专利名称：灯盏花提取物中灯盏花乙素的吸附树脂法分离工艺的制作方法
灯盏花提取物中灯盏花乙素的吸附树脂法分离工艺
技术领域：
本发明属于天然植物中单体活性成分的分离纯化技术领域。特别是灯 盏花素提取物中两种结构极为相近的单体成分——灯盏花乙素和灯盏花甲素的吸附分离 工艺，以及分离过程中所使用的高选择性吸附树脂的合成方法。
背景技术：
灯盏花，为菊科飞蓬属植物短葶飞蓬￡>/gera" 6m^cqp^ (Vant.) Hand. Mazz.的干燥全草，又名灯盏细辛、地顶草等，主要分布于我国西南地区的云南、广西等 省。灯盏花乙素(Scutdlarin)是灯盏花提取物中的主要黄酮类活性成分，对心、脑、肝、肾 等具有明显的保护作用。以灯盏花提取物为原料药的各种制剂已被临床广泛应用，如高血 压、冠心病、心肌梗塞、肝炎、糖尿病、肾病等疾病的治疗，但是临床应用中个别患者也 出现了冷热反应、皮肤瘙痒等过敏反应，另外其注射剂在使用中也表现出稳定性差、储存 时间短等缺陷，这都与制剂中仍含有一定量的杂质有关。因此，为了达到更为严格的质量 控制、减少药物使用过程中无法预期的毒副反应，高纯度灯盏花乙素的制备变得尤为重要。 目前，市售的灯盏花提取物(又称灯盏花素)中，灯盏花乙素约占85%左右，此外还包括 10n/。左右的灯盏花甲素(Apigenin-7-O-glucuronide)及其它少量杂质，作为原料药的灯盏花素 提取物中灯盏花乙素含量也仅为90%。研究表明，灯盏花素中的药效成分为灯盏花乙素， 因此灯盏花甲素也作为无效的杂质应予以去除，但是，灯盏花乙素和甲素结构极为相近(如 下图所示)，造成二者难以分离，分离成本大大提高。
OHO OH 0
OHH OH H
Scutellarin Apigenin-7-O-glucuronide
在灯盏花素提取纯化的传统方法中，溶剂萃取法仍是工业化生产中有效、成熟的方法(王 淑红等，加速溶剂萃取法用于灯盏细辛中灯盏乙素的测定[J]，药物分析杂志，2006， 26(5) :703)。但是溶剂萃取法的缺陷也显而易见， 一方面在提取纯化过程常需溶剂反复萃 取，不仅步骤繁杂，生产成本高，更重要的是经常在大量开放环境中使用甲醇、四氢呋喃 等低沸点、有毒的有机溶剂，损害操作人员的健康且环境污染严重；另一方面，溶剂萃取 法制备的灯盏花素提取物中，灯盏花乙素纯度较低(纯度低于85%)，且难以去除与灯盏 花乙素结构极为相近的灯盏花甲素，因此，目前市售的灯盏花素原料药常为灯盏花乙素和 灯盏花甲素的混合物。
近年来，吸附分离技术因其操作简便、环境友好、生产成本低、纯化效率高等优势越来越广泛的用于天然植物有效成分的分离纯化中。但是由于商品化的吸附树脂骨架仍以聚 苯乙烯为主，结构单一，吸附机理也以疏水性吸附为主，这都造成吸附分离方法选择性相 对较差。在灯盏花素的提取纯化中，大孔吸附树脂更多的是作为含量较低的有效成分的富 集材料，难以真正完成去除杂质，制备高纯度提取物的要求，例如楼云雁等探讨了利用商 品化的聚苯乙烯型大孔树脂纯化灯盏花素的可行性，研究表明，这些树脂可有效的去除部 分杂质，但是难以制备高纯度的灯盏花乙素(楼云雁等，静态吸附法选择纯化灯盏花素的 大孔树脂[J]，中医药学刊，2006， 24(6) :1129)。张人伟等公开了一项中国发明专利，使 用商品化的AB-8和D101大孔聚苯乙烯型吸附树脂为分离材料，用于市售灯盏花素原料 药的进一步纯化，得到纯度为90%左右的灯盏花乙素，但是在专利所公开的纯化工艺中， 只经树脂"吸附—解吸"一步过程得到的解吸液中，灯盏花乙素的纯度难以达到要求，仍需 将解吸液调节pH值以使其中的灯盏花素以沉淀的形式析出而达到进一步纯化的目的，因 此，操作工艺难以实现连续化，且较高酸性(pH=l~2)会破坏灯盏花素的结构稳定性。 更为重要的是，虽然经过树脂吸附、析出沉淀两步处理后，去除了大量杂质，使得灯盏花 乙素的纯度从80%提高到90%，但是由于AB-8或D101树脂的吸附选择性较差，难以实 现结构相近的灯盏花甲素和乙素的分离，因此利用专利公开的分离工艺，无法得到纯度更 高的、且不含灯盏花甲素的灯盏花乙素样品(张人伟等，用大孔树脂精制灯盏花素原料药 的制备方法，申请号200710065713.6，公开号CN 101037461A)。
