专利名称：：人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体、相关的宿主细胞、诊断试剂和诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程和免疫学
技术领域：
，更具体地，涉及单克隆抗体
技术领域：
，特别是指一种人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体、相关的宿主细胞、诊断试剂和诊断试剂盒。
背景技术：
：胎膜在足月产前发生破裂，称为胎膜早破(Prematureruptureofmembrane,PROM)；胎膜早破的发生率约为10%，其中临床上对30%左右的孕妇进行PROM检查；目前全国孕妇数量为10001400万左右。因此，胎膜早破是早产和新生儿并发症的最常见原因之一，也是当前产科临床遇到的最为棘手的治疗难点之一。在胎膜破裂发生24小时之后诊断会增加胎儿患病率和死亡率。PROM—旦发生，若处理不当可危及母儿生命。由于诊断方法不同，而使诊断率有较大的差异，在处理上给予假阳性病例不必要的干预，可导致早产，反之，让假阴性者盲目的等待，可引起严重感染。尤其是广大的农村地区，危害更甚。对胎膜早破进行及时、准确的诊断是预防孕产妇和新生儿感染、死亡的关键。当前国内外临床上主要采用的方法分析如下1)阴道积液(流水)阴道存在可见积液(羊水池)，或者从宫颈到阴道后穹隆有明显渗流，强烈支持胎膜破裂的诊断。然而，并不是每个患者都有明显积液。此外，胎膜破裂，特别是胎膜早破，可能持续数个小时才能看到有明显渗液。可见渗液出现之前羊膜内感染导致新生儿并发症甚至胎儿窒息的可能性已经大幅增加。2)羊水结晶方法羊水在玻片上风干后在显微镜下呈现羊齿状结晶。由于在玻片上容易被指纹、精液、和宫颈粘液污染，可能出现假阳性。干燥拭子或标本被血液污染可能造成假阴性(5-10%)03)硝嗪试纸pH试纸在羊水中变蓝。敏感性和特异性分别为90.7%和77.2%。阴道中出现碱性尿液、血液、精液、阴道细菌炎症、或滴虫炎症等时，会出现假阳性，假阳性率为-17%。当三种条件均满足时可以确诊为胎膜破裂，如果以上三种情况中任何一种出现，可以怀疑为胎膜破裂。但临床经验证明，诊断胎膜破裂并非必须要满足所有三种条件，当三者中两者存在时，可认为有临床相关性。当诊断标准没有满足，产生胎膜破裂的假阳性和假阴性时，得出的诊断结果往往是模棱两可的。诊断不能下结论时，可能需要采用羊膜镜检查或羊水穿刺注射染料(伊文斯蓝或荧光素)，以确定是否为阳性。4)羊膜镜检查对可疑病历可以在羊膜镜下直接观察胎膜情况，但需要一定的设备、技术，并且在某些情况下不能检测，如胎盘前置时。5)羊水染色注射法是目前唯一能够达到100%准确性的检测法，其过程涉及将稀释靛蓝注入羊膜腔内，在20-30分钟内通过观察阴道中有无颜色渗出(棉球染色)来确定胎膜是否破裂。羊水染色注射一方面是检测ROM最准确的方法，但同时却是有创(需要羊膜腔穿刺)而昂贵的方法。羊膜腔穿刺对孕妇有一定的风险，包括钟型、感染、医源性胎膜破裂、及流产(约1/270)。目前临床上亟需一种操作简便、快速、对仪器依赖不大、价格成本较低的PROM诊断方法，大幅降低孕产妇和新生儿死亡率和感染率的危险，提高优生优育质量。针对传统方法的局限性，临床上相继采用一些免疫检测指标，如阴道冲洗液人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)、羊水甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、宫颈分泌物胎儿型纤维连接蛋白(fetalfibronectin,fFN)、宫颈分泌物胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-likegrowthfactorbindingprotein-l,IGFBP-l)和胎盘α-微球白(PAMG-I)等用于PROM的实验诊断。具体方法和原理如下1)阴道冲洗液hCG测定hCG是一种糖蛋白激素，羊水中hCG含量很高，而正常妊娠宫颈阴道分泌液中hCG含量很低。假阳性和假阴性均小于10%。但是如果阴道冲洗液中混有血液，则假阳性率将明显升高，诊断准确率下降，这是本法最大的缺点。2)羊水AFP测定整个妊娠期间羊水中AFP含量在孕1314周时达高峰，随后减少，并一直持续至分娩；孕晚期母血和羊水中AFP含量相近，因此本法对孕36周之前的诊断更为敏感。3)宫颈分泌物FFN测定羊水中的FFN浓度比母血和尿中高10倍。胎膜破裂时，FFN即可随羊水流入阴道。应用双抗夹心斑点免疫法对正常孕妇及胎膜早破孕妇的官颈分泌物中FFN进行检测发现，前者阳性率为6.0%，后者为95.0%，FFN对诊断PROM有较高的敏感性。4)宫颈分泌物胎盘α1微球蛋白(PAMG-I)测定PAMG_1胎膜破裂后就出现在阴道分泌物中，在羊水中的浓度很高(200025000ng/ml)，血液中的浓度低(525ng/ml)，而且当胎膜完好时，宫颈阴道分泌物中的背景浓度极低(约0.050.22ng/ml)。此方法方便快捷，准确性高于99%，假阳性和假阴性均小于1%。5)宫颈分泌物IGFBP-I测定IGFBP_1主要由蜕膜细胞、母儿肝脏、卵巢颗粒细胞合成并分泌，用免疫层析法检测宫颈分泌物中IGFBP-I的含量来判断有无胎膜早破，阳性预测值为97.0%，阴性预测值为93.2%。免疫诊断方法诊断PROM准确性高，操作简便，有望成为胎膜早破诊断的金标准。但是我国目前尚未见有注册上市的产品。因此，急需开发新的PROM诊断试剂盒。
