重组纤维蛋白原的制作方法

专利名称：重组纤维蛋白原的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组纤维蛋白原，涉及在哺乳动物细胞中以高水平产生重组纤维蛋白 原的方法，还涉及它的应用。
背景技术：
纤维蛋白原是可溶性血浆糖蛋白，主要是通过肝脏的肝实质细胞在人体内合成。 它是由两对标记为A α、Ββ和γ的三条多肽链组成的二聚体分子，所述三条多肽链由二硫 桥键连接。三条多肽链由三个独立的基因编码。野生型A α链合成为含625个氨基酸的前 体，并作为含610个氨基酸的蛋白质存在于血浆中，Ββ含461个氨基酸，γ链含411个氨 基酸。三种多肽分别由3种mRNA合成。三条组成链(Αα、Ββ和Y)组装成最终形式的六 链二聚体(Αα、Ββ、Y )2发生于内质网(ER)腔内。纤维蛋白原以高浓度(l_2g/L)循环于血液中，并显示出高度的异质性。通过基 因多态性、糖基化和磷酸化的差异、A α链的端羧基部分的(部分)蛋白水解以及选择性剪 接产生变体(请参阅 De Maat 和 VerschuuH2005) Curr. Opin. Hemato 1. 12，377 ；Laurens 等(2006)J. Thromb Haemost. 4，932 ；Henschen-Edman(2001)Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 936， 580)。据估计，在每个个体中，约有一百万个不同的纤维蛋白原分子循环。大部分的这些 变体在功能和结构上都不同，所述的这些变体只占纤维蛋白原总数的一小部分(在大多数 情况下不超过几个百分比)。Aa链的端羧基部分的蛋白水解导致具有明显不同分子量 的纤维蛋白原的三种主要循环形式。纤维蛋白原以高分子量的形式合成(HMW ；分子量为 340kDa;循环中的Aa链的主要形式含610个氨基酸)。A α链之一的降解产生低分子量形 式(LMW ;MW = 305kDa) ；LMW形式Q70kDa)是其中两个A α链都在端羧基部分地降解的变 体。在正常血液中，50-70%的纤维蛋白原是HMW，20-50%是具有一个或两个降解Aa链的 纤维蛋白原(de Maat 和 VerschuuH2005) Curr. Opin. Hematol. 12，377)。HMW 和 LMW 变体 在凝血时间和纤维蛋白聚合体结构方面显示出明显的差异(Hasegawa N5Sasaki S. (1990) Thromb. Res. 57,183。由选择性剪接产生的众所周知的变体是所谓的Y，变体和Fib420变体。γ丨变体占γ链总数的约8%。对于丰度最高的Y链来说，它由427个而不是 411个氨基酸组成；四个末端C氨基酸(AGDV)被含2个硫酸化酪氨酸的20个氨基酸取代。 纤维蛋白原 ’链不能与对调节血小板凝聚至关重要的血小板纤维蛋白原受体nb0 3结合。分子量为420kDa的Fib420变体占循环纤维蛋白原总数的1_3 % (de Maat和 Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12，377)。通过选择性剪接，使额外的开放读码框包 括于Aa链的C-末端，从而用237个氨基酸将其扩展。附加的氨基酸形成结节结构。血源性纤维蛋白原是市售纤维蛋白封闭剂的一个重要组分，所述纤维蛋白封闭剂 临床应用于外科手术中，用以止血和减少血液及体液的流失。此外，其用于通过利用纤维蛋 白的凝集性能促进组织粘连和用于改善伤口的愈合。纤维蛋白原临床上也用于补充遗传性纤维蛋白原缺乏症患者和后天性纤维蛋白原缺乏症患者的纤维蛋白原缺乏。已证实高剂量 纤维蛋白原(3-10克)的静脉注射能在不同的临床情况下使血液凝固正常化并阻止或预防 严重的出血。