专利名称：微生物感染的治疗的制作方法
微生物感染的治疗前言本发明涉及改进的微生物抗原疫苗、药物组合物、免疫原性组合物和抗体及其在 治疗微生物感染，特别是细菌来源的，包括葡萄球菌(Staphylococcal)来源的微生物感染 中的用途。多重耐药性(MDR)是革兰氏阳性细菌尤其是医院中的日益严重的问题。抗生素和 其它治疗细菌感染的试剂的广泛使用已经引起细菌迅速产生针对所述试剂的抗性，很多细 菌具有多重耐药性。因此，目前需要提供改进的处理这样的耐药性感染的治疗。葡萄球菌是球形的革兰氏阳性细菌，其通常按照葡萄样不规则成簇排列。有一些 是人类皮肤和粘膜的正常菌丛(flora)的成员，其它的则引起化脓、脓肿形成、多种化脓性 感染，甚至是致命的败血病。致病性葡萄球菌通常引发溶血、使血浆凝固并产生多种细胞外 酶类和毒素。葡萄球菌属中有至少30个种。具有临床重要性的三个主要种是金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)禾口腐生葡萄球 菌(Staphylococcus saprophyticus) 0金黄色葡萄球菌是凝固酶阳性的，这将其与其它的 种区分开。金黄色葡萄球菌是对于人类的主要病原体。几乎每个人在其一生中都具有一 些类型的金黄色葡萄球菌感染，从食物中毒的严重性或轻微皮肤感染到严重的威胁生命的 感染。凝固酶阴性的葡萄球菌是正常的人类菌丛，其有时引起感染，通常与移植装置相关， 特别是在非常年幼的、年老的和免疫缺陷的患者中。大约75%的由凝固酶阴性的葡萄球 菌引起的感染都是由表皮葡萄球菌引起的。由沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri), 人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)和其它种引起的感染较不常见。腐生葡萄球菌 是年轻妇女中尿道感染的相对常见的诱因。葡萄球菌产生过氧化氢酶，这将其与链球菌 (streptococci)区别开来。路邓葡萄球菌(S. lugdunensis)也是临床相关的，其存在于大 约5-10%的感染性心内膜炎的病例中。在关节空间内，金黄色葡萄球菌在主要成分为胶原的关节软骨内的定殖似乎是促 成脓毒性关节炎产生的重要因素。造血性获得的细菌性关节炎仍然是严重的医学问题。这 种迅速进展和高度破坏性的关节病难以根除。通常而言，不产生严重的关节损伤的话，有 50%以下的感染患者难以恢复。金黄色葡萄球菌是从具有造血性和继发性骨髓炎的成年患 者中分离而来的主要病原体。在住院患者中，葡萄球菌例如金黄色葡萄球菌是主要的感染诱因。伤口或留置的 医疗器械的最初局部感染能够导致更严重的侵入性感染例如败血病、骨髓炎、乳腺炎和心 内膜炎。在与医疗器械有关的感染中，在移植之后较短时间内塑料和金属表面被宿主血浆 和基质蛋白例如纤维蛋白原和纤连蛋白包被。金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌粘附到这些 蛋白上的这种能力对于感染的起始是必不可少的。血管移植物、静脉内导管、动脉心瓣膜和 心脏辅助装置是血栓形成性的，易于细菌的群集。一般而言，在葡萄球菌中，金黄色葡萄球 菌是这些感染中最具破坏性的病原体。在世界范围内的医院中已经观察到了对目前可用的治疗感染的多数抗生素呈现抗性的金黄色葡萄球菌分离体的显著增加。抵抗金黄色葡萄球菌的青霉素的开发是感染 控制和治疗中的一大进步。不幸的是，青霉素抗性的生物迅速出现，迫切需要新的抗生 素。随着每种新的抗生素的引进，金黄色葡萄球菌能够对抗内酰胺酶——改变的青霉 素结合蛋白，以及允许细菌存在的突变的细胞膜蛋白。因此，出现了甲氧苯青霉素抗性的 金黄色葡萄球菌(MRSA)和多重耐药的生物并且在全世界的医院和疗养院留下了主要足迹 (Chambers,H. F. ,Clin Microbiol Rev, 1 :173，1988 ；和 Mulligan，M. Ε·等人，AmJ Med,94 313，1993)。目前，引起医院中的感染的葡萄球菌菌株中几乎有一半对于除了万古霉素以外 的所有抗生素都是抗性的，似乎万古霉素变得无效也只是时间的问题。因此，迫切且日益需要用于治疗葡萄球菌例如金黄色葡萄球菌感染的治疗剂，所 述治疗剂有效抵抗那些抗生素抗性的细菌菌株。在革兰氏阳性病原体例如葡萄球菌、链球菌和肠球菌中，被称为粘附素(adhesin) 的蛋白通过例如促进群集、附着至血液凝块和使组织受损而介导这样的感染。这些特异性 微生物表面粘附素被称为MSCRAMM(微生物表面成分识别性粘附基质分子)(Patti，J.等 人，Ann Rev Microbiol,48 585-617,1994 ；Patti,J.and Hook,Μ. ,Cur Opin Cell Biol., 6:752-758,1994)。MSCRAMM特异性识别并结合至细胞外基质(ECM)成分，例如纤连蛋白、 纤维蛋白原、胶原和弹性蛋白。在很多革兰氏阳性病原体中发现了这些MSCRAMM，其氨基酸 序列是相关的，它们具有相似的模块(modular)设计和共同的结合结构域组构。细菌细胞表面上的MSCRAMM和宿主组织内的配体以锁钥模式相互作用，从而导致 细菌粘附至宿主。细菌生存通常需要粘附，其帮助细菌规避宿主的防御机制和抗生素的挑 战。一旦细菌成功粘附并群集在宿主组织中，其生理即被显著改变，并且分泌破坏性成分例 如毒素和酶。此外，粘附细菌通常产生生物膜并迅速对多数抗生素的杀灭效应产生抗性。