发明内容本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种灯盏花提取物 中灯盏花乙素的吸附树脂法分离工艺。
从灯盏花甲素、灯盏花乙素的结构特点我们发现，虽然两个化合物结构极为相近，且 都具有能形成氢键的酚羟基结构，但是灯盏花乙素中两个酚羟基处于邻位，更易形成分子 内氢键，这将会大大削弱它形成分子间氢键的能力。因此，本发明从灯盏花乙素、灯盏花 甲素结构特征出发，设计合成了一种具有酰胺功能基的聚苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺 三元共聚物骨架的大孔吸附树脂，通过疏水和氢键的协同作用，选择性吸附灯盏花素提取 物中的单体有效成分一灯盏花乙素。
本发明提供的灯盏花提取物中灯盏花乙素的吸附树脂法分离工艺的步骤如下
第l、将具有酰胺功能基的聚苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺三元共聚物骨架的大孔 吸附树脂装入玻璃交换柱中(直径:柱长=1:8~1:20)，用去离子水清洗树脂柱，待用；
第2、将市售的灯盏花提取物(提取物中灯盏花乙素质量含量为80%~90%)溶解在 去离子水中，配成质量体积浓度为0.3~1.0mg/mL的灯盏花提取物溶液，调节溶液pH为 7.0~8.5,即为上柱液；
第3、室温下，将l-8BV的上柱液以0.5 2.5BV/小时的流速通过树脂柱吸附(其中 1BV为交换柱中树脂的体积)，同时接收从树脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用2-6BV 水清洗树脂床层，同时接收此部分水溶液，与上述流出液合并，旋转蒸发，浓缩，干燥，即得所需样品；经HPLC检测，灯盏花乙素质量含量高于98%，灯盏花甲素质量含量低于
0.5%;
将上述第3步吸附后的树脂柱用2~5 BV的体积浓度为30~50%的乙醇水溶液再生后
可重复使用。
其中，第1步所述的具有酰胺功能基的聚苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺三元共聚物 骨架的大孔吸附树脂由常规的正相悬浮聚合法制备，具体合成步骤如下
第l.l、将聚乙烯醇(PVA)和氯化钠(NaCl)溶于水中配成水溶液作为悬浮聚合的 水相，保持聚乙烯醇的质量浓度为0.5%~5%，氯化钠的质量浓度为3%~5%，并将水相加 热至30~50°C;
第1.2、将质量分数为30%~50%的丙烯酸甲酯、15%~25%的苯乙烯及余量为二乙烯 苯配成反应的单体，同时加入单体质量的100%~150%的混合溶剂作为致孔剂，混合溶剂 的组成为甲苯:长链烷烃(如正庚垸、液蜡、200#汽油等)质量比为1:1 2:1，加入单体质 量的1~3%的偶氮二异丁腈(AIBN)或过氧化苯甲酰(BPO)作为引发剂，混合均后，成 为反应的油相；
第1.3、将上述第1.2步中的油相加入到第1.1步的水相中，其中水相与油相的体积 比为3:1 4:1;开动搅拌，同时将反应体系升温至65 8(TC，反应4 6小时，再继续升温至 80~90°C，反应3-5小时，停止反应，过滤、洗漆、干燥，即得初始吸附树脂； 反应过程如下式所示