人纤维蛋白原的重组生产，无论是野生型(HMW)形式或作为变体(如Fib420)，比 使用血源性材料有很多优点。这些优点包括其优选的安全特性、以纯粹的方式产生变体的 可能性和无限制供应。然而，为了以经济上可行的方式进行生产，需要完整、功能性纤维蛋 白原的高表达水平。此外，针对具体的应用(如使用纤维蛋白原作为静脉注射(IV)止血 剂)，需要正确的翻译后修饰(如糖基化)。由于翻译后修饰的原因，哺乳动物系统中的表达是优选的。因此，生物活性重组 纤维蛋白原已经在各种细胞中被表达，如幼仓鼠肾(BHK)(如Roy等，(1991)Biochemistry 30,9414)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(如 Lord, (US6037457)，Binnie 等，(1993) Biochemistry 32，107)或非洲绿猴源性 COS 细胞(如 Roy 等，(1991) J. Biol. Chem. 266, 4758)。然而，表达水平只有大约l_15yg/ml，被认为不足以取代临床实践中所需的大量血 浆纤维蛋白原。此外，人纤维蛋白原在酵母P. pastor is中的表达水平为8 μ g/ml，这对于商 业生产来说也是不够的CTojo等，(2008) Prot. Expr.和Purif. 59，289)。在EP 1 661 989中，据报道，对于商业上可行的生产来说，需要的产量为至少 100mg/L。在这种应用中，报告称在转瓶中，CHO细胞的表达水平可高达631. 5mg/L。然而， 为了达到这种水平，细胞必须共同表达杆状病毒P35抗凋亡蛋白质，且必须使用甲氨蝶呤 (抗代谢物)扩增载体。与工业上的标准相比(例如mirm(Nature Biotechnol. (2004)22， 1393)报告了 3-4天的传代培养中的常规细胞密度为2 X 106细胞/ml)，细胞密度相对较低 (在转瓶中，15天内最高为9. 4X105细胞/ml)。重组纤维蛋白原的成功生产的最重要问题是如何制备高纯度的足够完整、正确组 装的生物活性产物。
具体实施例方式本发明涉及编码纤维蛋白原α、β或Y链的核苷酸序列，所述核苷酸序列是针对 在真核细胞培养系统中的表达优化的。根据本发明的优化核苷酸序列可实现在真核细胞培 养系统中以完整的形式高效表达重组纤维蛋白原。由优化核苷酸序列编码的蛋白质序列与 由相应的非优化核苷酸序列编码的蛋白质序列相同。在本发明中，术语‘纤维蛋白原’可以 指任何形式的纤维蛋白原，包括通过基因多态性、糖基化和磷酸化的差异、Aa链的端羧基 部分的(部分)蛋白水解和选择性剪接产生的变体。在本发明中，术语‘α链’和‘Αα链’ 可互换使用。它们可以指α链的野生型和变体两者，包括含信号序列(SEQ ID No. 8)的 644个氨基酸的纤维蛋白原α链、无信号序列(SEQ ID Ν0. 8的氨基酸20至644)的625个 氨基酸的前体纤维蛋白原α链、见于循环中的610个氨基酸(SEQ ID Ν0. 8的氨基酸20至 629)的截短纤维蛋白原α链和含信号序列(SEQ ID Ν0. 11)或无信号序列(SEQ ID NO. 11 的氨基酸20-866)的866个氨基酸的Fib420变体α链。在本发明中，术语‘β链，和‘Ββ 链’可互换使用。它们可以指β链的野生型和变体两者，包括含信号序列(SEQ ID No. 9) 的491个氨基酸的纤维蛋白原β链和无信号序列(SEQ ID Ν0. 9的氨基酸31至491)的 461个氨基酸的纤维蛋白原β链。
