专利名称：一种硝基呋喃化合物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种硝基呋喃化合物及其制备方法与应用。
背景技术：
硝基呋喃类物质(Nitrofbrans)是一类人工合成的具有5-硝基呋喃环基本结构的 广谱抗菌药物，主要包括呋喃西林(Nitroforazone)、呋喃妥因(NitrofUrantion)、呋喃 唑酮(Furazolidone)和呋喃它酮(Fumltadone)。硝基呋喃类物质对大多数革兰氏阳性 菌、革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用，在畜禽养殖、水产养殖上 应用非常广泛。但硝基呋喃类物质对畜禽有一定的毒性，动物大剂量或长期连续服 用硝基呋喃类物质易引起中毒性反应，表现为厌食、腹泻、胃肠出血、周围神经炎、 兴奋、惊厥或瘫痪等，中毒严重时甚至可以引起动物死亡。同时硝基呋喃类物质也 是一类具有潜在致癌性和诱导有机体产生突变的物质。1990年7月欧盟颁布 2377/90/EEC条例，将硝基呋喃类物质及其代谢产物列为A类禁用药物，规定其在动 物源性食品中的残留检测限为1.0pg/kg。由于对呋喃唑酮蛋白结合态残留物的安全 性产生怀疑，自1995年起，欧盟全面规定禁止使用呋喃类抗菌物质，在动物源性食 品中呋喃类残留物的检出限为不得检出。欧盟从1997年开始将所有的硝基呋喃类抗 生素全部列为违禁药物。2004年美国FDA公布了禁止在进口动物源性食品中使用的 ll种药物名单，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我国农业部文件农牧发[2002] l号 也规定动物源性食品中呋喃唑酮的检出限为不得检出。目前，国内外都对呋喃类物 质的控制相当严格，各国对于呋喃类物质测定的标准都有明确的规定。
国内外已发表的有关硝基呋喃类抗生素残留检测方法的文献中，早期的文献报 道多数是检测原药化合物。但研究表明，硝基呋喃类物质原药的半衰期通常只有几 小时，而其代谢产物则可以长达数周仍能在动物组织中残留。目前，国内外报道多 见于检测硝基呋喃类物质的代谢物，仪器检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、 液相色谱-质谱法(LC-MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。其中，LC-UY、 LC-MS及LC-MS/MS是目前用来检测硝基呋喃类物质代谢物最常用的方法，但在实 际操作中需要有LC-UV、 LC-MS及LC-MS/MS等高档仪器，且前处理复杂、繁琐、 操作时间长、操作技术要求高。而免疫分析方法采用针对硝基呋喃类物质代谢物的特异性抗体，可以有很高的精确度、灵敏性和特异性，且对技术要求不高，具有检测时间短，适用于大批量测定等优点。免疫分析检测技术是近年来在环境、食品安全监测领域逐渐广泛应用的一种快速、高通量、低成本的检测技术，已逐渐成为世界各国对有毒有害残留物快速筛选监测的主要方法之一，这为硝基呋喃类物质代谢
物的检测提供了一种新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种硝基呋喃化合物及其制备方法与应用。
本发明所提供的硝基呋喃化合物，是将5-硝基呋喃-2-丙烯酸与载体蛋白偶联得到的偶联物。
上述硝基呋喃化合物中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
上述硝基呋喃化合物的制备方法包括以下步骤
1) 将5-硝基呋喃-2-丙烯酸、N,N，-二环己基碳化二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合，将混合物溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶液A;
将载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，得到溶液B;
2) 将溶液B滴加到溶液A中，得到硝基呋喃化合物。
上述方法中，所述步骤l)中，所述5-硝基呋喃-2-丙烯酸、所述N,N，-二环己基碳化二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1: (3-5) : (2-3)，具体可
为1: 4: 3;
所述载体蛋白具体可为牛血清白蛋白(BSA);
所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4，摩尔浓度为0.01M;
所述5-硝基呋喃-2-丙烯酸与载体蛋白的摩尔比为(8-10): 1，具体可为8: 1。上述方法还包括将所述硝基呋喃化合物进行透析的步骤，所述透析的条件为
4-20°C用PBS透析72-96小时，具体可为4°C用PBS溶液透析72小时；
前三次，每隔4小时更换一次透析液，从第四次开始，每10-12小时更换一次
透析液；
上述方法还包括将透析后的硝基呋喃化合物进行离心取上清的步骤，所述离心的条件为4°C条件下5000-8000rmp离心20-30分钟，具体可为4°C条件下5000 rpm离心30分钟。
将制备好的硝基呋喃化合物真空冷冻干燥。上述硝基呋喃化合物可用于制备硝基呋喃类物质的抗体。上述硝基呋喃化合物还可用于检测硝基呋喃类物质。用上述硝基呋喃化合物制备的抗体也属于本发明的保护范围。所述抗体为单克隆抗体。
用上述硝基呋喃化合物作为免疫原免疫新西兰大白兔，制备对硝基呋喃类物质
