Wdrpuh表位肽及包含它的疫苗的制作方法

专利名称：Wdrpuh表位肽及包含它的疫苗的制作方法
技术领域：
本申请要求2008年12月5日提交的美国临时申请No. 61/200，962和2009年3 月9日提交的61/209，704的权益，通过述及将其全部内容收入本文。本发明涉及生物科学领域，更具体的说是癌症治疗领域。具体而言，本发明涉及作为癌症疫苗极其有效的新肽，及用于治疗和预防肿瘤的药物。
背景技术：
已经证明，⑶8阳性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可识别主要组织相容性复合物 (MHC) I类分子上出现的肿瘤相关抗原(TAA)衍生的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。从TAA的第一个例子——黑素瘤抗原(MAGE)家族被发现起，人们主要通过免疫学手段(Boon Τ, Int J Cancer 1993 May 8,54(2) 177-80 ；Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996Mar 1， 183(3) 725-9)已经发现了许多其它TAA。人们正在将这些TAA中的一些作为免疫治疗的靶标进行临床开发能够诱导强力且特异性的抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定保证了针对各种类型癌症的肽疫苗接种策略的进一步开发和临床应用(Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20) 1442-55 ;Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999Jul 1,59(13) 3134-42 ；Vissers JL et al.，Cancer Res 1999Nov 1,59(21) :5554_9 ；van der Burg SH et al.，J Immunol 1996 May 1，156(9) 3308-14 ；Tanaka F et al.，Cancer Res 1997 Oct 15,57(20) 4465-8 ；Fujie T et al.，Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2) 169-72 ； Kikuchi M et al.，Int J Cancer 1999 May 5,81(3) 459-66 ；Oiso Met al.，Int J Cancer 1999May 5,81 (3) :387_94)。到此为止，已经有数项使用这些肿瘤相关抗原衍生的肽进行临床试验的报告。不幸的是，迄今为止在这些癌症疫苗试验中只观察到较低的客观应答率(Belli F et al.，J Clin Oncol 20020ct 15，20 (20) 4169-80 ；Coulie PG et al.,Immunol Rev 2002 Oct,188 :33_42 ；Rosenberg SA et al.，Nat Med 2004Sep,10(9) 909-15)。癌细胞增殖和存活不可缺少的TAA适合作为免疫疗法的靶标，因为使用此类TAA 可使广为记载的癌细胞的免疫逃避的风险最小化，癌细胞的免疫逃避可归于因治疗驱动的免疫选择而发生的TAA删除、突变、或下调。通过使用含有23，040种基因的全基因组cDNA微阵列的基因表达谱分析，WDRPUH 被鉴定为一种在肝细胞癌中上调的新型WD重复蛋白(Silva et al. , Neoplasia 2005 Apr ；7 (4) :348-55，WO 2003/104276)。已经报告含有WD重复的蛋白在广泛的生理功能中发挥重要作用，包括信号转导、RNA加工(Bjorn et al.，Mol Cell Biol. 1989 Sep ；9 (9) 3698-709)、细胞骨架的重塑(Vaisman et al.，Mol Gen Genet. 1995 Apr 20 ；247 (2) 123-36)、对囊泡运输的调节(Pryer et al.，JCell Biol. 1993 Feb ； 120 (4) :865_75)、和细胞分裂(Feldman et al. ,Cell. 1997 0ctl7 ；91(2) :221_30)。Northern 印迹分析显示， TORPUH在绝大部分肝细胞癌中以显著高水平过表达，但是在除睾丸外的正常器官中则不表达。此外，已经显示用siRNA遏制WDRPUH表达可显著抑制人肝细胞癌细胞系的生长(Silvaet al. , Neoplasia 2005 Apr ；7 (4) 348-55, WO 2003/104276)。引用表专利文献[PTL 1]W0 2003/104276专利文献[NPL l]Boon T, Int J Cancer 1993 May 8,54(2) 177-80[NPL 2]Boon T&van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1,183(3) :725_9[NPL 3]Harris CC,J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16,88(20)1442-55[NPL 4]Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999 Jul 1，59 (13)，3134-42[NPL 5]Vissers JL et al. , Cancer Res 1999 Nov 1,59(21) :5554_9[NPL 6]van der Burg SH et al.，J Immunol 1996May 1，156(9) :3308_14[NPL 7]Tanaka F et al. , Cancer Res 1997 Oct 15,57(20) 4465-8[NPL 8]Fujie T et al.，Int J Cancer 1999 Jan 18,80(2) 169-72[NPL 9]Kikuchi M et al. ， Int J Cancer 1999 May 5,81(3) :459_66[NPL 10]Oiso M et al. ， Int J Cancer 1999 May 5,81(3) :387_94[NPL IlJBelli F et al. ，J Clin Oncol 2002 Oct 15,20(20) :4169_80[NPL 12]Coulie PG et al.