在本发明中，术语‘伽玛链’和‘ Y链’可互换使用。它们可以指Y链的野生型和 变体两者，包括含信号序列(SEQ ID No. 10)的437个氨基酸的纤维蛋白原、链、无信号序 列(SEQ ID NO. 10的氨基酸27至437)的411个氨基酸的纤维蛋白原Y链、453个氨基酸 的纤维蛋白原、链(带有信号序列(SEQ ID NO. 13)的Y ’链)和427个氨基酸的纤维蛋 白原Y链(无信号序列(SEQ ID NO. 13的氨基酸27至453)的Y ’链)。在本发明中，当氨基酸序列含由核苷酸序列编码的所有氨基酸，任选不含在正常 细胞(分泌)处理过程中被移除的氨基酸时，纤维蛋白原或纤维蛋白原链是‘完整形式的’。 因此，具有644、625或610个氨基酸的α链是完整形式的α链的例子。根据本发明的优化核苷酸序列的GC含量为至少55 %，优选为至少58 %，更优选为 至少60或65 %。在一个实施例中，根据本发明的优化核苷酸序列的GC含量在约55 %至 70 %范围内。在另一实施例中，根据本发明的优化核苷酸序列的GC含量在约60 %至65 % 范围内。编码纤维蛋白原α、β或Y链的本分明的优化核苷酸序列是针对在真核细胞培 养系统中的表达优化的。优选地，它们是针对在哺乳动物细胞培养系统中的表达优化的，如 针对在COS细胞、BHK细胞、NSO细胞、Sp2/0细胞、CHO细胞、PER. C6细胞、HEK293细胞或昆 虫细胞培养系统中的表达。更优选地，核苷酸序列是针对在人体细胞培养系统中的表达优 化的，如针对PER. C6细胞或HEK293细胞培养系统。根据本发明的优化的密码子适应指数为至少0. 90，优选为至少0. 95，更优选为至 少0. 97。在一个实施例中，根据本发明的核苷酸序列通过适应CHO细胞的密码子使用被优 化，其中密码子适应指数为至少0. 95。根据本发明的核苷酸序列可以是编码任何类型的纤维蛋白原链的。优选地，它们 编码哺乳动物纤维蛋白原链，更优选地，它们编码灵长类动物纤维蛋白原链，最优选地，它 们编码人纤维蛋白原链。链的组合也是可能的，例如一个或两个哺乳动物纤维蛋白原链与 两个或一个啮齿类动物纤维蛋白原链组合。优化核苷酸序列可以是DNA或RNA。优选是 cDNA。编码纤维蛋白原α、β或Y链的本发明的优化核苷酸序列显示出与其相应的非 优化对应物至少70%的一致性。在一个实施例中，编码纤维蛋白原α、β和Y链的本发明 的优化核苷酸序列显示出与其相应的非优化序列70-80%的一致性。优选地，编码纤维蛋白 原α、β或Υ链的本发明的优化核苷酸序列不包含顺式作用位点，如剪接位点和poly(A)信号。编码纤维蛋白原α链的本发明的优化核苷酸序列不包含通常存在于编码人纤维 蛋白原的α链的基因中的39个碱基对直接重复序列。在编码α链的本发明的优化核苷 酸序列中，不用改变编码的蛋白质序列即可改变重复序列。在一个优选的实施例中，编码α链的本发明的优化核苷酸序列包含根据SEQ ID No. 4或7的序列。编码纤维蛋白原α链且包含部分的这些序列的核苷酸序列也涵盖在本发 明中。在一个实施例中，根据本发明的优化核苷酸序列包含SEQ ID NO. 4的核苷酸60-1932。 在另一实施例中，根据本发明的优化核苷酸序列包含SEQ ID N0. 4的核苷酸60-1887。在 又一实施例中，根据本发明的优化核苷酸序列包含SEQ ID N0. 7的核苷酸60-2598。这样 的核苷酸序列也涵盖在本发明中，该核苷酸序列包含与SEQ iD N0. 4或7有至少85%、至少87 %或至少90 %、更优选至少92 %、至少94 %、96 %、最优选至少98 %或至少99 %的一 致性的序列，并且编码纤维蛋白原α链，例如带有根据SEQ ID NO. 8或11的序列或部分的 这些序列的纤维蛋白原α链，如上文所例示。在优选的实施例中，编码β链的本发明的优 化核苷酸序列包含根据SEQ ID No. 5的序列。