细菌能够表达识别多种基质蛋白的MSCRAMM。MSCRAMM中的配体结合位点似乎是 由氨基酸序列的相对较短的连续区段(基序)决定的。因为在几种不同的细菌物种中可 以发现相似的基序，所以这些功能性基序似乎会进行种间转移(Patti and Hook,Cur Opin Cell Biol，6 :752-758，1994)。另外，有时单一的MSCRAMM能够结合数个ECM配体。MSCRAMM能够通过与包括纤维蛋白原(Fg)和/或纤连蛋白(Fn)等的蛋白结合而 介导感染。纤维蛋白原和纤连蛋白是在血浆中发现的蛋白，其在止血和凝固中发挥重要作 用。纤维蛋白原由6条多肽链组成2条Aa、2条Ββ和2条Y-链。Y-链的C末端 部分在生物学上是重要的，并且在血小板吸附和聚集中与血小板整联蛋白相互作用。该区 域也是金黄色葡萄球菌靶定的，导致纤维蛋白原依赖性的细胞聚集和组织吸附。金黄色葡萄球菌具有数个表面表达的蛋白，其刺激血小板激活和聚集。金黄色葡 萄球菌的MSCRAMM蛋白包括但不限于下列蛋白-纤维蛋白原结合蛋白聚集因子A(ClfA)；-纤维蛋白原结合蛋白聚集因子B(ClfB)；-纤连蛋白-纤维蛋白原结合蛋白A(FnBPA)；-纤连蛋白-纤维蛋白原结合蛋白B(FnBPB)；和-金黄色葡萄球菌表面蛋白SasA、SasG,SasK等。下表1列举了各种金黄色葡萄球菌细胞壁锚定表面蛋白的选集
表1
表面蛋白aa°配体6基序c分选醉 (sortase) d蛋白A (Spa)508免疫球蛋白、 von Willebrand 因子、TNFReLPETGA纤连蛋白结合蛋白A (FnbpA)1,018纤连蛋白、纤维 蛋白原、弹性蛋 白LPETGA纤连蛋白结合蛋白B (FnbpB)914纤连蛋白、纤维 蛋白原、弹性蛋 白LPETGA聚集因子A(ClfA)933纤维蛋白原、补 体因子ILPDTGA聚集因子B (ClfB)913纤维蛋白原、细 胞角蛋白10LPETGA胶原粘附CCna)1,183股原LPKTGASdrC947未知LPETGASdrD1,315未知LPETGASdrE1,166未知LPETGAPls1,637未知LPDTGASasA2,261未知LPDTGASasB937未知LPDTGASasC2,186未知LPNTGASasD241未知LPAAGASasE/IsdA354血红素fLPKTGASasF637未知LPKAGA
权利要求
与其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM蛋白或MSCRAMM样蛋白或其片段，其包含至少一部分配体结合区域，用于治疗。
2.权利要求1的重组MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段，其具有减少的或不具有与 其宿主配体非共价结合的能力，用于治疗。
3.权利要求2的重组MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段，其中MSCRAMM或MSCRAMM 样蛋白与其配体通过坞、锁和锁闭发生的非共价结合被减少或阻止。
4.权利要求1-3任一项的重组MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段，其中所述配体是 血红素、血红蛋白、胶原或纤维蛋白原。
5.权利要求1-4任一项的重组MSCRAMM蛋白或MSCRAMM样蛋白或其片段，其为a.纤维蛋白原结合蛋白；b.SdrD, SdrE, SdrG, SdrF ；或c.IsdB 和 / 或 IsdH0
6.权利要求5的重组纤维蛋白原结合蛋白或其包含至少一部分纤维蛋白原结合区域 的片段，具有减少的或不具有与纤维蛋白原非共价结合的能力。
7.权利要求6的重组纤维蛋白原结合蛋白，其包含两个形成疏水袋的DeV-IgG结构域， 其中两个Dev-IgG结构域之间形成的疏水袋被改变以减少或阻止纤维蛋白原结合；或纤维蛋白原结合蛋白包含覆盖疏水沟中的纤维蛋白原的锁闭肽并且所述锁闭肽被改 变或删除以减少或阻止纤维蛋白原结合。
8.权利要求5至7任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中所述纤维蛋白原结合蛋白 仅包含纤维蛋白原结合区域或其片段。
9.权利要求5至8任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其源自金黄色葡萄球菌、表皮葡 萄球菌和/或路邓葡萄球菌。
10.权利要求5至9任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中所述纤维蛋白原结合蛋白 选自下列中的一项a.FbI、SdrF 和 / 或 SdrG ；b.纤维蛋白原结合蛋白聚集因子A(ClfA)和/或纤维蛋白原结合蛋白聚集因子 B(ClfB)；c.IsdA ；或d.FnBPA 和 / 或 FnBPB。
11.权利要求5至10任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其在纤维蛋白原结合区域中 包含至少一个核苷酸或氨基酸残基的取代、插入、删除或添加以产生没有减少的或不具有 与纤维蛋白原非共价结合能力的重组纤维蛋白原结合蛋白。
12.权利要求11的重组纤维蛋白原结合蛋白，其包含纤维蛋白原结合蛋白的纤维蛋白 原结合区域A，其中核苷酸或氨基酸的取代、插入、删除或添加降低与纤维蛋白原的非共价 相互作用，优选通过阻止或减少配体与疏水袋的结合，所述疏水袋分隔纤维蛋白原结合蛋 白的区域A的亚区域N2和N3。