有特异反应的抗体。经ELISA实验鉴定，获得的抗血清效价达到h 102400。这为硝基呋喃类物质的酶联免疫检测方法中所用检测试剂的开发以及制备硝基呋喃类物质的酶联免疫检测试剂盒提供了广阔的应用和发展空间。且检测方法具有简便、特异、准确的特点，可以用于动物源性食品中硝基呋喃类物质的快速、高效筛选。不但可以节省大量的检验时间，还可以实现现场操作，从而弥补了仪器检验费时费力，需要大型昂贵仪器设备支持，需要专门操作人员，难于普及推广的不足。为快速检测硝基呋喃类物质奠定了技术基础。
具体实施例方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下面结合具体的实施例阐述硝基呋喃化合物的制备过程。实施例l、硝基呋喃化合物的合成与鉴定1、硝基呋喃化合物的合成
1) 溶液A的制备在50mL圆底烧瓶内，在不断搅拌的状态下，依次将18.3mg(O.l mmol)的5-硝基呋喃-2-丙烯酸、82.5 mg (0.4mmo1)的N,N，-二环己基碳化二亚胺和34.5mg (0.3mmo1)的N-羟基琥珀酰亚胺加入到20 mLN,N-二甲基甲酰胺中，反应8小时，得到溶液A;
2) 溶液B的制备在100mL圆底烧瓶内，将300mgBSA加入到30mLPBS(0,01 M， pH7.4)中，得到溶液B;
3) 在20。C-30。C条件下，在搅拌状态下，将溶液B逐滴加入到溶液A中，反应8小时；
4) 将上述步骤3)的反应液装入透析袋中，4'C条件下用PBS透析72小时，前三次每隔4小时更换一次透析液，之后每10-12小时更换一次透析液；然后将透析液在4。C条件下5000rpm离心30分钟，取上清液，真空冷冻干燥，得到462 mg浅黄色固体。2、硝基呋喃化合物的鉴定
采用紫外光谱法对上述步骤1获得的硝基呋喃化合物进行鉴定，只要上述步骤1制备的硝基呋喃化合物的紫外图谱与载体蛋白和5-硝基呋喃-2-丙烯酸的紫外图谱相比发生了变化，则可以判断硝基呋喃化合物与载体蛋白偶联成功。通过比较三者260nm和280nm的吸收值计算上述步骤1获得的硝基呋喃化合物和BSA的结合比。结果表明，5-硝基呋喃-2-丙烯酸与BSA的结合比为12: 1。
实施例2、抗体的制备
1、 免疫动物制备抗血清
采用5只新西兰大白兔作为免疫动物，以上述实施例l制备的硝基呋喃化合物作为免疫原，免疫剂量为lmg/kg。免疫方法如下首免时将免疫原用等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，颈背部皮下多点注射，间隔3-4周，将免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂混合制成乳化剂，加强免疫一次，共免疫5次(首免与加强免疫共免疫5次)，最后一次不加佐剂。
最后一次免疫后7-10d将兔子处死，采用心脏采血法采血，每只兔子可采血80mL左右，将采集的血液样本在4。C冰箱中放置5-6小时，然后5000 rpm离心10 min，分离血清，血清经适当稀释后用间接ELISA方法测定效价。第五次免疫时，兔子获得了高效价的抗体，抗血清的滴度为h 102400。
2、 抗体的纯化
采用辛酸-硫酸铵盐析法对上述步骤1获得的抗血清进行纯化。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来，上清中只有IgG。辛酸加入因抗体来源的不同而不同，人血清为70 pl/mL，兔血清为75 |il /mL，小鼠血清为40 pl /mL。实验设三次重复，结果表明，采用上述方法IgG的回收率达90。/。以上。
3、 抗血清最低检测限(LOD值)和半数抑制量(IC50)的检测用方阵滴定法确定上述实施例l制备的硝基呋喃化合物和上述步骤l制备的抗
血清的工作浓度，上述实施例1制备的硝基呋喃化合物的工作浓度为500 ng/ml，抗血清的最佳稀释度为8000X 。
用不同浓度的5-硝基呋喃-2-丙烯酸的标准品溶液(购自SigmaAldrich公司)做实验溶液，其浓度如下(单位ng/mL): Ong/ml、 0. 07ng/ml 、 0. 22 ng/ml、 0. 68 ng/ml、2 ng/ml、 6. 17ng/ml、 18. 5ng/ml、 55. 5ng/ml、 167ng/ml、 500 ng/ml。釆用8组平行试验(『8)。间接竞争性ELISA方法用上述工作浓度的上述实施例l制备的硝基呋喃化合物
包被酶标板，将实验溶液与抗体溶液同时加入酶标板小孔中，同时设置空白孔(将
添加的抗体溶液换成高纯水，其它一致)和阴性对照孔(将添加的实验溶液用PBS溶液代替，其它一致)，37。C温育0.5h，倒出孔内液体，用洗涤液(10XPBST)洗涤3-5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍打；加入酶标二抗溶液于酶标板小孔中，37'C温育0.5h，用洗涤液重复洗3-5次，吸干；加入底物显色溶液到酶标板小孔中，室温下反应10-15min，用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值A。以吸光度值A为纵坐标，以标准品实验溶液浓度的loglO值为横坐标，绘制半对数标准曲线图。标准曲线具有完整的反S形状，并具有上平台和下平台，标准曲线的平行测定次数8次，实验重复性良好，相对标准偏差(变异系数)均在15%以内。
根据标准曲线得出10%抑制量和半数抑制量(IC50)，比较检测灵敏度。
抑制率用以下式计算
抑制率(%>= (OD丽画OD隱M肌-OD圍) 。
(OD應國ODm,n)
式中ODraax为不加标准品时的吸光值(即阴性对照)，ODx为标准品浓度为x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。