，Immunol Rev 2002 Oct, 188 :33_42[NPL 13]Rosenberg SA et al. ，Nat Med 2004 Sep,10(9) :909_15[NPL 14]Silva et al.，Neoplasia 2005 Apr ；7(4) :348_55[NPL 15]Bjorn et al.，Mol Cell Biol. 1989 Sep ；9(9) :3698_709[NPL 16]Vaisman et al.，Mol Gen Genet. 1995 Apr 20 ；247 (2) 123-36)[NPL 17]Pryer et al.，J Cell Biol. 1993 Feb ；120(4) :865_75[NPL 18]Feldman et al. , Cell. 1997 Oct 17 ；91 (2) :221_30发明_既述本发明部分基于合适的免疫疗法靶标的发现。由于TAA —般被免疫系统察觉为 “自身”并因此常常没有先天免疫原性，适宜靶标的发现是极其重要的。如上所述，在认识到 WDRPUH(由 GenBank 登录号匪 145054(SEQ IDNO 63)的基因编码的 SEQ ID NO 64)已经被鉴定为在肝细胞癌的癌症组织中上调后，WDRPUH成为免疫疗法的候选靶标。本发明至少部分基于WDRPUH的基因产物的拥有诱导对WDRPUH特异性的CTL的能力的特定表位肽的鉴定。如下文详细讨论的，使用WDRPUH衍生的HLA-A*2402或HLA-A*0201 结合候选肽刺激从健康供体获得的外周血单个核细胞(PBMC)。然后建立了具有针对经每一种候选肽冲激的HLA-A24或HLA-A2阳性靶细胞的特异性细胞毒性的的CTL系。结果证明， 所述肽是能诱导针对在表面上表达WDRPUH的细胞的强而特异性的免疫应答的HLA-A24或 HLA-A2限制表位肽。另外，它指明，WDRPUH具有强免疫原性，而且它的表位是肿瘤免疫疗法的有效靶标。因而，本发明的一个目的是提供分离的与HLA抗原结合的肽，该 肽由WDRPUH(SEQ ID NO 64)或WDRPUH的片段组成。此类肽预期具有CTL诱导能力且可用于离体诱导CTL或用于给受试者施用以诱导抗癌症(诸如肝细胞癌)免疫应答。所述肽可以是九肽或十肽， 优选由选自 SEQ ID NO :1，2，3，4，16，17，30，31，34，36，37，40，41，45，49，55，57 和 61 的氨基酸序列组成，并显示强CTL诱导能力。此外，本发明涵盖经过修饰的肽，其具有氨基酸序列SEQ ID NO :1，2，3，4，16，17， 30，31，34，36，37，40，41，45，49，55，57和61，其中替代、插入、删除或添加了一个、两个或几个氨基酸，只要经过修饰的肽保留原始的CTL诱导能力。本发明的又一个目的是提供分离的编码任何本发明肽的多核苷酸。这些多核苷酸可用于诱导具有CTL诱导能力的抗原表达细胞(APC)或用于给受试者施用以诱导针对本发明肽，并因此最终针对癌症的免疫应答。当对受试者施用时，本发明的肽呈递在APC的表面上，然后诱导靶向相应肽的 CTL0因此，本发明的一个目的是提供含有任何本发明肽或多核苷酸的作用剂，用于诱导 CTL0这些含有任何本发明肽或多核苷酸的作用剂可用于治疗和/或预防癌症，诸如肝细胞癌，和/或防止其术后复发。如此，本发明的又一个目的是提供用于治疗和/或预防癌症， 和/或防止其术后复发的药剂，其含有任何本发明肽或多核苷酸。本发明的制剂或药剂也可含有呈递任何本发明肽的APC或外来体作为活性组分，作为本发明的肽或多核苷酸的替代或补充。

本发明的肽或多核苷酸具有诱导APC的能力，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与本发明肽的复合物。例如，诱导可通过使受试者衍生的APC与本发明的肽接触或向APC 中导入编码本发明肽的多核苷酸来实现。此类APC具有针对靶肽的高CTL诱导能力，而且可用于癌症免疫疗法。因此，本发明的又一个目的是提供用于诱导具有CTL诱导能力的APC 的方法和通过该方法获得的APC。本发明的又一个目的是提供用于诱导CTL的方法，该方法包括共培养⑶8阳性细胞与在其表面上呈递本发明肽的APC或外来体的步骤或向T细胞中导入多核苷酸的步骤， 该多核苷酸编码与本发明肽结合的T细胞受体(TCR)亚单位多肽。通过该方法获得的CTL 可用于治疗和/或预防癌症，诸如肝细胞癌。因此，本发明的又一个目的是提供通过任何本发明方法获得的CTL。本发明的另一个目的是提供用于诱导抗癌症免疫应答的方法，该方法包括施用含有任何本发明WDRPUH多肽、编码WDRPUH多肽的多核苷酸、呈递WDRPUH多肽的外来体或APC 的制剂的步骤。本发明可用于任何涉及WDRPUH过表达的疾病，包括但不限于癌症，特别是肝细胞癌。要理解，上面的发明概述和下面的详细描述都是例示性的实施方案，而非限制本发明或本发明的其它备选实施方案。附图简述在考虑本发明的附图简述和后面的详细描述及优选实施方案后，本发明的各方面和应用对于熟练技术人员会变得显而易见。

图1包括一系列照片，描绘用WDRPUH衍生肽诱导的CTL的IFN- y ELISPOT 测定的结果。用WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO 1)刺激的3号和6号孔(a)、用 WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO :2)刺激的 8 号孔(b)、用 WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO: 3)刺激的2号和6号孔(c)、用WDRPUH-A24-9-339 (SEQ ID NO 4)刺激的1号、2号和5号孑L (d)、用 WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO 16)刺激的 2 号、3 号、4 号、6 号、7 号和 8 号孔(e)及用WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO 17)刺激的5号、6号和8号孔(f)中的CTL分别显示与对照相比强的IFN-Y生成。