域：
，具体涉及基因克隆、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的纯化、肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白，其特征在于应用噬菌体肽库体内筛选技术，得到了能与胃癌血管特异性结合的噬菌体小肽，将其与新型人肿瘤坏死因子α(rmhTNF)融合在大肠杆菌中获得高效表达，利用硫酸铵盐析和阴阳离子交换的方法对目的蛋白进行纯化，将得到的目的蛋白进行了活性测试。其既具有新型重组人肿瘤坏死因子高效低毒的优点，又能在胃癌组织新生血管处富集，从而进一步降低新型重组人肿瘤坏死因子的临床用药量，提高量效比，降低胃癌治疗中的毒副作用。文档编号C07K19/00GK101481418SQ20081023205公开日2009年7月15日申请日期2008年10月31日优先权日2008年10月31日发明者吴开春,张英起,曹珊珊申请人:中国人民解放军第四军医大学