13.权利要求5至12任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其包含不具有锁闭肽氨基酸 残基的纤维蛋白原结合区域，从而产生具有减少的或不具有与纤维蛋白原非共价结合能力的重组纤维蛋白原结合蛋白。
14.权利要求5至13任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中所述重组蛋白是ClfA。
15.权利要求14的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中ClfAA纤维蛋白原结合区域(区域 A)的疏水性残基发生至少一个或多个核酸或氨基酸的取代、插入、删除或添加。
16.权利要求14或15的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中氨基酸残基Ala254、Tyr256、 Pro336、Tyr338、Ile387、Lys389、Glu526 和 / 或 Val527 被 Ala 或 Ser 取代。
17.权利要求14至16任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中ClfA纤维蛋白原结 合区域(区域A)的残基P336和/或Y338被丝氨酸或丙氨酸取代以产生rClfAP336S Y338A或 rClfAP336A Y338S0
18.权利要求14至17任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中重组葡萄球菌纤维蛋白 原结合蛋白具有根据任意SEQ ID NO :1至3的氨基酸序列或其片段，其中残基P336和/或 Y338被丝氨酸和/或丙氨酸取代。
19.权利要求14至18任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其包含纤维蛋白原结合蛋 白、纤维蛋白原结合区域、最小纤维蛋白原结合区域和/或其片段。
20.权利要求14至19任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中所述片段包含至少一部 分纤维蛋白原结合区域以产生具有减少的或不具有与纤维蛋白原非共价结合能力的纤维 蛋白原结合蛋白的重组片段。
21.权利要求14至20任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其包含a.亚区域N123，跨越纤维蛋白原结合区域(区域Α)的氨基酸残基40-559；b.亚区域N23，跨越ClfA纤维蛋白原结合区域(区域A)的氨基酸残基221-559；和/或c.纤维蛋白原结合区域(区域A)的氨基酸残基221-531。
22.权利要求14至21任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其包含根据任意SEQID NO 4-14的氨基酸序列。
23.根据前述权利要求任一项的重组MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段，用于治疗或 预防微生物感染，包括脓毒症、脓毒性关节炎和/或心内膜炎，优选是由葡萄球菌引起的。
24.权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段在制备用于治疗或预防微生物感染的 药物中的用途，所述微生物感染优选由葡萄球菌引起。
25.—种在个体中诱导免疫反应的方法，包括给予所述个体根据权利要求1至22任一 项的重组蛋白或其片段。
26.一种治疗患有微生物感染的患者的方法，包括以根据权利要求1至22任一项的重 组蛋白或其片段或者包含根据权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段的疫苗治疗所 述患者，从而治疗所述微生物感染。
27.表达根据权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段的核酸构建体、表达载体或 宿主细胞。
28.包含根据权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段的疫苗。
29.针对根据权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段产生的抗体，优选为超免疫 血清的形式。
30.包含根据权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段以及药学上可接受的佐剂的免疫原性药物组合物。
全文摘要
本发明涉及改进的微生物抗原疫苗、药物组合物、免疫原性组合物和抗体及其在治疗微生物感染特别是细菌来源包括葡萄球菌来源的微生物感染中的用途。理想地，本发明涉及用于治疗的对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段。
文档编号C07K14/31GK101983067SQ200980112527
公开日2011年3月2日 申请日期2009年1月29日 优先权日2008年1月31日
发明者A·塔罗夫斯基, E·约瑟夫森, J·乔格赫冈, J·希金斯, T·福斯特 申请人:近都柏林之伊丽莎白皇后神圣及不可分割的三位一体学院之教务长,研究员和学者