扩增用矩形框标示的孔中的细胞以建立CTL系。在图中，“+"指示孔中的细胞用适宜的肽冲激过，而"指示细胞没有用任何肽冲激过。图2包括一系列线图，描绘用IFN-Y ELISA测定法得到的用 WDRPUH-A24-9-40 (SEQ ID NO 1) (a)、TORPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO :2) (b)、 WDRPUH-A24-9-509 (SEQ ID NO 3) (c)、WDRPUH-A24-9-339 (SEQID NO :4)⑷、 WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO 16) (e)和 WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO 17) (f)刺激的 CTL系的IFN-Y生成。用每一种肽刺激而建立的CTL系都显示了与对照相比强的IFN-Y 生成。在图中，“+"指示孔中的细胞用适宜的肽冲激过，而"指示细胞没有用任何肽冲激过。图3由一幅线图组成，描绘针对外源表达WDRPUH和HLA_A*2402的靶细胞的特异性CTL活性。制备只用HLA-A*2402或只用全长WDRPUH基因转染的C0S7细胞作为对照。 用 WDRPUH-A24-9-314 (SEQ ID NO 2)建立的 CTL 系显示了针对经 WDRPUH 和 HLA_A*2402 二者转染的C0S7细胞的特异性CTL活性(黑色菱形)。相反，没有检测到显著的针对表达 HLA-A*2402 (三角形)或WDRPUH(圆形)任一的靶细胞的特异性CTL活性。图4a_h包括一系列照片，描绘用WDRPUH衍生肽诱导的CTL的IFN- y ELISPOT 测定的结果。用WDRPUH-A2-9-39 (SEQ ID NO 30)刺激的2号和7号孔(a)、用 WDRPUH-A2-9-407 (SEQ ID NO 31)刺激的 2 号孔(b)、用 WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID NO: 34)刺激的 3 号孔(c)、用 WDRPUH-A2-9-237 (SEQ ID NO 36)刺激的 6 号孔(d)、用 WDRPUH-A2-9-543 (SEQ ID NO :37)刺激的 4 号孔(e)、用 WDRPUH-A2-10-570 (SEQ ID NO: 40)刺激的4号孔(f)、用WDRPUH-A2-10-263 (SEQ ID NO 41)刺激的2号和8号孔(g)、用 WDRPUH-A2-10-78 (SEQ ID NO 45)刺激的5号孔(h)中的CTL分别显示与对照相比强的 IFN-Y生成。扩增用矩形框标示的孔中的细胞以建立CTL系。在图中，“+"指示孔中的细胞用适宜的肽冲激过，而"指示细胞没有用任何肽冲激过。图4i_l包括一系列照片，描绘用WDRPUH衍生肽诱导的CTL的IFN- y ELISP0T测定的结果。用 WDRPUH-A2-10-10 (SEQ ID NO 49)刺激的 2 号孔⑴、用 WDRPUH-A2-10-411 (SEQ ID NO 55)刺激的 6 号孑L (j)、用 WDRPUH-A2-10-287 (SEQ ID NO 57)刺激的 7 号孔(k) 和用WDRPUH-A2-10-265 (SEQ ID NO 61)刺激的6号孔(1)中的CTL分别显示与对照相比强的IFN-Y生成。扩增用矩形框标示的孔中的细胞以建立CTL系。在图中，"+"指示孔中的细胞用适宜的肽冲激过，而"指示细胞没有用任何肽冲激过。图5a和b由线图组成，描绘用IFN-Y ELISA测定法检测到的用SEQ ID NO 30 (a) 和SEQ ID NO :34(b)刺激的CLT系的IFN- γ生成。用每一种肽刺激而建立的CTL系都显示了与对照相比强的IFN-Y生成。在图中，“+"指示孔中的细胞用适宜的肽冲激过， 而"-"指示细胞没有用任何肽冲激过。图5c和5d描绘从用SEQ ID NO 30(c)和SEQ ID NO 34(d)刺激的CTL系通过有限稀释而建立的CTL克隆的IFN-γ生成。此处显示的结果证明通过用SEQ ID NO 30(c)和SEQ ID NO 34(d)刺激而建立的CTL克隆显示与对照相比强的IFNi生成。在图中，‘‘+〃指示孔中的靶细胞用SEQ ID NO 30(c)和SEQ ID N0: 34(d)冲激过，而"-"指示靶细胞没有用任何肽冲激过。图5e由一幅线图组成，描绘针对外源表达WDRPUH和HLA-A*0201的靶细胞的特异性CTL活性。制备只用HLA_A*0201或只用全长WDRPUH基因转染的C0S7细胞作为对照。用WDRPUH-A2-9-288 (SEQ ID NO 34)建立的CTL克隆显示了针对经WDRPUH和HLA-A*0201 二者转染的C0S7细胞的特异性CTL活性 (黑色菱形)。相反，没有检测到显著的针对表达HLA-A*0201 (三角形)或WDRPUH(圆形) 任一的靶细胞的特异性CTL活性。实施方案的描述现在描述优选的方法、装置、和材料，不过在实施或检验本发明的实施方案时可使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料。然而，在描述本发明材料和方法之前，要理解本发明不限于特定大小、性状、尺度、材料、方法、方案等，因为它们可依照例行实验和优化而变化。还要理解，所述描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围，本发明的范围只会由所附权利要求来限制。通过述及明确将本说明书中提到的每一篇出版物、专利或专利申请的公开文本完整收入本文。然而，本文中无一处可解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类公开文本。如果有冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅为举例说明而不构成限制。I.定义如本文中使用的，词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”，除非
