专利名称：一种高纯达托霉素的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种达托霉素的制备方法，具体地说，涉及一种采用膜分离和树脂层 析技术制备高纯达托霉素的方法。
背景技术：
病原菌对抗生素产生耐药性是当今全球面临的严峻挑战之一，寻找能有效抑制抗 药菌的抗生素是解决这一问题的根本途径。万古霉素，曾被认为是抗革兰氏阳性菌的最后 一道防线，然而全世界范围内临床上发现了越来越多的耐此药菌。达托霉素(Daptomycin)被公认为在万古霉素之后的最佳备用抗生素，是美国礼 莱公司20世纪80年代发现的新型脂肽类抗生素，对MRSA(耐甲西林金黄葡萄球菌)有明 显的抑制作用，除抗MRSA之外，达托霉素还对绝大多数的革兰氏阳性菌有抑制作用。据报 道，达托霉素对2002 2005年从美国和加拿大各医院收集的19615株临床革兰氏阳性菌 中的99%存在抑制作用。自从2003年9月FDA首次批准Cubicin (Daptomycin注射剂)用 于治疗复杂皮肤和皮肤结构感染以来，达托霉素在临床上应用越来越多，市场上对达托霉 素的需求量越来越大。达托霉素虽然2003年在美国实现工业化，然而在中国未能实现规模化生产，一是 因为没有好的工业化生产菌种，二是因为没有掌握工业化后提取技术。在提取技术方面，国内基本还处于工艺技术的研究阶段，除华北制药发表过关于 大孔吸附树脂分离纯化达托霉素的论文外，无其他关于后提取方面的报道。采用大孔吸附 树脂分离，得到的纯化液含量只有80%左右，不能满足制药的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种容易操作，成本低的制备高纯度达托霉素方法。为了实现本发明目的，本发明的一种达托霉素的制备方法，包括如下步骤1)先将发酵产生的达托霉素菌液用截留分子量为10000 100000的一级膜分离 系统处理，得到达托霉素滤液；2)然后将所述达托霉素滤液经过截留分子量为50 1500的二级膜分离系统处 理，得到达托霉素浓缩液；3)所述达托霉素浓缩液再经过阳离子树脂吸附，酸梯度洗脱后，经过阴离子树脂 中和，得到达托霉素中和液；4)所述达托霉素中和液再经截留分子量为500 800的三级膜系统进行浓缩，得 到高浓度的达托霉素浓缩液；5)所述达托霉素浓缩液最后进行浓缩和结晶，得到高纯度的达托霉素结晶固体。其中，所述一级膜分离系统可去除菌丝体、可溶性蛋白、培养基及部分色素等，多 采用截留分子量为10000 100000的膜系统，最佳截留分子量为10000 50000，可以是各 种超滤膜系统。
所述一级膜分离系统，加水洗涤量为原料液量的1 2. 5倍，洗涤终止后收率达 95%以上。所述二级膜系统进行浓缩分离，并脱盐脱色，去除一些单糖、大量无机盐等小分子 杂质，采用截留分子量为50 1500的膜系统，最佳截留分子量为500 800，可以是各种纳 滤膜系统。所述二级膜分离系统，加水洗涤量为原料液量的0. 5 1. 5倍，最终浓缩倍数达 8 10倍左右。最终浓缩液电导控制在2000uS/cm以下，最佳控制在lOOOus/cm以下。所述三级膜分离系统，采用纳滤膜，最佳截留分子量为500 800。三级膜分离系统，纳滤后电导值为lOOOus/cm以下，最佳电导值控制在500uS/cm 以下。所述阳离子交换树脂采用二乙烯苯交联的聚苯乙烯为基质的磺酸型的强酸性离 子交换树脂；阴离子交换树脂是凝胶型弱碱性阴离子交换树脂。强酸性阳离子交换树脂层析柱内径和填装高度之比为1 2以上，优选1 4 1 6。本发明达托霉素发酵液，经过一级、二级膜分离系统后，再经过阳离子交换树脂吸 附，梯度酸洗，液相跟踪检测，收集达托霉素纯度在90%以上的组分，用阴离子交换树脂中 和，中和液进入三级纳滤膜系统进行浓缩，得到澄清的高含量的达托霉素浓缩液，此浓缩液 中达托霉素纯度可以达到95%以上。