<image>image see original document page 5</image>第1.4、加入上述第1.3步得到的树脂质量的200%~500%的溶剂将其充分溶胀后，加 入含伯胺基的有机试剂H2N-(CH2)2-R，其用量为第1.3步得到的树脂质量的30%~50%， 升温至90 12(TC，充分反应8 15小时，停止反应，过滤、洗涤即得具有酰胺功能基的聚 苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺三元共聚物骨架的大孔吸附树脂，简称为酰胺树脂。
第1.4步所述的溶剂可为N,N-二甲基甲酰胺、二乙苯、苯乙酮等。
上述反应过程如下式所示<image>image see original document page 5</image>
(其中R基团可以为氢，胺基或酰胺基团)本发明的优点和积极效果
本发明根据灯盏花甲素、灯盏花乙素的结构特点，利用氢键和疏水作用的协同效应， 在大孔吸附树脂骨架上引入能形成氢键作用的特殊功能基(如酰胺基等)，基于灯盏花甲 素和灯盏花乙素形成分子间氢键的能力不同，通过疏水和氢键的协同作用，成功分离了灯 盏花甲素和灯盏花乙素，同时由于树脂只对具有酚羟基结构的黄酮类化合物有选择性吸附 的能力，因此，通过本发明合成的树脂，同时达到了去除其他杂质的目的，大大提高了树 脂的吸附选择性。
本发明在此基础上建立的分离工艺，对市售的灯盏花素提取物仅通过"吸附一解吸" 一步连续工艺即可实现结构极为相近的灯盏花甲素和灯盏花乙素的分离，制备纯度高于 98% (w%)的灯盏花乙素样品，同时确保该样品中灯盏花甲素含量低于0.5。/。(w。/。)，且该 工艺无需调节pH值析出沉淀、重结晶等其他步骤的辅助，有利于大规模的、连续化工业 化生产。
本发明所建立的吸附树脂分离纯化工艺操作简便，无需使用低沸点、有毒的有机溶 剂，且树脂可重复使用，这将大大降低生产成本，同时制备的样品可满足进一步提高灯盏 花素制剂的质量标准、减小临床使用中的过敏反应、提高制剂的储存稳定性等要求，有很 好的实际应用前景。
具体实施方式
实施例1:
酰胺树脂的制备方法，通过以下步骤实现
第一步:在1L三口瓶中将4.5g聚乙烯醇(PVA)和22.5g氯化钠(NaCl)溶于水，配 成500mL水溶液，并加热至45。C。另外将24g丙烯酸甲酯、12g苯乙烯、24g二乙烯苯、 60g甲苯、30g正庚烷、1.2g偶氮二异丁腈(AIBN)混合均匀后，加入三口瓶中，开动搅 拌，同时将反应体系升温至65°C反应5小时，再继续升温至80°C反应4小时。停止反应， 过滤、洗涤、干燥，即得初始吸附树脂。
第二步:加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 150mL将得到的54.8g树脂充分溶胀后，加 入20g的NH2(CH2)2NH2，混合均匀后，升温至95°C，充分反应10小时，停止反应，过 滤、洗涤，即得带有酰胺功能基的大孔吸附树脂，即为酰胺树脂。
实施例2:
第一步:在2L三口瓶中将23g聚乙烯醇(PVA)和32g氯化钠(NaCl)溶于水中，配 成900mL水溶液，并加热至35。C。另外将60g丙烯酸甲酯、18g苯乙烯、42g二乙烯苯、 90g甲苯、50g液蜡、1.2g过氧化苯甲酰(BPO)混合均匀后，加入三口瓶中，开动搅拌， 同时将反应体系升温至78'C反应6小时，再继续升温至90'C反应4小时。停止反应，过 滤、洗涤得到初始吸附树脂。第二步加入二乙苯400mL将得到的108.7g树脂充分溶胀后，加入40g的 NH2(CH2)2NHCOCH3，混合均匀后，升温至110°C，充分反应8小时，停止反应，过滤、 洗涤即得带有酰胺功能基的大孔吸附树脂，即为酰胺树脂。
实施例3:
第一步:在5L三口瓶中将lOOg聚乙烯醇(PVA)、 100g氯化钠(NaCl)溶于水中，配 成2000mL水溶液，并加热至4(TC。另外将75g丙烯酸甲酯、62.5g苯乙烯、112.5g二乙 烯苯、150g甲苯、150g的20(f汽油、7.5g偶氮二异丁腈(AIBN)混合均匀后，加入三 口瓶中，开动搅拌，同时将反应体系升温至65'C反应4小时，再继续升温至80°C反应5 小时。停止反应，过滤、洗涤得到初始吸附树脂。