另有明确说明。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是经过修饰的残基或非天然存在型残基(诸如相应的天然存在型氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸聚合物，以及天然存在型氨基酸聚合物。如本文中使用的，术语“氨基酸”指天然存在型和合成型氨基酸，以及与天然存在型氨基酸发挥相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在型氨基酸指由遗传密码编码的氨基酸，以及在细胞中在翻译后被修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、 和0-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指与天然存在型氨基酸具有相同的基础化学结构(α碳与氢、羧基、氨基、和R基团结合)但具有经过修饰的R基团或经过修饰的主链的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。短语“氨基酸模拟物” 指与具有与一般氨基酸不同的结构但发挥与一般氨基酸相似的功能的化学化合物。氨基酸在本文中可以通过它们公知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来指称。术语“多核苷酸”、“基因”、“核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，除非另有明确说明。除非另有定义，术语“癌症”指过表达WDRPUH基因的癌症，其实例包括但不限于肝细胞癌。除非另有定义，术语“细胞毒性T淋巴细胞”、“细胞毒性T细胞”和“CTL”在本文中可互换使用，而且除非另有明确说明，指能够识别非自身细胞(例如肿瘤细胞、病毒感染的细胞)并诱导此类细胞死亡的T淋巴细胞亚群。除非另有定义，术语“HLA-A2”包括亚型，诸如HLA-A0201或HLA-A0206。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的普遍理解相同的含义。II.肽为了证明WDRPUH衍生的肽发挥被CTL所识别的抗原的功能，对WDRPUH(SEQ ID NO 64)衍生的肽进行分析以确定它们是否为HLA-A24(它们是常见的HLA等位基因)限制性的抗原表位(Date Y et al.，Tissue Antigens 47 :93_101，1996 ；Kondo A et al.，J Immunol 155 4307-12,1995 ；Kubo RT et al. ,J Immunol 152:3913-24,1994)。基于它们对HLA-A24的结合亲和力来鉴定WDRPUH衍生的HLA-A24结合肽的候选者。下面的肽是候选肽WDRPUH-A24-9-40(SEQ ID NO 1),WDRPUH-A24-9-314(SEQ ID NO 2),WDRPUH-A24-9-509(SEQ ID NO 3),WDRPUH-A24-9-339(SEQ ID NO 4),WDRPUH-A24-10-409 (SEQ ID NO: 16)，禾口WDRPUH-A24-10-40 (SEQ ID NO: 17)。基于它们对HLA-A02的结合亲和力来鉴定WDRPUH衍生的HLA-A02结合肽的候选者。下面的肽是候选肽WDRPUH-A2-9-39(SEQ ID NO 30),WDRPUH-A2-9-407(SEQ ID NO 31),WDRPUH-A2-9-288(SEQ ID NO 34),WDRPUH-A2-9-237(SEQ ID NO 36),WDRPUH-A2-9-543(SEQ ID NO 37),WDRPUH-A2-10-570(SEQ ID NO 40),WDRPUH-A2-10-263(SEQ ID NO 41),WDRPUH-A2-10-78(SEQ ID NO 45),WDRPUH-A2-10-10(SEQ ID NO 49),WDRPUH-A2-10-411(SEQ ID NO 55),WDRPUH-A2-10-287 (SEQ ID N0:57)，和WDRPUH-A2-10-265(SEQ ID NO :61)。这些建立的CTL显示针对经相应肽冲激的靶细胞的强且特异性的CTL活性。本文中的这些结果证明WDRPUH是被CTL识别的抗原，而且这些肽可能是受HLA-A24或HLA-A02 限制的WDRPUH表位肽。由于WDRPUH基因在诸如肝细胞癌的癌细胞中过表达，而且在大多数正常器官中不表达，它是良好的免疫治疗靶标。因此，本发明提供与WDRPUH的CTL识别表位对应的九肽(由九个氨基酸残基组成的肽)和十肽(由十个氨基酸残基组成的肽)。本发明的肽的特别优选例子包括那些由选自 SEQ ID No 1, 2, 3,4,16,17, 30, 31, 34, 36, 37,40,41,45,49, 55，57和61的氨基酸序列组成的肽。一般而言，可使用当前在互联网上可得的软件程序，诸如Parker KC et al. , J Immunol 1994 Jan 1，152(1) 163-75中记载的软件程序，在计算机上(in silico)计算各种肽与HLA抗原之间的结合亲和力。可以如例如Parker KC et al. , JImmunol 1994 Jan 1,152(1) :163-75 ；及 Kuzushima K et al.，Blood 2001,98(6) :1872-81 等参考文献中所述来测量与HLA抗原的结合亲和力。例如Journal of Immunological Methods, 1995,185 181-190 ；Protein Science, 2000,9 :1838-1846中记载了用于测定结合亲和力的方法。因此，能使用此类软件程序来选择对HLA抗原具有高结合亲和力的WDRPUH片段。如此，本发明涵盖由任何自WDRPUH衍生的片段组成的肽，其结合使用此类已知程序鉴定的HLA抗原。 另外，本发明的肽也可由全长WDRPUH组成。本发明的肽侧翼可以有额外的氨基酸残基，只要所得的肽保留其CTL诱导能力。 本发明肽侧翼的具体氨基酸残基可以由任何种类的氨基酸组成，只要它们不妨碍原始肽的 CTL诱导能力。如此，本发明还提供对HLA抗原具有结合亲和力且含有自WDRPUH衍生的氨基酸序列的肽。此类肽通常小于约40个氨基酸，常常小于约20个氨基酸，通常小于约15