结果表明，半数抑制量(IC5o)为1.0 1.4ng/mL，最低检测限(LOD)为0.18~0.22ng/mL，在0.18ng/mL 10.4ng/mL范围内，抑制率与药物浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为产0.9795。
4、抗体的特异性检测
抗血清的特异性就是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应率作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗血清的特异性越好。
将5-硝基呋喃-2-丙烯酸(5-硝基呋喃-2-丙烯酸作为目标分析物)与其类似物(呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮)进行系列稀释，然后分别与上述步骤l制备的抗血清反应，制作标准曲线，在曲线上分别找出上述实施例l制备的硝基呋喃化合物抑制率50%的剂量和其类似物(呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮)抑制率50%时的剂量，计算出硝基呋喃化合物及其类似物(呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、呋喃它酮)的交叉反应率。
交叉反应率(％)=(引起50%抑制的5-硝基呋喃-2-丙烯酸的浓度/引起50%抑制的其它物质的浓度)xioo%。
实验设三次重复，取三次重复的平均值作为实验结果。由ELISA方法建立的标准曲线可以看出，上述实施例l制备的硝基呋喃化合物的特异性较好，上述实施例l制备的硝基呋喃化合物的特异性抗体对5-硝基呋喃-2-丙烯酸、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮的交叉反应率为100%、 89%、 82%、 71%和68%，由此可知，上述实施例l制备的硝基呋喃化合物的特异性抗体可以作为同时识别硝基呋喃类物质的通用抗体，满足硝基呋喃类物质的广泛、高效筛选。
权利要求
1、一种硝基呋喃化合物，是将5-硝基呋喃-2-丙烯酸与载体蛋白偶联得到的偶联物。
2、 根据权利l所述的化合物，其特征在于所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
3、 权利要求1或2所述化合物的制备方法，包括以下步骤1) 将5-硝基呋喃-2-丙烯酸、N,N，-二环己基碳化二亚胺(DCC)和N-羟基琥 珀酰亚胺(NHS)混合，将混合物溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶 液A;将载体蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，得到溶液B;2) 将溶液B滴加到溶液A中，得到硝基呋喃化合物。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤l)中，所述5-硝基呋 喃-2-丙烯酸、所述N,N，-二环己基碳化二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(3-5) : (2-3)，优选为1: 4: 3。
5、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤l)中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白。
6、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述5-硝基呋喃-2-丙烯酸与载 体蛋白的摩尔比为(8-10): 1，优选为8: 1。
7、 根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法还包括将所 述权利要求1或2所述化合物进行透析的步骤，所述透析的条件为4-20°C用PBS 透析72-96小时，优选为4°C用PBS溶液透析72小时；所述方法还包括将透析后的权利要求1或2所述化合物进行离心取上清的步 骤，所述离心的条件为4°C条件下5000-8000rmp离心20-30分钟，优选为4°C条 件下5000 rpm离心30分钟。
8、 权利要求1或2所述的化合物在制备硝基呋喃类物质抗体中的应用。
9、 权利要求1或2所述的化合物在检测硝基呋喃类物质中的应用。
10、 以权利要求1或2所述的化合物为免疫原制备的抗体。
全文摘要
本发明公开了一种硝基呋喃化合物及其制备方法与应用。该化合物是将5-硝基呋喃-2-丙烯酸与载体蛋白偶联得到的偶联物。用上述硝基呋喃化合物免疫新西兰大白兔，制备对硝基呋喃类物质有特异反应的抗体。经ELISA实验鉴定，获得的抗血清效价达到1∶102400。这为硝基呋喃类物质的酶联免疫检测方法中所用检测试剂的开发以及制备硝基呋喃类物质的酶联免疫检测试剂盒提供了广阔的应用和发展空间。且检测方法具有简便、特异、准确的特点，可以用于动物源性食品中硝基呋喃类物质的快速、高效筛选。为快速检测硝基呋喃类物质奠定了技术基础。
文档编号C07K14/435GK101643505SQ20091008564
公开日2010年2月10日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者吴小平, 静 张, 江海洋, 进 王, 王亚辉, 王战辉, 阮永磊 申请人:北京维德维康生物技术有限公司