发明内容本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体、相关的宿主细胞、诊断试剂和诊断试剂盒，该人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体能特异性检测人胰岛素样生长因子结合蛋白-1，由此制备的诊断试剂胎膜早破诊断特异性高，反应灵敏，成本低、适于大规模推广应用。为了解决上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体，其特点是，所述单克隆抗体的抗原是人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的抗原决定簇。较佳地，所述抗原决定簇包括SEQIDNO1所示的氨基酸序列。更佳地，所述抗原决定簇是SEQIDNO1所示的氨基酸序列。在本发明的第二方面，提供了一种单克隆抗体宿主细胞，其特点是，含有上述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体。较佳地，所述单克隆抗体宿主细胞是小鼠杂交瘤细胞。在本发明的第三方面，提供了一种诊断试剂，其特点是，含有上述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-ι的单克隆抗体。较佳地，所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体的含量是4ug/ml。在本发明的第四方面，提供了一种诊断试剂盒，其特点是，所述诊断试剂盒是胶体金试纸条，上述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体作为胶体金标记抗体/捕获抗体。较佳地，每条所述胶体金试纸条包含0.l-50ug所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体。在本发明的第五方面，提供了一种诊断试剂盒，其特点是，所述诊断试剂盒是ELISA试剂盒，根据权利要求1-3任一所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体作为酶标抗体/包被抗体。本发明的有益效果在于本发明的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体的抗原是人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的抗原决定簇，优选包括SEQIDN0:1所示的氨基酸序列，能特异性高检测人胰岛素样生长因子结合蛋白-1，反应灵敏，成本低，适于大规模推广应用。具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，获得一种人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体，该单克隆抗体对人胰岛素样生长因子结合蛋白-ι具有优异的特异性结合作用。在此基础上完成了本发明。为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork=ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1抗原制备(SEQIDNO=I所示的氨基酸序列)将肽合成柱置于Pioneer肽合成仪中，并按照小肽的氨基酸序列顺序在氮气下进行肽的合成。用THF洗涤树脂约5分钟。过滤并将滤液在冷乙醚中离心，倒出上清并重复冷乙醚离心直至肽完全沉淀，并将所得肽粗品在制备性C18硅胶柱层析纯化，用乙腈梯度洗脱，收集含目标肽的洗脱流分并冷冻干燥，得到目标肽。实施例2动物免疫将实施例1获得的抗原与KLH偶联，取偶联物4mg溶于5ml生理盐水中，与完全弗氏佐剂11(体积比)混合，取8周龄磁性Balb/c小鼠，按照下面的试验方案进行动物免疫(1)初次免疫(小肽50μg，加弗氏完全佐剂皮下多点注射，Iml0.2ml/点)；(2)三周后第二次免疫(剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下注射，0.5ml)(3)三周后第三次免疫(剂量同上，不加佐剂皮下注射，7天后采血测其效价，检测免疫效果)；(4)三周后加强免疫(剂量500μg，不加佐剂皮下注射)；(5)取脾融合。(6)第四周末取血检测抗体效价，用生理盐水将血清110000稀释后，进行ELISA检测，以显色阳性为标准。实施例3细胞融合和筛选处死小鼠，制备单个脾细胞悬液，在50ml离心管中混合IO8个脾细胞和IO7个对数期生长的小鼠骨髓瘤细胞(NS-1细胞)，并加入30ml单纯培养基，室温800转/分钟离心8分钟，去上清液，把离心管放于37°C水浴中，缓慢加入0.8ml50%(重量百分比)聚乙二醇-4000，2分钟加入完毕，边加入边摇离心管，然后缓慢加入单纯培养基，3分钟内加入4ml，室温800转/分钟离心8分钟，去上清液，加入45ml20%(体积百分比)小牛血清的HAT选择性培养基，吹打后接种于3块96孔板中，在含有5%CO2的空气中和37°C的条件下培养，7天后将培养板中的培养液加密，10天后观察，用ELISA法检测杂交瘤细胞培养液的抗体效价。实施例4抗体鉴定1.抗体特异性的鉴定除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法用ELISA法，交叉反应率都低于2%，证实抗体只对SEQIDNO:1所示的小肽和人胰岛素样生长因子结合蛋白-1特异性结合。2.抗体的Ig类与亚类的鉴定用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选，基本上确定抗体的Ig类型；经测定本发明的单克隆抗体亚型为IgG1153.抗体相对亲和力的鉴定用ELISA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力，测定结果为0.4mg/L。实施例5抗体克隆化①制备饲养细胞悬液(同融合前准备)；②阳性孔细胞的计数，并调细胞数在15X103/ml；③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μ1/孔加Α、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100μ1/孔加D、Ε、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μ1/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。④培养45天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μ1/孔。⑤第89天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。