个氨基酸。一般而言，肽中一个、两个、或更多个氨基酸的修饰不会影响肽的功能，而且在有些情况下甚至会增强原始蛋白质的期望功能。事实上，已知有经过修饰的肽(即由与原始参照序列相比其中修饰(即替代、删除、添加或插入)一个、两个或数个氨基酸残基的氨基酸序列构成的肽)保留原始肽的生物学活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1984,81 :5662-6 ；Zoller ^P Smith, Nucleic Acids Res 1982，10 :6487-500 ; Dalbadie-McFarland et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79 :6409-13)。因此，在一个实施方案中，本发明的肽可既具有CTL诱导能力，又具有选自SEQ ID N0:l，2，3，4，16，17， 30，31，34，36，37，40，41，45，49，55，57和61的氨基酸序列中插入、删除、添加和/或替代一个、两个或甚至更多个氨基酸而得到的氨基酸序列。本领域技术人员认可，改变氨基酸序列中的单个氨基酸或少数百分比氨基酸的个别替代往往会导致原始氨基酸侧链的特性得以保留。因此，它们常常称作“保守替代”或“保守修饰”，其中对蛋白质的改变导致具有与原始蛋白质类似功能的修饰蛋白质。提供功能上相似的氨基酸的保守替代表是本领域公知的。期望保留的氨基酸侧链特征的例子包括例如疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W, Y，V)、亲水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下面的共同官能团或特征的侧链脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)； 含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱侧链(R，K，H)；和含芳香族侧链 (H，F，Y，W)。另外，下面的八组各自含有本领域公认互为保守替代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸⑴，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如 Creighton, Proteins 1984)。此类保守修饰肽也被视为本发明的肽。然而，本发明的肽不限于此，可包括非保守修饰，只要经过修饰的肽保留原始肽的CTL诱导能力。另外，经过修饰的肽不应排除WDRPUH的多态变体、种间同源物、和等位基因中的可诱导CTL的肽。为了保留必需的CTL诱导能力，可修饰(插入、删除、添加和/或替代)少量(例如1个、2个或数个)或小百分比的氨基酸。在本文中，术语“数个”意味着5个或更少的氨基酸，例如4个、3个或更少。要修饰的氨基酸的百分比优选20%或更少，更优选15%或更少，甚至更优选10%或更少、或者1至5%。此外，可在肽中替代、插入、删除和/或添加氨基酸残基以产生具有改良的结合亲和力的修饰肽。当在免疫疗法的语境中使用时，本发明的肽应呈递在细胞或外来体的表面上，优选作为与HLA抗原的复合物。除了天然被展示的肽之外，由于已经知道通过结合 HLA 抗原而被展示的肽的序列规律(JImmunol 1994，152 :3913 ；Immunogenetics 1995,41 178 J Immunol 1994，155 :4307)，可将基于此类规律的修饰引入本发明的免疫原性肽。例如，可以用苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸替代从N端起的第二个氨基酸，和/或用苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸替代C端氨基酸，以提高HLA-AM结合。如此，本发明涵盖下述肽，其具有选自SEQ ID No :1，2，3，4，16和17的氨基酸序列，其中上述SEQ ID NO的氨基酸序列的从N端起第二个氨基酸被苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、 或色氨酸，和肽替代，和/或其中上述SEQ ID NO的氨基酸序列的C端氨基酸被苯丙氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸替代。另一方面，具备高HLA-A2结合亲和力的肽从 N端起的第二个氨基酸被替代为亮氨酸或甲硫氨酸，及C端氨基酸被替代为缬氨酸或亮氨酸。因此，本发明涵盖这样的肽，它们具有SEQ ID No :30，31，34，36，37，40，41，45，49，55， 57和61的氨基酸序列，其中从N端起的第二个氨基酸被替代为亮氨酸或甲硫氨酸，和/或其中C端氨基酸被替代为缬氨酸或亮氨酸。不仅可以在肽的末端氨基酸处引入替代，而且可以在潜在T细胞受体(TCR)识别位置处引入替代。数项研究证明了具有氨基酸替代的肽可等同于或好于原来，例如CAPl、p53 (264—272)、Her_2/neu(369—377)或 gplOO(209—217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57，4570-4577，1997，Τ· K. Hoffmann et al. JImmunol. (2002)Feb 1 ； 168(3) :1338-47.，S. 0. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52 :199-206 及 S.0. Dionne et al. Cancer Immunology，Immunotherapy(2004) 53，307—314)。本发明还涵盖向所述的肽的N和/或C端添加一个、两个或几个氨基酸。本发明也包括此类具有高HLA抗原结合亲和力且保留CTL诱导能力的经过修饰的肽。然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可能诱导副作用，诸如自身免疫性病症和/或针对特定物质的变应性症状。因此，优选的是，首先利用可得的数据库实施同源性搜索，以避免肽的序列与另一种蛋白质的氨基酸序列匹配的情况。