编码纤维蛋白原β链且包含部分此序列的核苷酸序列也涵盖在本发明中。在一 个实施例中，根据本发明的优化核苷酸序列包含SEQ ID NO. 5的核苷酸93-1473。这样的 核苷酸序列也涵盖在本发明中，该核苷酸序列包含与SEQ ID No. 5有至少85%、至少87% 或至少90%、更优选至少92%、至少94%、96%、最优选至少98%或至少99%的一致性的 序列，并且编码纤维蛋白原β链，例如带有根据SEQ ID NO. 9的序列或部分此序列(例如 SEQ ID NO. 9的氨基酸31至491)的纤维蛋白原β链。在优选的实施例中，编码纤维蛋白 原、链的本发明的优化核苷酸序列包含根据SEQ ID NO. 6的序列。编码纤维蛋白原、链 且包含部分此序列的核苷酸序列也涵盖在本发明中。在一个实施例中，编码纤维蛋白原Y 链的本发明的优化核苷酸序列包含SEQ ID N0. 6的核苷酸81-1311。这样的核苷酸序列也 涵盖在本发明中，该核苷酸序列包含与SEQ ID No. 6有至少85%、至少87%或至少90%、更 优选至少92%、至少94%、96%、最优选至少98%或至少99%的一致性的序列，并且编码纤 维蛋白原Y链，例如带有根据SEQ ID NO. 10的序列或部分此序列(例如SEQ ID NO. 10的 氨基酸27至437)的纤维蛋白原、链。在另一优选的实施例中，编码纤维蛋白原Y链的本发明的优化核苷酸序列包含 根据SEQ ID N0. 12的序列。编码纤维蛋白原Y链且包含部分此序列的核苷酸序列也涵盖 在本发明中。在一个实施例中，编码纤维蛋白原Y链的本发明的优化核苷酸序列包含SEQ ID N0. 12的核苷酸81-1359。这样的核苷酸序列也涵盖在本发明中，该核苷酸序列包含与 SEQ ID No. 12有至少85%、至少87%或至少90%、更优选至少92%、至少94%、96%、最优 选至少98%或至少99%的一致性的序列，并且编码纤维蛋白原γ链，例如带有根据SEQ ID N0. 13的序列或部分此序列(例如SEQ ID N0. 13的氨基酸27至453)的纤维蛋白原Y链。在另一方面，本发明涉及核苷酸构建体，所述核苷酸构建体包含编码纤维蛋白原 α、β或Y链的本发明的优化核苷酸序列。核苷酸构建体可包含影响纤维蛋白原链的表 达的调节序列，包括启动子、终止子和增强子。在一个实施例中，核苷酸构建体是载体，例如 克隆载体或表达载体。核苷酸构建体可包含选择标记。在另一方面，本发明涉及包含编码纤维蛋白原α、β或Y链的本发明的优化核 苷酸序列的细胞。在所述细胞中，根据本发明的核苷酸可以本身或者在构建体中的形式存 在，如在表达载体或克隆载体中。所述细胞通常是用于产生纤维蛋白原的宿主细胞。包含 根据本发明的核苷酸序列的细胞优选为哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的合适例子包括昆虫 细胞、COS细胞、BHK细胞、NSO细胞、Sp2/0细胞、CHO细胞、PER. C6细胞和HEK293细胞。根据本发明的细胞产生大量的完整生物活性纤维蛋白原。所述细胞通常是细胞 系的一部分。在本发明中，短语‘产生大量完整纤维蛋白原的细胞或细胞系’是指产生超过 85 %、优选超过90 %、95 %或99 %的完整产物的细胞或细胞系。优选地，这是在群体倍增为 10,20或30的时期、更优选为40或50的时期测量的。在本发明中，‘生物活性’纤维蛋白 原是指在凝血酶的存在下聚合成纤维蛋白的纤维蛋白原。这种细胞或细胞系也涵盖在本发 明中。在优选的实施例中，根据本发明的细胞系产生完整重组纤维蛋白原的水平为每天每个细胞至少3微微克，更优选为每天每个细胞至少4或5微微克，甚至更优选为每天每个细 胞至少7或10微微克。