专利名称：具有内皮素受体a拮抗活性的甾体类化合物及其中间体的制作方法
技术领域：
本发明属于化学领域，涉及具有内皮素受体A拮抗活性的新的甾体类化合物及其中 间体。
脑卒中是一类突然发病的急性脑血管疾病，严重威胁人类生命。我国每年新发脑卒 中200万人，估计每年治疗脑卒中费用约240亿元人民币。内皮素是一种很强的縮血管 物质，与ETA受体结合介导血管收縮。脑创伤后，应用ETA受体拮抗剂可以改善脑血管 供血量，防治缺血性脑卒中。
MyricericAcidA是1996年从植物野杨梅(Myrica cerifera)中分离的具有内皮素受 体A拮抗剂活性的天然产物，经Shionogi公司进行改进为S-0139,作为内皮素受体A 拮抗剂，已进行II临床，用于治疗出血性和局部出血性脑卒中(中风)。根据已有文献报 道，其活性部位可能为三萜骨架，但未见详细构效研究的报道。
此三萜类化合物为自然界中罕见的13位羟甲基化合物，通过生物合成和化学合成 MyricericAcidA已有专利报道，其合成路线长，过程复杂。因此，我们考虑避开已有S 一0139化合物的专利，充分考虑主要活性功能团的关键结构部分以及可能的构效关系， 利用结构相近的易得的三种甾体类化合物，通过化学方法，进行结构修饰及改造和衍生 物制备，通过生物活性筛选和构效关系研究，开发结构骨架更为简单、活性更好且易于 制备的新型内皮受体A拮抗剂的活性化合物。
背景技术：
Myriceric Acid A
Chemical Formula: C39H520 Molecular Weight: 632.83
S"0139
Chemical Formula: C44H57N〇9 Molecular Weight: 743.92
发明内容
本发明提供由薯蓣甾体皂苷元、孕甾酮，去氢表氢酮等结构改造得到具有内皮素受体A拮抗活性化合物的结构和合成方法。
本发明结合传统药物设计和药效团模型，针对具有活性代表关键的骨架，对资源丰富、易得廉价甾体类化合物进行了一系列的结构改造和修饰，发现一系列具有内皮素受体A拮抗剂活性的化合物及其中间体，其结构如下
R = CH3CO, CH3CH2CO, PhCO, PhCH2CO, PhCH-CHCO-, H02CCH2CH2CO-
本发明进一歩包括上述吊体化合物或其中间体与药学上可接受的载体组成的药物组合物。
本发明的甾体化合物或其中间体，经生物活性测试表明，具有内皮素受体A拮抗活性，可作为内皮素受体A拮抗剂。
具体实施例方式
下述实施例举例说明本发明，不应被认为是对本发明的限制。实施例一乙酰薯蓣皂甙元的合成-
将薯蓣皂甙元(5.00g， 12.1mmol)溶解在60mL吡啶中，搅拌下加入乙酸酐7.2mL禾口DMAP0.5g，室温下继续搅拌4.5小时。将反应液倒入搅拌中的300mL冰水中，继续搅拌10分钟后抽滤，用适量的水反复洗涤以尽可能地除去吡啶，红外灯下干燥至恒重，得白色固体5.40g (Rf=0.70，乙酸乙酯正己垸=1:4)，产率98%。
ESI-MS(+): m/z 479 [M+Na]+,
3 "-乙酰氧基-5，6-环氧薯蓣皂甙元
将乙酰薯蓣皂甙元(2.74g， 6mmo1)溶解在30mL氯仿中，搅拌下加入m-CPBA(1.58g， 9mmo1)，室温下继续搅拌5小时，其间反应体系由澄清变成白色混浊。反应停止后加入30mL氯仿稀释，反应液又呈无色澄清。用10%亚硫酸钠水溶液(pH=8)洗涤至水相pH值保持在8左右(60mL+100mL)，水相用5mL氯仿洗涤。合并有机相，再用饱和食盐水洗涤(50mLX2)，无水硫酸镁干燥并静置过夜。过滤后旋蒸除去溶剂进行柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯正己烷=1:2,得白色固体2.80g (Rf=0.65，乙酸乙酯正己烷=1:2)，产率99% (ct/(3两种构型的产物的Rf很相近，故两者无法分离)。