当根据同源性搜索清楚了即使与目标肽相比差1个或2个氨基酸的肽亦不存在时，可以修饰目标肽以提高其与HLA抗原的结合亲和力，和/或提高其CTL诱导能力，而没有此类副作用的任何危险。虽然预期如上所述对HLA抗原具有高结合亲和力的肽是高度有效的，但还是对以高结合亲和力的存在作为指标而选出的候选肽进一步检查CTL诱导能力的存在。在本文中，短语“CTL诱导能力”指肽在抗原呈递细胞(APC)上呈递时诱导CTL的能力。另外，“CTL 诱导能力”包括肽诱导CTL活化、CTL增殖、促进CTL溶解靶细胞、和提高CTL IFN-γ生成的能力。CTL诱导能力的确认如下来实现，诱导携带人MHC抗原的APC (例如B-淋巴细胞、巨噬细胞、和树突细胞(DC))，或更具体地，自人外周血单个核淋巴细胞衍生的DC，并在用肽进行刺激后，与CD8阳性细胞混合，然后测量由CTL针对靶细胞生成和释放的IFN-γ。 作为反应系统，可使用已经制成的表达人HLA抗原的转基因动物(例如BenMohamed L， Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000Aug, 61(8) :764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice :dependence on HLA classll restricted T (H) response中记载的那些)。例如，可以用51Cr等放射性标记靶细胞，并且可以自靶细胞释放的放射性计算细胞毒性活性。或者，CTL诱导能力可以如下评估测量在携带固定化肽的APC存在下由CTL生成和释放的IFN- γ，并使用抗IFN- γ单克隆抗体显现培养基上的抑制区。作为如上所述地对肽的CTL诱导能力进行检验的结果，发现具有选自SEQ ID No 1，2，3，4，16，17，30，31，34，36，37，40，41，45，49，55，57 和 61 的氨基酸序列的九肽或十肽展现特别高的CTL诱导能力以及对HLA抗原的高结合亲和力。因此，例示这些肽作为本发明的优选实施方案。另外，同源性分析的结果显示了这些肽与自任何其它已知人基因产物衍生的肽没有显著同源性。这意味着由于在免疫疗法中使用本发明的肽而引起未知的或不期望的免疫应答的可能性较低。因此，同样从这个方面来说，这些肽对于在癌症患者中引发针对WDRPUH 的免疫力是优选的。如此，特别优选的本发明肽包括那些具有选自SEQ ID No =1,2,3,4,16, 17，30，31，34，36，37，40，41，45，49，55，57 和 61 的氨基酸序列的肽。除上文所述修饰之外，还可将本发明的肽连接至其它肽，只要所得的肽保留原始肽的必需的CTL诱导能力。合适肽的例子包括但不限于本发明的肽或自其它TAA衍生的CTL可诱导肽。要置于肽之间的接头是本领域公知的，而且包括但不限于例如AAY (P. M. Dafearian et al.，J Trans Med 2007，5 :26)、AM、NKRK (R. P. Μ· Sutmuller et al.，J Immunol. 2000，165 :7308-7315)禾口K (S. Ota et al.，Can Res.62，1471—1476，K. S. Kawamura et al.，J Immunol. 2002，168 :5709-5715)。另外，还可将本发明的肽连接至其它物质，只要所得的肽保留原始肽的必需的CTL 诱导能力。合适物质的例子包括但不限于肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然的和合成的聚合物、等，前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。肽可含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化、或磷酸化等，前提是该修饰不破坏原始肽的生物学活性。可实施这些种类的修饰以赋予额外的功能(例如靶向功能和投递功能)或稳定多肽。例如，为了提高多肽的体内稳定性，本领域已知引入D-氨基酸、氨基酸模拟物或非天然氨基酸；此构思也可适用于本发明多肽。可以以多种方式测定多肽的稳定性。例如，可使用肽酶和各种生物学介质(诸如人血浆和血清)来测试稳定性(参见例如Verhoef et al.，EurJ Drug Metab Pharmacokin 1986，11 :291-302)。如上所述，有可能筛选或选择通过替代、插入、删除和/或添加一个、两个或几个氨基酸残基进行了修饰，但仍具有与原始肽相比相同或更高的活性的肽。如此，本发明还提供了用于筛选或选择具有与原始肽相比相同或更高活性的修饰肽的方法。例如，此类方法可包括下述步骤a 通过替代、删除、插入和/或添加来修饰本发明肽中的至少一个氨基酸残基；
12
b:测定修饰肽的活性；并c 选择被测定为具有与原始肽相比相同或更高活性的肽。本文中，步骤b中要测定的活性可以是MHC结合活性、APC或CTL诱导能力、和/或细胞毒性活性。本文中，本发明的肽也可以称为“WDRPUH肽”或“WDRPUH多肽”。III.TORPUH 肽的制备本发明的肽可使用公知技术来制备。例如，肽可以通过合成、使用重组DNA技术或化学合成来制备。可个别地合成本发明的肽，或作为由两个或更多个肽构成的较长多肽来合成本发明的肽。然后可以分离，即纯化所述肽，使其基本上不含其它天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段或任何其它化学物质。可以根据选定的氨基酸序列，借助化学合成来获得本发明的肽。可适用于合成的常规肽合成法的例子包括但不限于(i)Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966 ；(ii)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York,1976 ；(iii)P印tide Synthesis (日文)，Maruzen Co. , 1975 ；(iv)Basics 禾口 Experiment of Peptide Synthesis ( El 文)，Maruzen Co. ,1985 ；(ν) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol.14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991 ；(vi)W099/67^8 ；禾口(vii)Barany G. &Merrifield R. B. , Peptides Vol.2, “ Solid Phase Peptide Synthesis" , Academic Press, New York，1980，100—118。