在细胞密度为30 X 106个细胞/ml的反应器中，每天每个细胞3微 微克相当于每天每升反应器体积产生90mg纤维蛋白原，每天每个细胞5微微克相当于每天 每升产生150mg纤维蛋白原，每天每个细胞7微微克相当于每天每升产生210mg纤维蛋白 原。优选地，细胞群的至少50%、更优选细胞群的至少60%、70%或80%、最优选细胞群的 至少90^^95%或99%每天每个细胞产生至少3微微克，更优选每天每个细胞产生至少5 微微克，甚至更优选每天每个细胞产生至少7微微克。产生大量完整纤维蛋白原的细胞或细胞系的选择优选在没有蛋白酶抑制剂的表 达的情况下进行。在一个实施例中，使用抗体进行选择，优选的是与α链的完整N-末端 和α链的完整C-末端结合的单克隆抗体。市售的这种抗体的合适例子包括由Koppert 等((1985)Blood 66,503)所描述的 Y18 抗体和由 Hoegee-de Nobel 等((1988)Thromb. Haemost. 60(3)415)所描述的G8抗体。优选在无血清的环境中进行这种选择。选择产生完 整纤维蛋白原的细胞系的方法也是本发明的一部分。另一方面，本发明涉及在真核细胞培养系统中产生纤维蛋白原的方法。所述方法 包括根据本发明在产生纤维蛋白原的条件下培养宿主细胞或细胞系。可任选回收产生的纤 维蛋白原。可以组合优化和非优化的链。可以通过基因工程或者通过合成方法获得非优化 链，并且它们的来源可以与优化链不同。在一个实施例中，每个纤维蛋白原分子中只有一个 链是通过根据本发明的密码子优化核苷酸序列编码的，而两个其它链是通过两个没有优化 的核苷酸序列编码的。在另一实施例中，每个纤维蛋白原分子的三个纤维蛋白原链中的两 个是通过根据本发明的密码子优化核苷酸序列编码的。在优选的实施例中，所有三个纤维 蛋白原链都是通过优化的核苷酸序列编码的。与血源性纤维蛋白原相比，因为产生了特定 的纤维蛋白原链，所以由此方法产生的纤维蛋白原制剂相当均勻。所述方法能够产生纤维 蛋白原制剂，其 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上、优选95%、98% 或99 %以上是仅少量存在于血浆中的变体。另一方面，本发明涉及根据本发明的核苷酸序列在制备若干医疗应用的纤维蛋白 原中的用途。在一个应用中，根据本发明的核苷酸序列用于制备用在纤维蛋白封闭剂中的 纤维蛋白原，所述纤维蛋白封闭剂临床应用于外科手术中，用以止血和减少血液及体液的 流失。在另一应用中，根据本发明的核苷酸序列可用于制备纤维蛋白原，从而通过利用纤维 蛋白的凝集性能促进组织粘连和改善伤口的愈合。在又一应用中，根据本发明的核苷酸序 列可用于制备纤维蛋白原，所述纤维蛋白原临床上用于通过静脉注射纤维蛋白原治疗先天 性或后天性(如通过在创伤后或在手术过程中出血)纤维蛋白原缺乏症患者的急性出血发 作。市场上销售的血源性纤维蛋白原制剂有Riastap (CSL Behring LLC ；在美国市场销售) 和Haemocomplettan (CSL Behring AG;在欧洲市场销售)。与血源性制剂相比，重组纤维蛋 白原制剂有若干优点，包括优选的安全特性、无限制供应和以纯粹的方式针对此特定适应 证生产具有优选活性特性的纤维蛋白原变体的可能性。


图1在CHO细胞用野生型和编码A α、Ββ和γ链的密码子优化构建体转染后的第 1、2、3和6天时重组人纤维蛋白原的表达水平。实验重复进行两次，(opt)优化序列；(wt)野生型序列。图2在CHO细胞用编码A α、B β和γ链的密码子优化构建体和带有A α -扩展 的、B β和γ链(标记为A α-ext. (opt)+B β (opt)+ γ (opt))的密码子优化构建体(标记 为Aa (opt)+B β (opt)+ y (opt))转染后的第1、2、3和6天时重组人纤维蛋白原的表达水