浓缩液再经过常规减压浓缩至浓度为50%左右，加等 量的乙醇，0 5°C静置结晶，过滤干燥后，得到固体的达托霉素，纯度在98%以上。本发明测定达托霉素含量的方法采用高效液相色谱法，其检测条件与论文“达托 霉素发酵液大孔树脂吸附分离的研究”(中国抗生素杂志2008年2月第33卷第2期)的 相同。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实验材料为达托霉素发酵液，pH值为7. O左右，料液较为粘稠。实施例1先将达托霉素发酵液经过截留分子量为100000的有机平板超滤膜过滤，平均膜 通量可以达到60LMH，加水量为原料液的1. 5倍，最终浓缩倍数为2倍。超滤膜过滤的平均 收率可以达99%。通过大分量超滤膜系统过滤，去除了菌丝体及大部分大分子物质(如可 溶性蛋白、培养基及部分色素)，滤液澄清度高，质量很好，能够满足生产工艺要求。滤液再经纳滤膜进一步浓缩，并脱盐脱色，纳滤膜选用截留分子量为500的卷式 纳滤膜，平均膜通量为25LMH，加水量控制在原超滤液的0. 5倍左右，最终浓缩倍数在8倍左 右，这样最终浓缩液电导可控制在lOOOus/cm以下。透过液基本无损失，收率可达到98%。 通过纳滤膜脱盐脱色，去除一些单糖、大量无机盐等小分子杂质，得到澄清的达托霉素浓缩 液。浓缩液经过一个填有阳离子交换树脂(优选磺酸型的强酸性离子交换树脂)的层 析柱，层析柱内径为100cm，填柱高度为450cm，控制流速为每小时0.3倍柱体积。流完后 改用洗脱剂洗脱，洗脱剂的流速为每小时0. 3倍柱体积，洗脱剂为盐酸溶液，通过一个混合泵，将洗脱剂配成不同的浓度，进入层析柱，最初进入的浓度为0. OlN的盐酸溶液，以后以 0. OlN的梯度变化，最后浓度为0. 05N。洗脱过程中，液相跟踪检测，收集纯度在90%以上的 达托霉素洗脱液。浓缩液用弱碱性阴离子交换树脂(优选凝胶型弱碱性阴离子交换树脂) 中和到pH7. 0左右。将上述中和液，用截留分子量为800的纳滤膜浓缩，平均膜通量为25LMH，加水量 控制在原超滤液的1. 5倍左右，最终浓缩倍数在10倍左右，这样最终浓缩液电导可控制在 500us/cm 以下。浓缩液常规真空浓缩到浓度为50% (w/w)，加等量的乙醇，冰箱放置10小时，过 滤，干燥，得到固体的高纯度达托霉素，经检测，纯度在98. 5%以上。实施例2先将达托霉素发酵液经过截留分子量为50000的有机平板超滤膜过滤，平均膜通 量可以达到60LMH，加水量为原料液的2. 5倍，最终浓缩倍数为3倍。超滤膜过滤的平均收 率可以达99%。通过大分量超滤膜系统过滤，去除了菌丝体及大部分大分子物质(如可溶 性蛋白、培养基及部分色素)，滤液澄清度高，质量很好，能够满足生产工艺要求。滤液再经纳滤膜进一步浓缩，并脱盐脱色，纳滤膜选用截留分子量为800的卷式 纳滤膜，平均膜通量为25LMH，加水量控制在原超滤液的1. 5倍左右，最终浓缩倍数在10 倍左右，这样最终浓缩液电导可控制在lOOOus/cm以下。透过液基本无损失，收率可达到 98%。通过纳滤膜脱盐脱色，去除一些单糖、大量无机盐等小分子杂质，得到澄清的达托霉 素浓缩液。浓缩液经过一个填有阳离子交换树脂(优选磺酸型的强酸性离子交换树脂)的层 析柱，层析柱内径为100cm，填柱高度为600cm，控制流速为每小时0.3倍柱体积。流完后 改用洗脱剂洗脱，洗脱剂的流速为每小时0. 3倍柱体积，洗脱剂为盐酸溶液，通过一个混合 泵，将洗脱剂配成不同的浓度，进入层析柱，最初进入的浓度为0. OlN的盐酸溶液，以后以 0. OlN的梯度变化，最后浓度为0. 05N。洗脱过程中，液相跟踪检测，收集纯度在90%以上的 达托霉素洗脱液。浓缩液用弱碱性阴离子交换树脂(优选凝胶型弱碱性阴离子交换树脂) 中和到pH7. 0左右。