或者，可借助任何已知的遗传工程肽生产方法来获得本发明的肽(例如 Morrison J, J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；Clark—Curtiss&Curtiss，Methods in Enzymology (eds. Wu et al. ) 1983,101 :347-62)。例如，首先，制备包含处于可表达形式(例如处于相当于启动子序列的调节序列下游)的编码目标肽的多核苷酸的合适载体，并转移入合适宿主细胞。然后培养宿主细胞以生成感兴趣的肽。也可以采用体外翻译系统在体外生产肽。IV.多核苷酸本发明还提供编码任何上述本发明肽的多核苷酸。这些包括由天然存在型WDRPUH 基因(GenBank登录号NM_145697 (SEQ ID NO :34))衍生的多核苷酸以及具有它们的经过保守修饰的核苷酸序列的多核苷酸。在本文中，短语“经过保守修饰的核苷酸序列”指编码相同或本质上相同的氨基酸序列的序列。由于遗传密码的简并性，对于任何给定蛋白质都有极其多种功能上相同的核酸来编码它。例如，密码子GCA、GCC、GCG、和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子规定为丙氨酸的任何位置处，该密码子可改变成任何相应所述密码子，而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码肽的每一种核酸序列也涵盖该核酸的每一种可能的沉默变异。本领域普通技术人员会认识到，可以修饰核酸中的每一个密码子(AUG和TGG除外，AUG在正常情况下是甲硫氨酸的唯一密码子，而TGG在正常情况下是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。 因而，每一种所公开的序列隐含涵盖了编码肽的核酸的每一种沉默变异。
本发明的多核苷酸可以由DNA、RNA、及其衍生物构成。DNA由碱基诸如A、T、C、和 G合适地构成，而T在RNA中被U替换。本发明的多核苷酸可编码多个本发明肽，其中它们之间有或无居间氨基酸序列存在。例如，居间氨基酸序列可提供多核苷酸的或所翻译的肽的切割位点(例如酶识别序列)。另外，多核苷酸除编码本发明肽的编码序列以外还可包括任何额外的序列。例如，多核苷酸可以是包括表达肽所需要的调节序列的重组多核苷酸，或者可以是具有标志基因等等的表达载体(质粒)。一般而言，此类重组多核苷酸可通过常规重组技术操作多核苷酸来制备，例如通过使用聚合酶和内切核酸酶。重组和化学合成技术都可用来生成本发明的多核苷酸。例如，可以通过插入在转染入感受态细胞后能表达的适宜载体来生成多核苷酸。或者，可借助PCR技术或通过在合适宿主中的表达来扩增多核苷酸(参见例如Sambrook et al.，Molecular Cloning =A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York, 1989)。或者，可使用固相技术来合成多核苷酸，如Beaucage SL&Iyer RP，Tetrahedron 1992,48 :2223-311 ；Matthes et al.，EMBO J 1984,3 :801-5 中记载的。V.夕卜来体(exosomes)本发明进一步提供了称作外来体的细胞内囊泡，这些外来体在它们的表面上呈递本发明肽与HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过，例如在日本专利申请公表公报平11-510507和W099/03499中详细描述的方法来制备，并可以用从治疗和/或预防针对的患者获得的APC制备。本发明的外来体可以作为疫苗以与本发明的肽相似的方式进行预防接种。复合体中包含的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的HLA抗原类型匹配。例如，在日本人中，HLA-A24和HLA-A2，特别是HLA-AM02和HLA-A0201或 HLA-A0206是常见的，因此它们适合于日本人患者的治疗。使用在日本人和白种人中高表达的AM或A2型对获得有效的结果是有利的，而且亚型如AM02、A0201或A0206等也是有用的。通常，在临床上，预先对需要治疗的患者的HLA抗原类型进行检查，这样就能够合适地选择对特定抗原具有高水平的结合亲和性，或藉由抗原呈递具有CTL诱导能力的肽。而且， 为了获得具备高的结合亲和性和CTL诱导能力的肽，可以在天然存在型WDRPUH的部分肽的氨基酸序列的基础上进行1个、2个或数个氨基酸的替代、插入、删除和/或添加。当将AM型HLA抗原用于本发明的外来体时，可以使用具有选自SEQ IDNo -.1,2, 3，4，16和17的序列的肽。或者，当将A2型HLA抗原用于本发明的外来体时，可以使用具有 SEQ ID No :30，31，34，36，37，40，41，45，49，55，57 和 61 中任一序列的肽。VI.抗原呈递细胞(APC)本发明还提供在其表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物的分离的APC。APC可衍生自要进行治疗和/或预防的患者，而且可作为疫苗以它们自身或与其它药物(包括本发明的肽、外来体、或CTL)组合来施用。APC不限于特定种类的细胞，包括DC、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞，已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原，从而被淋巴细胞识别。由于DC是APC中具有最强CTL诱导作用的代表性APC，DC可用作本发明的APC。例如，可通过自外周血单核细胞诱导DC，然后在体外、离体或在体内用本发明的肽接触(刺激)它们来获得本发明的APC。