平。实验重复进行两次。图3来自表达重组人纤维蛋白原的克隆体M21、M25和M57的批处理运行的培养 上清液的蛋白质印迹分析。对照泳道(contr)含血源性野生型纤维蛋白原(FIB3，Enzyme Research Laboratories)。箭头指示A α链的分解产物。图4来自表达具有扩展A α链的变体人纤维蛋白原(Fib420)的克隆体P40的批 处理运行的培养上清液的蛋白质印迹分析。泳道1是含血源性野生型纤维蛋白原(FIB3， Enzyme Research Laboratories)的对照泳道。泳道2和3含克隆体P40A α扩展的培养上 清液，分别取自比处理运行的第4天和第7天。图5用含Y’的人纤维蛋白原瞬时转染的PER. C6细胞的培养上清液的蛋白质 印迹分析(详见实例9中所述)。泳道1含表达重组Y’纤维蛋白原的PER. C6细胞的 培养上清液。泳道2是对照泳道，含血源性野生型纤维蛋白原(FIB3，Enzyme Research Laboratories)。图6通过PNGase F处理的N-糖基化的纤维蛋白原分析，接下来的SDS-PAGE分析。泳道加载如下MW 分子量标准(基准，hvitrogen)ERL FIB3 血源性纤维蛋白原(ERL)，用PNGase F处理(+)或不用PNGase F处理 ㈠。PER. C6 fdg :PER. C6源性纤维蛋白原，用PNGase F处理(+)或不用PNGase F处理㈠。每条泳道加载2 μ g纤维蛋白原；使用考马斯蓝(Coomassie Blue)完成染色。使用还原的10% BisTris 凝胶(Nul^age，Invitrogen)进行分析。图7R0TEM分析凝血时间。通过ROTEM分析确定凝血时间。200 μ 1合并的正常(柠檬酸盐)血浆或100 μ 1 合并的正常(柠檬酸盐)血浆以1 1的比例与Haemocomplettan (CSL Behring GmbH, Marburg, Germany)或PER. C6纤维蛋白原(均为在TBS中ang/ml)混合。添加CaC12至最终 浓度为17mM。为了开始凝血，加入α-凝血酶至最终浓度为lU/ml。总反应体积是240μ 1。 图中显示与纤维蛋白原以1 1混合的血浆的凝血时间(秒)1.血源性纤维蛋白原(CSL Behring, Marburg, Germany)2. PER. C6源性纤维蛋白原所有的测量均重复两次。图8R0TEM分析血凝块硬度。通过ROTEM分析确定血凝块硬度。图中表示的是 AlO值(mm)，该值是在血浆与纤维蛋白原以1 1混合10分钟时血凝块的硬度。实验细节 与图7的图例中所述相同。1.血源性纤维蛋白原(CSL Behring, Marburg, Germany)2. PER. C6源性纤维蛋白原
9
所有的测量均重复两次。图9R0TEM分析血凝块形成时间。用或不用林格氏(Ringer's)乳酸盐(Baxter， Utrecht, The Netherlands)稀释来自健康个体的柠檬酸盐血。随后给林格氏乳酸盐稀释 的血液补充或不补充(对照)血源性或重组的纤维蛋白原。图中显示如下1. 300 μ 1 血液2. 150 μ 1 血液、100 μ 1 林格氏乳酸盐(RL)、50 μ 1 TBS3. 150 μ 1 血液、100 μ 1 RL、50 μ 1 Haemocomplettan 6. 5mg/ml (最终浓度1. lmg/ ml)4. 150 μ 1 血液、100 μ 1 RL,50 μ 1 重组 hFbg 6. 