专利名称：用于抗微生物应用的肽序列、其分枝形式以及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及有效的抗微生物肽序列的鉴定，特别是抗蛋白酶活性并因此非常适合于在体内使用的抗微生物肽序列的鉴定，特别是当以四分枝MAP形式合成时。本发明的序列(KKIRVRLSA，SEQ ID No. 1，RRIRVRLSA, SEQ ID No. 2, KRIRVRLSA, SEQ ID No. 3, RKIRVRLSA，SEQ ID No. 4)来源于以前报道的以谷氨酰胺作为第一个氨基末端残基的肽M6。 去除谷氨酰胺给予了肽稳定性和批次与批次之间均一性预料之外的且令人惊奇的改善，并因此提供了肽合成的可靠方法，其对于M6肽是特别困难的。
背景技术：
多药物抗性细菌的不断出现是全球关注的事情，这些国家中的大部分都将抗生素广泛地使用于临床。许多病原体如金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、一些肠球菌(enterococci),铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)和许多其他革兰氏阴性细菌都已经产生了对大多数常规抗生素以及对那些新一代抗生素的抗性(Wenzel和Edmond 2000)。因此，研发新的抗生素变得越来越重要。这种需求促使研究团体和药物公司考虑新的抗微生物剂。抗微生物肽被认为是对通常引起抗性细菌选择的常规抗生素的最佳替代物之一(Hancock和Sahl 2006)。大多数抗微细菌是动物包括人类、植物和真菌的天然免疫组分(ZasloffdOO》。它们通常由 6-50个氨基酸残基组成，并具有净正电荷。阳离子肽选择性地与阴离子细菌膜和与其他负电荷结构例如LPS和DNA相互作用。真核细胞的膜的外层通常比细菌的膜的外层带更少的负电荷，并且与细菌的膜不同，它们也通过胆固醇分子稳定化。这些差异是阳离子肽的特异性的基础。因此，阳离子抗微生物肽的作用机制归因于它们与细菌膜的特异结合，其引起细胞通透，并且在某些情况下引起代谢途径抑制。因而，许多研究旨在通过研究它们的作用机制、当局部地或者全身地施用时它们对真核细胞的毒性和它们的治疗有效性来鉴定和表征抗微生物肽序列。遗憾地是，迄今为止，两个主要的问题阻碍了抗微生物肽药物的研发。第一个问题是用于细菌的天然抗微生物肽的选择性通常太低并且它们对真核细胞特别是红细胞有剧毒，产生了高水平的溶血。 第二个问题与肽在体内普遍的短半衰期有关。这是过去10年仅有很少的阳离子肽进入市场的主要原因(多粘菌素和达托霉素是两个成功的例子)。几年前，研究者开始致力于鉴定在实验室中通过合理设计或者组合文库的筛选而选择的非天然来源的新肽序列。目的是根据一般毒性和对细菌的特异性以及改进的半衰期为药物研发发现具有更好的生物学特性的肽。在本发明人的实验室中，鉴定了非天然肽序列，其特别地显示出对革兰氏阴性细菌强的抗微生物活性(Pini等，200幻。通过合理地修饰鉴定自组合文库的序列获得了肽 (QKKIRVRLSA，SEQ ID No. 5，称为M6)，其以MAP四分枝形式合成，其中4个相同的肽序列通过赖氨酸核心连接到一起。这种分子显示出对蛋白酶和肽酶高的抗性，因而克服了短半衰期的问题(Bracci等，2003 ；Falciani等，2007)。已经在以下方面对分枝状的抗微生物肽M6进行了表征其对许多细菌包括几种多药物抗性临床分离物的生物学活性，其与DNA的相互作用，其对几种真核细胞系的体外毒性，以及其溶血活性，其免疫原性，当腹膜内或静脉内注射时其在体内的毒性(Pini等，2007)。在M6的表征中进行的所有实验期间，我们注意到具有非均一的活性的M6产生的肽的不同合成(批次与批次之间不同)(