第二步:加入苯乙酮700mL将得到的225.9g树脂充分溶胀后，加入90g的 NH2(CH2)2NHCOCH2CH3，混合均匀后，升温至120°C,充分反应12小时，停止反应，过 滤、洗涤即得带有酰胺功能基的大孔吸附树脂，即为酰胺树脂。
实施例4:
将上述酰胺树脂用于分离灯盏花乙素与灯盏花甲素，具体操作步骤如下 将30mL上述酰胺树脂装入玻璃交换柱(柱径14mm，柱长25cm)，用去离子水清洗 后，加入2BV、浓度为l.Omg /mL灯盏花提取物上柱液，通过树脂吸附，流速为1BV/小 时，同时接收从树脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用4BV水清洗树脂床层，同时接 收此部分水溶液，与上述流出液合并，旋转蒸发，浓縮，干燥，即得所需样品。经HPLC 检测，灯盏花乙素质量含量为99.4%,甲素未检出。将上述吸附后的树脂柱用2 BV的体 积浓度为30%的乙醇水溶液再生后可重复使用。 实施例5:
将50mL上述酰胺树脂装入玻璃交换柱(柱径18mm，柱长30cm)，用去离子水清洗 后，加入4BV、浓度为0.3mg /mL灯盏花提取物上柱液，通过树脂吸附，流速为1.5BV/ 小时，同时接收从树脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用3BV水清洗树脂床层，同时 接收此部分水溶液，与上述流出液合并，旋转蒸发，浓縮，干燥，即得所需样品。经HPLC 检测，灯盏花乙素质量含量为99.2%，甲素未检出。将上述吸附后的树脂柱用3 BV的体 积浓度30%的乙醇水溶液再生后可重复使用。
实施例6:
将100mL上述酰胺树脂装入玻璃交换柱(柱径25mm，柱长35cm)，用去离子水清洗 后，加入6BV、浓度为0.5mg /mL灯盏花提取物上柱液，通过树脂吸附，流速为2.5BV/ 小时，同时接收从树脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用5BV水清洗树脂床层，同时 接收此部分水溶液，与上述流出液合并，旋转蒸发，浓縮，干燥，即得所需样品。经HPLC 检测，灯盏花乙素质量含量为99.0%，甲素未检出。将上述吸附后的树脂柱用2 BV的体 积浓度为40%的乙醇水溶液再生后可重复使用。
实施例7:将500mL上述酰胺树脂装入玻璃交换柱(柱径34mm，柱长40cm)，用去离子水清洗 后，加入3BV、浓度为0.8mg /mL灯盏花提取物上柱液，通过树脂吸附，流速为2BV/小 时，同时接收从树脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用3BV水清洗树脂床层，同时接 收此部分水溶液，与上述流出液合并，旋转蒸发，浓縮，干燥，即得所需样品。经HPLC 检测，灯盏花乙素质量含量为99.1%,甲素未检出。将上述吸附后的树脂柱用3 BV的体 积浓度为45%的乙醇水溶液再生后可重复使用。
实施例8:
将1L上述所酰胺树脂装入玻璃交换柱(柱径55mm，柱长85cm)，用去离子水清洗 后，加入3BV、浓度为0.6mg /mL灯盏花提取物上柱液，通过树脂吸附，流速为2BV/小 时，同时接收从树脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用6BV水清洗树脂床层，同时接 收此部分水溶液，与上述流出液合并，旋转蒸发，浓缩，干燥，即得所需样品。经HPLC 检测，灯盏花乙素质量含量为99.5%，甲素未检出。将上述吸附后的树脂柱用5 BV的体 积浓度为50%的乙醇水溶液再生后可重复使用。
权利要求