5mg/ml (最终浓度:1. lmg/ml)在任何情况下均使用20 μ 1 star-TEM 和 20 μ 1 ex-TEM 试剂(Pentapharm GmbH, Munich, Germany)开始凝血。正常范围(35-160秒)是见于健康个体的值。160-220秒的CFT值见于止血功能正常未受损但储血减少的患者。图10 ROTEM分析血凝块硬度。用或不用林格氏乳酸盐(Baxter，Utrecht, The Netherlands)稀释来自健康个体 的柠檬酸盐血。随后给林格氏乳酸盐稀释的血液补充或不补充(对照)血源性或重组的纤 维蛋白原。测量条件如下1. 300 μ 1 血液2. 150 μ 1 血液、100 μ 1 林格氏乳酸盐(RL)、50 μ 1 TBS3. 150 μ 1 血液、100 μ 1 RL、50 μ 1 Haemocomplettan 6. 5mg/ml (最终浓度1. lmg/ ml)4. 150 μ 1 血液、100 μ 1 RL、50 μ 1 重组 hFbg 6. 5mg/ml (最终浓度1. lmg/ml)在任何情况下均使用20 μ 1 star-TEM 和 20 μ 1 ex-TEM 试剂(Pentapharm GmbH, Munich, Germany)开始凝血。正常范围(53-72mm)是见于无凝血功能障碍的健康患者的值。45_40mm的MCF值 见于有出血危险指征的患者。实例实例1优化的cDNA构建体的制备在野生型(此例中指非优化形式)和由GeneArt (RegensburgjGermany)密码子优 化的形式两者中合成编码人纤维蛋白原多肽链Αα、Ββ、γ、Αα-扩展(Fib420)和Y’的 cDNA (i)移除顺式作用位点(剪接位点，poly(A)信号)；(ii)修饰Aa链的重复序列；±曾 加GC含量以延长mRNA的半衰期；(iv)使密码子使用适应CHO (密码子适应指数-CAI- > 0.95)。使用的野生型参照物，对于α链是ΝΜ_021871，对于β链是ΝΜ_005141，对于γ链 是 ΝΜ_000509。将编码野生型形式中的Aa (SEQ ID NO. 1)、Ββ (SEQ ID NO. 2)和 y (SEQ ID NO. 3)链的00嫩与编码优化的八0 (SEQ ID Ν0·4)、Ββ (SEQ ID NO. 5)禾口 y (SEQ ID NO. 6) 的cDNA进行比较，结果示于表1。优化的Aa-扩展(Fib420) (SEQ ID NO. 7)和γ，序列(SEQ ID NO. 12)也示于表 1。野生型α (SEQ ID No. 1)、β (SEQ ID NO. 2)禾口 γ (SEQ ID NO. 3)链 cDNA 及优化 的 α (SEQ ID No. 4)、β (SEQ ID NO. 5)禾口 γ (SEQ ID NO. 6)链 cDNA 在 pcDNA3. 1 衍生物 (deriviate)中被亚克隆。野生型和优化的_A α -链及A α扩展(Fib420)均在pcDNA3. 1(+) neo 中，Ββ 链均在 pcDNA3. 1 (+)hygro 中，γ 链均在 pcDNA3. 1(-)hygro (Invitrogen, Carlsbad, USA)中。优化的Y'链在pcDNA3. 1 (+) hygro中被亚克隆。表 权利要求
1.一种编码纤维蛋白原α、β或Y链的核苷酸序列，所述核苷酸序列是针对在哺乳 动物细胞培养系统中的表达优化的。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列是针对在COS细胞、BHK细胞、 NSO细胞、CHO细胞、Sp2/0或人细胞培养系统中的表达优化的。