iHNMR (300MHz, CDC13， 5 ppm): (l)a-product: 4.92 (m, 3-CH), 4.37 (dxd， 16-CH,V尸6.5Hz, 3一6.9Hz), 3.40 (dxd, 26-CHa, 2J=10.7Hz, V=2.8Hz), 3.34 (dxd， 26-CHb,2 /=10.7Hz, 3声11.0Hz)， 2.87 (d， 6-CH， 3^4.4Hz), 1.99 (s, CH3-C(=0)-0), 1.07 (s, 19-CH3),0.93 (d, 21-CH3,3^6.9Hz)， 0.76 (d, 27-CH3, 3J=6.2Hz), 0.70 (s， 18-CH3); (2)/ -product: 4.74(m， 3陽CH), 4.37 (q, 16-CH， V尸6.5Hz, 3J2=6.9Hz), 3.40 (dxd， 26-CHa, 2^10.7Hz， 3J=2.8Hz),3.34 (dxd， 26-CHb, V二10.7Hz， 3J=11.0Hz), 3.06 (d, 6-CH, V=1.7Hz), 2.01 (s, CH3-C(=0)-0)，1.00 (s, 19-CH3)， 0.93 (d, 21-CH3, V:6.9Hz), 0.72 (s, 18-CH3).
13CNMR (75MHz, CDC13, 5 ppm): 170.6, 170.2* (the carbonyl in acetyl group), 109.3(C-22), 80.7 (C-16), 71.4 (C-3), 66.9， 65.2， 62.2， 61.9， 59.0， 56.6， 51.0, 42.5, 40.4， 39.9, 38.0,36.7, 36.2， 35.2, 35.1， 32.2, 31.7， 31.4, 29.5, 29.0， 28.9, 27.3， 21.8, 21.4* (the methyl group inacetyl group), 20.5, 17.2, 16.4, 16.2， 16.0, 14.6.
ESI-MS(+): w/z 495 [M+Na]+.
3/ -乙酰氧基-5 -羟基-薯蓣皂武元-6-酮
将3/ -乙酰氧基-5，6-环氧薯蓣皂甙元U80mg， 0.380mmol)溶解在8mL2-丁酮中，搅拌下滴加0.5mL的75%三氧化铬水溶液(75%三氧化铬水溶液的配制将15g三氧化铬充分溶解在5mL水中，冷却至室温)，室温水浴(15°C)下搅拌10分钟。再滴加0.6mL的75。/。三氧化铬水溶液，继续搅拌20分钟。加入3mL异丙醇和15mL水，继续搅拌15分钟。用适量的氯仿萃取，有机相用饱和食盐水洗涤两次后加适量无水硫酸镁干燥，静置过夜。过滤后旋蒸除去溶剂进行柱层析，过滤后旋蒸除去溶剂进行柱层析，得产物112mg (Rf=0.50，乙酸乙酯正己烷=1:2)，产率60%。
'HNMR (300MHz, CDC13, S ppm): 5.01 (m, 3-CH), 4.38 (dxd, 16-CH, Vf7.2Hz，Vf7.6Hz), 3.49 (s, OH)， 3.44 (dxd， 26-CHa, 2J=10.6Hz， 3J=2.8Hz), 3.33 (dxd, 26-CHb,2J=10.6Hz, 3J=11.0Hz), 2.76 (t, 7-CH， Vfl2.0Hz， V2=12.4Hz), 1.97 (s， CH3-C(=0)-0), 0.94(d, 21-CH3, V=6.5Hz)， 0,80 (s, 19-CH3), 0.76 (d, 27-CH3， 3卢6.2Hz), 0.73 (s, 18-CH3).