1、一种灯盏花提取物中灯盏花乙素的吸附树脂法分离工艺，其特征在于，该工艺步骤如下第1、将具有酰胺功能基的聚苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺三元共聚物骨架的大孔吸附树脂装入玻璃交换柱中，用去离子水清洗树脂柱，待用；第2、将市售的灯盏花提取物溶解在去离子水中，配成质量体积浓度为0.3～1.0mg/mL的灯盏花提取物溶液，调节溶液pH为7.0～8.5，即为上柱液；第3、室温下，将1～8BV的上柱液以0.5～2.5BV/小时的流速通过树脂柱吸附，同时接收从树脂柱上流出的流出液，吸附完成后，用2～6BV水清洗树脂床层，同时接收此部分水溶液，与上述流出液合并，旋转蒸发，浓缩，干燥，即得所需样品；经HPLC检测，灯盏花乙素质量含量高于98％，灯盏花甲素质量含量低于0.5％；其中，第1步所述的具有酰胺功能基的聚苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺三元共聚物骨架的大孔吸附树脂经过如下步骤制成第1.1、将聚乙烯醇和氯化钠溶于水中配成水溶液作为悬浮聚合的水相，保持聚乙烯醇的质量浓度为0.5％～5％，氯化钠的质量浓度为3％～5％，并将水相加热至30～50℃；第1.2、将质量分数为30％～50％的丙烯酸甲酯、15％～25％的苯乙烯及余量为二乙烯苯配成反应的单体，同时加入单体质量的100％～150％的混合溶剂作为致孔剂，混合溶剂的组成为甲苯∶长链烷烃质量比为1∶1～2∶1，加入单体质量的1～3％的偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰作为引发剂，混合均匀后，成为反应的油相；第1.3、将上述第1.2步中的油相加入到第1.1步的水相中，其中水相与油相的体积比为3∶1～4∶1；开动搅拌，同时将反应体系升温至65～80℃，反应4～6小时，再继续升温至80～90℃，反应3-5小时，停止反应，过滤、洗涤、干燥，即得初始吸附树脂；第1.4、加入上述第1.3步得到的树脂质量的200％～500％的溶剂将其充分溶胀后，再加入第1.3步得到的树脂质量的30％～50％的含伯胺基的有机试剂H2N-(CH2)2-R，混合均匀后，升温至90～120℃，充分反应8～15小时，停止反应，过滤、洗涤即得具有酰胺功能基的聚苯乙烯-聚丙烯酸酯-聚丙烯酰胺三元共聚物骨架的大孔吸附树脂，简称为酰胺树脂。
2、 根据权利要求1所述的分离工艺，其特征在于第1步中的玻璃交换柱的直径:柱长 =1:8~1:20。
3、 根据权利要求1所述的分离工艺，其特征在于将上述第3步吸附后的树脂柱用2~5 BV的体积浓度为30~50%的乙醇水溶液再生后可重复使用。
4、 根据权利要求1或2或3所述的分离工艺，其特征在于第2步所述的市售灯盏花 提取物中灯盏花乙素质量含量为80%~90% 。
5、 根据权利要求1或2或3所述的分离工艺，其特征在于第L4步所述的溶剂可为 N,N-二甲基甲酰胺、二乙苯、苯乙酮等。
全文摘要
本发明公开了一种灯盏花提取物中灯盏花乙素的吸附树脂法分离工艺。基于结构极为相近的灯盏花乙素和灯盏花甲素形成分子间氢键能力的不同，在大孔吸附树脂骨架上引入能形成氢键的酰胺功能基，通过疏水和氢键的协同作用，高选择性吸附灯盏花乙素，以市售提取物为原料，通过“吸附-解吸”一步连续工艺，制备灯盏花乙素含量高于98％、灯盏花甲素含量低于0.5％的样品。本发明避免使用有毒、低沸点的有机溶剂，且无需其他纯化方法的辅助，因此操作简单、环境友好，同时树脂可再生使用，生产成本大大降低，适于大规模工业化生产。所得样品可满足进一步提高灯盏花素制剂的质量标准、减小临床副反应等要求，有很好的应用前景。
文档编号C07H17/00GK101580527SQ20091006866
公开日2009年11月18日 申请日期2009年4月29日 优先权日2009年4月29日
发明者施荣富, 王春红, 艳 赵 申请人:南开大学