将上述中和液，用截留分子量为500的纳滤膜浓缩，平均膜通量为25LMH，加水量 控制在原超滤液的1.0倍左右，最终浓缩倍数在10倍左右，这样最终浓缩液电导可控制在 500us/cm 以下。浓缩液常规真空浓缩到浓度为50% (w/w)，加等量的乙醇，冰箱放置10小时，过 滤，干燥，得到固体的高纯度达托霉素，经检测，纯度高达99%以上。本发明所用的各种过滤膜在使用一段时间后，可采用膜清洗剂进行清洗，使膜通 量得以较好的恢复，保证重复使用，以获得工业化正常生产的需求。本发明综合运用膜分离技术及树脂层析技术，提供了一种生产上可行的容易操作 的制备高纯度达托霉素的方法。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
一种高纯达托霉素的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤1)先将发酵产生的达托霉素菌液用截留分子量为10000～100000的一级膜分离系统处理，得到达托霉素滤液；2)然后将所述达托霉素滤液经过截留分子量为50～1500的二级膜分离系统处理，得到达托霉素浓缩液；3)所述达托霉素浓缩液再经过阳离子树脂吸附，酸梯度洗脱后，经过阴离子树脂中和，得到达托霉素中和液；4)所述达托霉素中和液再经截留分子量为500～800的三级膜系统进行浓缩，得到高浓度的达托霉素浓缩液；5)所述达托霉素浓缩液最后进行浓缩和结晶，得到高纯度的达托霉素结晶固体。
2.根据权利要求1所述的达托霉素的制备方法，其特征在于，所述一级膜分离系统为 截留分子量为10000 50000的膜系统。
3.根据权利要求2所述的达托霉素的制备方法，其特征在于，所述一级膜分离系统为 超滤膜。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的达托霉素的制备方法，其特征在于，所述一级膜 分离系统的加水洗涤量为达托霉素菌液量的1 2. 5倍。
5.根据权利要求1-4任意一项所述达托霉素的制备方法，其特征在于，所述二级膜分 离系统为截留分子量为500 800的膜系统。
6.根据权利要求5所述达托霉素的制备方法，其特征在于，所述二级膜分离系统为纳 滤膜。
7.根据权利要求1-6任意一项所述达托霉素的制备方法，其特征在于，所述二级膜分 离系统的加水洗涤量为原料液量的0. 5 1. 5倍，最终浓缩倍数达8 10倍。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的达托霉素的制备方法，其特征在于，所述三级膜 分离系统采用纳滤膜。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的达托霉素的制备方法，其特征在于，所述阳离子 交换树脂采用二乙烯苯交联的聚苯乙烯为基质的磺酸型的强酸性离子交换树脂；所述阴离 子交换树脂是凝胶型弱碱性阴离子交换树脂。
10.根据权利要求9所述的达托霉素的制备方法，其特征在于，强酸性阳离子交换树脂 层析柱内径和填装高度之比为1 2以上，优选1 4 1 6。全文摘要
本发明提供了一种高纯达托霉素的制备方法，其先采用一级膜滤的方法将发酵液中菌丝体、可溶性蛋白、培养基及部分色素等去除；再用二级膜滤系统，进行浓缩，去除一些单糖、大量无机盐等小分子杂质，得到澄清的达托霉素浓缩液；然后经过阳离子交换树脂层析，阴离子交换树脂中和后，用纳滤膜浓缩和常规减压浓缩后，结晶得到高纯度达托霉素。本发明综合运用膜分离技术及树脂层析技术，提供了一种生产上可行的容易操作的制备高纯度达托霉素的方法。
文档编号C07K1/18GK101899094SQ20091008583
公开日2010年12月1日 申请日期2009年6月1日 优先权日2009年6月1日
发明者余永柱, 尚海涛, 张彦, 潘声龙, 郑珩 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司