13CNMR (75MHz, CDC13， S ppm): 212.4 (C-6), 171.3 (the carbonyl in acetyl group),109.3 (C-22)， 80.6 (C-5), 71.4 (C-3), 70.8, 66.9, 62.1, 56.1, 44.4, 42.5, 41.9, 41.7， 41.1， 39.7,36.8, 32.3, 31,6, 31.4, 30.3, 29.6, 28.8, 26.3， 21.4 (the methyl group in acetyl group), 21.3,17.2 (C-27), 16.5 (C-18), 14.5 (C-19), 14.0 (C-21).
ESI-MS(+): m/z 511 CM+Na]+.
3》-乙酰氧基-5-酮-5，6-断薯蓣皂甙元-6-酸
将3"-乙酰氧基-5，6-环氧薯蓣皂甙元(2.83g， 6mmo1)溶于lOOmL丙酮中，回流升温至5CTC，反应体系由混浊逐渐变澄清。滴加6当量的Jones试剂(Jones试剂的配制将2.6mL浓硫酸溶于11.2mL水中，再加入3g三氧化铬，冷却至室温)，继续回流4小时。停止加热并恢复至室温，加入3mL异丙醇并用50mL水稀释。用二氯甲垸萃取3次，再用饱和食盐水洗涤3次，有机相用无水硫酸镁干燥，静置过夜。过滤后旋蒸除去溶剂进行柱层析，得产物2.10g (Rf=0.38，乙酸乙酯正己垸=1:1)，产率69%。
'HNMR (300MHz, CDC13, 5 ppm): 10.2 (s, -C(=0)-OH), 5.35 (m, 3-CH), 4,37 (dxd，16-CH, 3j尸7.2Hz, 3J2=7.2Hz), 3.42 (dxd, 26-CHa, V=10.9Hz, 1^2.8Hz)， 3.31 (dxd, 26-CHb，1^10.9Hz, 3^11.0Hz)， 3.10 (dxd, 4-CHa， V-M.lHz, 3J=4.1Hz)， 1.99 (s， CH3-C(=0)-0),1,04 (s, 19-CH3), 0.93 (d, 21-CH3， 3J=6.5Hz)， 0.74 (d， 27-CH3, V=6.2Hz), 0.78 (s, 18-CH3).
13CNMR (75MHz, CDC13, 5 ppm): 216.2 (C-5), 177,6 (C-6)， 170.4 (the carbonyl inacetyl group), 109.4 (C-22), 80.4 (C-5)， 66.9, 60.5, 54.8, 52.5， 42.0, 41.8， 40.7， 39.9, 35.2，34.8, 32.1, 31.3， 30.3, 28.7, 25.3, 21.3 (the methyl group in acetyl group), 21.3, 17.8 (C-27),17,2 (C-19), 16.2 (C-18), 14.5 (C-21).
ESI-MS(+): ot/z 505 [M+H]+， 528 [M+Na]+, 543[M+K]+.实施例二:
乙酰去氢表雄酮
方法一将去氢表雄酮U.44g， 5mmd)溶解在15mL 二氯甲烷中，搅拌下加入吡淀1.2mL、乙酸酐lmL和N,N'-二甲基氨基吡啶(DMAP) 60mg，室温下继续搅拌12小时。冰冷条件下用稀盐酸(相对于吡腔当量的2倍)洗涤。有机相再先后用15mL水、10%碳酸氢钠溶液15mL、 15mL水洗涤，所得水相用5mL 二氯甲烷洗涤后将有机相合并。旋蒸除去溶剂后所得白色固体再用正己烷洗涤得白色固体1.22g，产率74.0%。
方法二将去氢表雄酮(2.88g， lOmmol)溶解在40mL吡啶中，搅拌下加入乙酸酐6mL和DMAP 120mg，室温下继续搅拌4.5小时。将反应液倒入搅拌中的250mL冰水中，继续搅拌10分钟后抽滤，用适量的水反复洗涤以尽可能地除去吡啶，红外灯下干燥至恒重，得3.22g白色固体，产率98%。
'HNMR (300MHz, CDC13, S ppm): 5.39， 5.37 (d, 6-CH), 4.60 (m, 3-CH), 2.48, 2.45,2.42, 2.39 (q, 4-CHa， 3J=8.6Hz, 2J=18.9Hz), 2.01 (s， CH3-C(=0)-0)， 1.02 (s， 19-CH3)， 0.86 (s:18-CH3).