图1A)。质谱分析显示，M6的第一个氨基酸，即谷氨酰胺，转变成了焦谷氨酸(图1B)。含有焦谷氨酸而非谷氨酰胺的不同的肽的存在以不可预测的百分率随批次而改变。事实上，完全去除这种副产物是不可能的，首先，因为在HPLC 纯化期间由于其与主要产物具有类似的保留时间而不容易除去它，第二，因为当在溶液中时，它会持续从亲代肽中产生。由于焦谷氨酸类似物相对于谷氨酰胺类似物显示出明显降低的抗微生物活性，所以混合物的整体活性因批次而异(图1A)。为了最小化批次与批次之间的不同，在用于临床前实验和可能地用于工业生产的大规模肽生产方面，我们从M6中去除了第一个谷氨酰胺残基并也用精氨酸替换了前两个赖氨酸或者用赖氨酸和精氨酸更换了这前两个残基。这产生了缺失M6序列中存在的第一个谷氨酰胺的下列9聚体序列KKIRVRLSA，SEQ ID No. 1，称为M33 ；RRIRVRLSA, SEQ ID No. 2，称为 M34, KRIRVRLSA, SEQ ID No. 3，称为 M35, RKIRVRLSA, SEQID No. 4，称为 M36。这些序列是本申请的主题。将新肽进行描述于下文实施例中中的几种表征。事实上，去除M6肽序列N末端的单一氨基酸残基和可能地更换前两个位置中的赖氨酸和精氨酸产生了更好的抗微生物活性，并且不造成毒副作用和作用机制方面的任何不同行为。实际上，它导致合成可靠性的有力改善，使得肽M33、M34、M35和M36的序列相对于M6更适合于工业研发。由于改善的稳定性和批次与批次之间的均一性，M33、M34、M35和 M36序列是用于抗微生物药物研发的理想候选物。发明描述本发明的目的是以单体结构或者树状聚体结构，优选地以多抗原肽(MAP)形式合成的肽序歹Ij KKIRVRLSA, SEQ ID No. 1，M33 ；RRIRVRLSA, SEQ ID No. 2，M34, KRIRVRLSA, SEQ ID No. 3，M35, RKIRVRLSA, SEQ ID No. 4，M36，所述多抗原肽(MAP)形式具有通式
权利要求
1.抗菌肽，其具有选自KKIRVRLSA，SEQ ID No. 1，RRIRVRLSA，SEQ ID No. 2，KRIRVRLSA， SEQ ID No. 3，RKIRVRLSA，SEQ ID No. 4的从氨基末端到羧基末端的氨基酸序列或其功能性衍生物，其中一个氨基酸残基由丙氨酸残基取代或者其中一个带正电荷的氨基酸由另一个带正电荷的氨基酸取代。
2.根据权利要求1所述的肽，其是线性形式。
3.根据权利要求2所述的肽，其在聚丙烯酰胺骨架上、在葡聚糖单位骨架上或者在乙二醇单位骨架上多聚化。
4.根据权利要求1所述的肽，其是多抗原肽(MAP)形式，具有下列通式其中，R是如在权利要求1中所要求保护的肽；X是三功能性分子；m = 0或1 ;n = 0或 1 ；当m和η是0时，所述肽是二聚体；当m = 1且η = 0时，所述肽是四聚体，当m = 1且η =1时，所述肽是八聚体。
5.根据权利要求4所述的MAP肽，其中X是三功能性单位。
6.根据权利要求5所述的MAP肽，其中所述三功能性单位包含至少两个功能性氨基基团。
7.根据权利要求6所述的MAP肽，其中X是赖氨酸、鸟氨酸、降赖氨酸或者氨基丙氨酸。
8.根据权利要求4所述的MAP肽，其中X是天冬氨酸或者谷氨酸。
9.根据权利要求4所述的MAP肽，其中X是丙二醇、丁二酸、二异氰酸酯或者二胺衍生物。
10.根据前述权利要求中任一项所述的肽，用于药物用途。
11.根据前述权利要求中任一项所述的肽，作为抗菌药物。
12.药物组合物，其包含药学上可接受的且有效量的根据权利要求10或者11的肽。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其以溶液剂形式在个体中注射用于全身使用。
14.根据权利要求12所述的药物组合物，其以溶液剂形式作为解毒剂注射用于LPS中和。
15.根据权利要求12所述的药物组合物，其以洗眼剂、漱口剂、软膏剂或者溶液剂形式用于局部使用。
16.具有抗菌活性的消毒剂和/或洗涤剂制剂，其包含根据权利要求1至11的肽。
17.根据权利要求1至11所述的肽的用途，用作防腐剂用于制备食物产品和/或美容产品和/或顺势疗法产品。
全文摘要
本发明涉及具有选自KKlRVRLSA，SEQ ID No.1，RRIRVRLSA，SEQ ID No.2，KRIRVRLSA，SEQ ID No.3，RKlRVRLSA，SEQ ID No.4的从氨基末端到羧基末端的氨基酸序列的抗菌肽或其衍生物及其用途。
文档编号C07K7/06GK102170899SQ200980139093
公开日2011年8月31日 申请日期2009年10月5日 优先权日2008年10月5日
发明者A·皮尼, C·法尔恰尼, L·布拉奇 申请人:锡耶纳大学