3.根据权利要求1或2所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列是针对在PER.C6细胞或 HEK293细胞培养系统中的表达优化的。
4.根据权利要求1-3所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列通过适应CHO细胞的密码子 使用被优化，优选密码子适应指数为至少0. 95。
5.根据权利要求1-4所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列的GC含量为至少55%。
6.根据权利要求1-5所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列显示出与其相应的非优化对 应物至少70%的一致性。
7.根据权利要求1-6所述的核苷酸序列，其中所述密码子优化的纤维蛋白原链不包含 顺式作用位点。
8.根据权利要求1-7所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有根据SEQID No. 4或7 的核苷酸序列或其一部分，或者具有包含与SEQ ID NO. 4或7有至少85%的一致性且编码 纤维蛋白原α链的序列的核苷酸序列。
9.根据权利要求1-7所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有根据SEQID No. 5的核 苷酸序列或其一部分，或者具有包含与SEQ ID NO. 5有至少85%的一致性且编码纤维蛋白 原β链的序列的核苷酸序列。
10.根据权利要求1-7所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有根据SEQID No. 6或 12的核苷酸序列或其一部分，或者具有包含与SEQ ID NO. 6或12有至少85%的一致性且 编码纤维蛋白原Y链的序列的核苷酸序列。。
11.包含根据权利要求1-10所述的核苷酸序列的核苷酸构建体。
12.包含根据权利要求1-10所述的核苷酸序列或权利要求11所述的核苷酸构建体的 细胞。
13.一种细胞或细胞系，所述细胞或细胞系以每天每个细胞至少3微微克的水平产生 完整的重组纤维蛋白原。
14.一种在真核细胞培养系统中产生纤维蛋白原的方法，所述方法包括在产生纤维蛋 白原的条件下培养根据权利要求12或13所述的细胞或根据权利要求13所述的细胞系，可 任选回收所产生的纤维蛋白原。
15.通过权利要求14所述的方法制备的纤维蛋白原制剂。
16.一种纤维蛋白原制剂，其中超过10%的α、β或Y链是变体型。
17.根据权利要求16所述的纤维蛋白原制剂，其中所述变体型是Y’链或α扩展链。
18.根据权利要求14-17所述的纤维蛋白原制剂，用作药剂、组织封闭剂或用于促进组 织粘连。
19.根据权利要求14-18所述的纤维蛋白原制剂在制备用于治疗或预防纤维蛋白原缺 乏症的药剂方面的用途。
20.一种通过重组技术产生的纤维蛋白原制剂，其中超过85%的纤维蛋白原是完整形 式的。
21. 一种选择产生完整重组纤维蛋白原的细胞或细胞系的方法，所述方法包括使用两 种抗体，其中一种抗体选择性地与α链的完整N-末端结合，另一种抗体选择性地与α链 的完整C-末端结合。
全文摘要
本发明涉及编码纤维蛋白原α、β或γ链的核苷酸序列。所述序列是针对在真核细胞培养系统中的表达优化的。这种优化的核苷酸序列可实现在真核细胞培养系统中以完整的形式高效表达重组纤维蛋白原及其变体。
文档编号C07K14/75GK102089322SQ200980126952
公开日2011年6月8日 申请日期2009年7月9日 优先权日2008年7月9日
发明者A·伯特, J·库普曼, J·格林伯格 申请人:普罗菲布瑞克斯公司