13CNMR (75MHz, CDC13, S ppm): 221.0 (C-17), 170.5 (the carbonyl in acetyl group),140.0 (C-5)， 121,9 (C-6), 73.8 (C-3), 51.8 (C-14), 50.2 (C-9), 47.6 (C-13), 38.2 (C-4), 37.0(C-IO)， 36.8 (C-16), 35.9 (C-8), 31.5 (C-12), 31.4 (C-7), 30.8 (C-l)， 27.8 (C-2), 21.9 (C-15),21.5 (the methyl group in acetyl group), 20.4 (C-ll), 19.4 (C-18), 13.6 (C-19).
ESI陽MS(+): 353 [M+Na]+.
3/ -乙酰氧基-5，6-环氧雄甾-17-酮将乙酰去氢表雄酮(201mg， 0.609mmol)溶解在10mL氯仿中，搅拌下加入m-CPBA (158mg， 0.916mmo1)，室温下继续搅拌5小时，其间反应体系由澄清变成白色混浊。 反应停止后加入5mL氯仿稀释，反应液又呈无色澄清。用10%亚硫酸钠水溶液(pH=8) 洗涤至所得水相pH值为8左右(20mLx2)，水相用5mL氯仿洗涤。合并有机相，再用 饱和食盐水洗涤(20mLx2)，无水硫酸镁干燥，静置过夜。过滤后旋蒸除去溶剂并进行 柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯正己烷=1:2。得ct型产物(V=4.4Hz) 102mg (Rf=0.27， 乙酸乙酉旨正己垸=1:2); A型产物(V-2.4Hz)61mg(R尸0.48，乙酸乙酯正己烷-l:2)。 两种产物总产率77.0%。
'HNMR (300MHz, CDC13, 5 ppm): (l)a-product: 4.83 (m, 3-CH), 2.82 (d, 6-CH, 3J=4.4Hz)， 1.91 (s, CH3-C(=0)-0), 1.09 (s， 19-CH3), 0.71 (s， 18-CH3); (2)"-product: 4.66 (m, 3-CH), 3.03 (d, 6-CH， 3J=2.4Hz), 1.92 (s, CH3-C(=0)-0), 0.93 (s, 19-CH3), 0.74 (s, 18-CH3).
13CNMR (75MHz, CDC13， S ppm): (l)ct-product: 220.7 (C-17)， 170.5 (the carbonyl in acetyl group), 71.4 (C-3), 65.5 (C-5), 58,9 (C-6)， 52.1, 47.9, 43.0， 36.3, 36.0， 35.4， 32.4, 31.4, 29.8, 28.0， 27.5, 22.0, 21.6 (the methyl group in acetyl group), 20.2, 16.1 (C-19), 13.9 (C-18); (2)/ -product: 220.4 (C-17), 170.2(the carbonyl in acetyl group), 71.4 (C-3)， 63.2 (C-5), 58.9 (C-6), 51.2， 47.5, 43.0， 38,0, 36.7, 35.3, 31.5, 31.2， 29.8, 28.0， 27.5， 22.0, 21.3 (the methyl group in acetyl group), 20.2， 17.1 (C-19), 13.5 (C-18).
ESI-MS(+): w/z 369 [M+Na]+.