实施例6胶体金试纸条在硝酸纤维素膜的T带区域分别包埋有人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的多克隆抗体，胶体金垫上包被有标记了胶体金的用于捕获样本中人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的上述单克隆抗体，每条金标试纸条具有4ug单克隆抗体。试纸条检测端带有吸水纸，反应时插入样品中。检测时如果C区出现条带，则T区出现条带即表示样品为阳性；未出现条带则表示阴性。检测时如果C区未出现条带，则表示试纸条失效。检测结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本胶体金检测的特异性为97.8%，灵敏度为98.4%。本实验还分别采用了0.Iug单克隆抗体/每条金标试纸条、50ug单克隆抗体/每条金标试纸条进行了相关实验，结果与上述结果类似。实施例7ELISA检测试剂盒将IOOul人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的多克隆抗体(4ug/ml)用包被缓冲液在每孔中在4°C包被24小时，然后脱脂奶粉封闭24小时，洗涤，风干，消毒和密封备用。用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG或IgM抗体，以TMB作为显色液的主要成分。试剂盒包装，检验。检测结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本ELISA检测试剂盒检测的特异性为98.6%，灵敏度为97.5%。综上所述，本发明的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体能特异性检测人胰岛素样生长因子结合蛋白-1，由此制备的诊断试剂胎膜早破诊断特异性高，反应灵敏，成本低、适于大规模推广应用。在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。序列表<110>无锡博慧斯生物医药科技有限公司<120>一种人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体、相关的宿主细胞、诊断试剂和诊断试剂盒<160>1<210>1<211>23<212>PRT<213>人类(Homosapiens)<220><221>domain<222>(1)..(23)<223>人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的一段氨基酸序列<400>1LysArglieProGlySerProGlulieArgGlyAspProAsnCys151015GlnlieTyrPheAsnValGlnAsn20权利要求一种人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的抗原是人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的抗原决定簇。2.根据权利要求1所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体，其特征在于，所述抗原决定簇包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体，其特征在于，所述抗原决定簇是SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。4.一种单克隆抗体宿主细胞，其特征在于，含有根据权利要求1-3任一所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体。5.根据权利要求4所述的单克隆抗体宿主细胞，其特征在于，所述单克隆抗体宿主细胞是小鼠杂交瘤细胞。6.一种诊断试剂，其特征在于，含有根据权利要求1-3任一所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体。7.根据权利要求6所述的诊断试剂，其特征在于，所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体的含量是4ug/ml。8.—种诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒是胶体金试纸条，根据权利要求1-3任一所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体作为胶体金标记抗体/捕获抗体。9.根据权利要求8所述的诊断试剂，其特征在于，每条所述胶体金试纸条包含0.l_50ug所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体10.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒是ELISA试剂盒，根据权利要求1-3任一所述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体作为酶标抗体/包被抗体。全文摘要本发明提供了一种人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体，其抗原是人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的抗原决定簇，较佳地，抗原决定簇包括SEQIDNO1所示的氨基酸序列，还提供了一种单克隆抗体宿主细胞，其含有上述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体，还提供了含有上述的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体的诊断试剂和诊断试剂盒，本发明的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1的单克隆抗体能特异性检测人胰岛素样生长因子结合蛋白-1，由此制备的诊断试剂胎膜早破诊断特异性高，反应灵敏，成本低、适于大规模推广应用。文档编号C07K16/18GK101805406SQ20091022464公开日2010年8月18日申请日期2009年11月17日优先权日2009年11月17日发明者刘丽,张丽新,李雅丽,雷震,韦彦余申请人:无锡博慧斯生物医药科技有限公司