3/ -乙酰氧基-5 -羟基-雄甾-6，17-二酮
将3yS-乙酰氧基-5,6-环氧雄甾-17-酮U63mg， 0.470mmol)溶解在5mL2-丁酮中， 搅拌下滴加Jones试剂(Jones试剂的配制将lmL浓硫酸溶于4mL水中，再加入lg 三氧化铬，冷却至室温)lmL，室温水浴(15°C)搅拌10分钟后再滴加上述Jones试剂 0.5mL，继续搅拌20分钟。加入3mL异丙醇和10mL水，溶液由橙红色变为墨绿色。 用适量的二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，静置过夜。过滤后旋蒸除去溶剂并 进行柱层析，甲醇-二氯甲烷体系梯度洗脱，得白色固体124mg (Rf=0.32，甲醇二氯 甲烷=1:40)，产率73%。
'HNMR (300MHz, CDC13， S ppm): 4.97 (m, 3-CH), 3.93 (s, OH), 2.83 (t, 6-CH2, V-l^l2.4Hz), 1.93 (s， CH3-C(=0)-0), 0.79 (s, 19-CH3), 0.77 (s, 18-CH3).
13CNMR (75MHz, CDC13, S ppm): 220.3 (C-17), 212.2 (C-6), 171.2 (the carbonyl in acetyl group), 80.1 (C-5), 70.8 (C-3), 58.9 (C-6), 51.3, 48.3， 44.4, 42.6, 40.5， 36.8, 35.7, 32.2,
831,3, 29.6, 26.3, 21.6 (the methyl group in acetyl group), 21.4, 20.6, 13.9 (C-19), 13.8 (C-18). ESI-MS(+): w/z 385 [M+Na]+.
3/ -乙酰氧基-5，17-二酮-5，6-断雄甾-6-酸
方法--将3/ -乙酰氧基-5a-羟基-雄甾-6,17-二酮 (114rng， 0.315mmol)溶解在 5mL氯仿中，搅拌下加入m-CPBA (71mg， 0.412nimo1)，室温水浴(15°C)下搅拌8 小时。用5%碳酸氢钠水溶液(pH=7 8)洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，静置过夜。 过滤后旋蒸除去溶剂，采用亲脂性葡聚糖Sephadex LH-20凝胶柱层析进行分离，洗脱 剂为甲醇。所得30mg产物进行硅胶柱层析，甲醇-二氯甲垸体系梯度洗脱纯二氯甲烷 (20mL) l:30(60mL) l:20(40mL)，得脱乙酰基产物21mg (Rf=0.70，甲醇二氯甲烷 =1:15)，产率20%。
'丽MR (300MHz, CDC13, S ppm): 3.59 (m, 3-CH)， 3.24 (d, OH， 1/K3.8Hz)， 2.63 (dxd, 4-CHa, 1^18.0Hz, 3^3.0Hz)， 2.46 (dxd, 4-CHb, 2J=18.0Hz, 3户6.0Hz), 2.42 (dxd, 7-CHa, 2J=18.0Hz, 3^3.0Hz), U4 (s, 19-CH3), 0.88 (s， 18-CH3).
13CNMR (75MHz, CDC13， S ppm): 220.5 (C-17), 211.6 (C-5), 178.4 (C-6)， 56.0 (C-3), 55.4， 50.3, 49.4， 47.8， 46.7, 35.7 (2C)， 34.0， 31.2， 27.4， 24.3， 24.1， 20.3 (C-19), 13.5 (C-18).
ESI-MS(+): m/z 359 [M+Na]+; ESI掘(-):附/z 335 [M-町，
方法二将3"-乙酰氧基-5a-羟基-雄甾-6,17-二酮(1.73g， 5mmo1)溶于60mL丙酮 中，回流升温至50°C，反应体系由混浊逐渐变澄清。滴加6当量的Jones试剂(Jones 试剂的配制将2.6mL浓硫酸溶于11.2mL水中，再缓慢加入3g三氧化铬，冷却至室温)， 继续回流4小时。停止加热后恢复至室温，加入3mL异丙醇并用40mL水稀释。用二氯 甲烷萃取3次，有机相再用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸镁干燥并静置过夜。过滤后 旋蒸除去溶剂进行柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯正己烷=1:2，得产物1.633g (Rf=0.55， 乙酸乙酯正己烷=1:2)，产率86%。
'HNMR (300MHz, CDC13, S ppm): 9.10 (s， -C(O)-OH), 5.33 (m， 3-CH)， 3.10 (dxd, 4-CHa, 1^14.4Hz， 3^4.4Hz), 1.98 (s, CH3-C(=0)-0)， 1.03 (s, 19-CH3)， 0.85 (s, 18-CH3).
13CNMR (75MHz, CDC13, 5 ppm): 220.4 (C-17)， 216.0 (C-5)， 177.7 (C-6)， 170.4 (the carbonyl in acetyl group), 73.4 (C-3), 54.4, 49.7, 47.9, 43,2, 42.0, 35.8, 35.2, 34.5, 33.2, 31.4, 25.3, 22.4, 22.2, 21,3 (the methyl group in acetyl group), 17.7 (C-19), 13.5 (C-18).
ESI-MS(+): m々401 [M+Na]+， 417 [M+K]+.
上述合成方法是安全、方便、有效的(总产率60-70%)，非常适合大规模制备类似的目标化合物，具有很好的工业应用前景。 生物活性测试
由于以S-0139为前药，査阅S-0139及该公司ETA受体其他拮抗剂研究的相关文献， 采用大鼠主动脉平滑肌细胞A7r5为载体进行筛选实验。
本实验通过放射性配体结合实验对送检化合物进行活性筛选。该方法利用与受体亲 和性极高的放射性配体与待测化合物竞争结合该受体，通过固定放射性配体浓度，改变 待测化合物浓度，计算1<:5()(抑制50%结合的化合物浓度)。内皮素受体A拮抗剂的研究 一般采用125I-ET-1作为放射性配体，以天然表达或转染ETA受体的细胞株为载体。筛 选工作分成多次试验测得S0139阳性药物的ICs。稳定在1.6X 10-7 2.0X 10-9之间，与文 献报道S-0139的ICso值4.0X10—9基本一致，表明筛选试验体系的可靠性、稳定性。部 分化合物的内皮素受体A拮抗剂的ICso(抑制50%结合的化合物浓度)如下
IC 50: 4.0 X 10"8 IC 50: 3.2 X IC 50: 5.0 X 10.7
参考文献
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权利要求
1、甾体类化合物，具有以下化学结构式或其中，R选自CH3CO-，CH3CH2CO-，PhCO-，PhCH2CO-，PhCH＝CHCO-，HO2CCH2CH2CO-。
2、 根据权利要求1所述的甾体类化合物，其特征在于R为CH3CO-。
3、 权利要求l所述甾体类化合物的中间体其中，R的定义同权利要求l。
4、 权利要求3所述甾体类化合物的中间体，其特征在于R为CH3CO-。
5、 一种药物组合物，其包含权利要求1或2所述甾体类化合物与药学上可接受的载体。
6、 一种药物组合物，其包含权利要求3或4所述甾体类化合物中间体与药学上可接受 的载体。
7、 权利要求5所述的药物组合物在制备内皮素受体A拮抗剂相关的疾病的药物中的用 途。
8、 权利要求6所述的药物组合物在制备内皮素受体A拮抗剂相关的疾病的药物中的用 途。
全文摘要
本发明提供由薯蓣甾体皂苷元、孕甾酮，去氢表氢酮等结构改造得到具有内皮素受体A拮抗活性化合物的结构和合成方法。
文档编号C07J21/00GK101475623SQ20091002509
公开日2009年7月8日 申请日期2009年2月18日 优先权日2009年2月18日
发明者垚 华, 吴迪矛, 勇 巨, 檀爱民, 王冬春, 袁云霞, 陈向纯 申请人:江苏先声药物研究有限公司