短语“诱导APC”包括用本发明的肽或编码本发明肽的核苷酸接触(刺激)细胞，以在细胞的表面上呈递在HLA抗原与本发明肽之间形成的复合物。当对受试者施用本发明的肽时，在受试者的身体中诱导出呈递本发明肽的APC。因此，可以通过在对受试者施用本发明的肽后自受试者收集APC来获得本发明的APC。或者， 可以通过用本发明的肽接触自受试者收集的APC来获得本发明的APC。可以将本发明的APC施用于受试者以在受试者中以它们自身或与其它药物(包括本发明的肽、外来体或CTL)组合来诱导抗癌症免疫应答。例如，离体施用可包括下述步骤a:自第一受试者收集APC;b 用肽接触步骤a的APC ；并c 对第二受试者施用步骤b的加载了所述肽的APC。第一受试者和第二受试者可以是同一个体，或者可以是不同个体。通过步骤b获得的APC可作为疫苗施用来治疗和/或预防癌症，包括肝细胞癌。另外，本发明提供一种制备用于诱导抗原呈递细胞的药物组合物的方法或工艺，其中所述方法包括将本发明的肽与药学可接受的载体混合或配制的步骤。依照本发明的一个方面，APC具有高水平的CTL诱导能力。在术语“高水平的CTL 诱导能力”中，高水平是相对于未与肽接触或与不能诱导CTL的肽接触的APC所实现的该水平而言的。这样的具有高水平CTL诱导能力的APC可通过上文所述方法以及下述方法来制备，该方法包括在体外将含有本发明多核苷酸的基因转移至APC的步骤。所导入的基因可以是DNA或RNA的形式。用于进行导入的方法的例子包括但不具体限于本领域中常规实施的各种方法，诸如可使用脂质体转染、电穿孔、和磷酸钙法。更具体的说，可以如Cancer Res 1996,56 :5672-7 ；J Immunol 1998，161 :5607-13 ;J Exp Medl996，184 :465-72 ；国际公开文本No. 2000-509281的已
公开日文翻译中所述来实施。通过将基因转移入APC，基因在细胞中经历转录、翻译、等等，然后得到的蛋白质经由呈递途径被MHC I类或II类加工并呈递。VII.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)被诱导的针对任何本发明肽的CTL可在体内加强靶向癌细胞的免疫应答，并且因此可以以与肽本身相似的方式用作疫苗。因此，本发明还提供由任何本发明肽特异性诱导或活化的、分离的CTL。此类CTL可通过下述步骤来获得(1)对受试者施用本发明的肽，从该受试者收集 CTL ； (2)在体外用本发明的肽接触(刺激)受试者衍生的APC和CD8阳性细胞、或外周血单核白细胞，然后分离CTL ； (3)在体外用在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽的复合物的 APC或外来体接触CD8阳性细胞或外周血单个核白细胞，然后分离CTL;或向T细胞中导入编码与本发明肽结合的T细胞受体(TCR)亚单位多肽的基因。APC或外来体可通过上文所述方法来制备，而且方法(4)在下文“VIII. T细胞受体(TCR) ”一节下详述。可以从要治疗和/或预防的患者获得用呈递本发明肽的APC的刺激诱导的本发明CTL，而且可以将其单独施用，或者与其它药物(包括本发明的肽或外来体)组合施用以调节效果。所得到的CTL特异性针对呈递本发明的肽，例如与用于诱导的肽相同的肽的靶细胞起作用。靶细胞可以是内源表达WDRPUH的细胞，例如肝细胞癌，或被WDRPUH基因转染的细胞；而且因肽的刺激而在细胞表面上呈递本发明肽的细胞也可充当活化CTL攻击的靶标。VIII. T 细胞警体(TCR)本发明还提供含有编码能够形成T细胞受体(TCR)的亚单位的多肽的核酸的组合物，及使用该组合物的方法。所述TCR亚单位具有形成赋予T细胞针对呈递本发明特定肽的肿瘤细胞的特异性的TCR的能力。通过使用本领域已知的方法，可鉴定出TCR的α和β 链(其作为用本发明的一种或多种肽诱导的CTL的TCR亚单位)的核酸(W02007/032255 及 Morgan et al.，J Immunol, 171，3288 (2003))。例如，优选用 PCR 方法来分析 TCR。用于分析的PCR引物可以是例如但不限于作为 5'侧引物的 5' -R 引物(5' -gtctaccaggcattcgcttcat-3‘ ) (SEQ ID NO 65)和对TCRa 链 C 区特异性的 3_TRa_C 引物(5' -tcagctggaccacagccgcagcgt-3‘) (SEQ ID NO 66)，对TCR0 链 Cl 区特异性的 3-TRb-Cl 引物(5' -tcagaaatcctttctcttgac-3 ‘) (SEQID NO 67)或作为3 ‘ 侧引物的对TCR^链C2区特异性的3-TRbeta_C2引物 (5' -ctagcctctggaatcctttctctt-3‘ )(SEQ ID NO :68)。衍生的TCR在体内和在体外能以高亲合力结合展示WDRPUH肽的靶细胞，且任选介导对呈递WDRPUH肽的靶细胞的有效杀伤。可将编码TCR亚单位的核酸掺入合适载体，例如逆转录病毒载体。这些载体是本领域公知的。有用的是，可将核酸或含有它们的载体转移入T细胞，例如来自患者的T细胞。有利的是，本发明提供一种即配即用型(off-the-shelf)组合物，其容许快速修饰患者自己的T细胞(或其他哺乳动物的T细胞)以快速且容易地生成具有卓越的癌细胞杀伤特性的修饰型T细胞。特异性TCR是一种能够特异性识别本发明肽和HLA分子的复合物的受体，当TCR 在T细胞的表面上时，给予T细胞针对靶细胞的特异性活性。对上述复合物的特异性识别可通过任何已知方法来确认，而且优选的方法包括但不限于使用HLA分子和本发明肽的四聚物分析，及ELISP0T测定法。通过实施ELISP0T测定法，能确认在细胞表面上表达TCR的 T细胞通过TCR来识别细胞，而且信号在细胞内传输。当上文所述复合物存在于T细胞表面上时，该复合物可给予T细胞以细胞毒性活性的确认也可通过已知方法来进行。一种优选的方法包括例如测定针对HLA阳性靶细胞的细胞毒性活性，诸如铬释放测定法。还有，本发明提供通过用这样的核酸转导而制备的CTL，该核酸编码结合HLA-A2背景下的WDRPUH 肽(例如 SEQ ID No :1，2，3，4，16 和 17)及还有 HLA-A24 背景下的 SEQ ID No =30,31,34, 36，37，40，41，45，49，55，57和61的肽的TCR亚单位多肽。经过转导的CTL能够在体内归巢(homing)至癌细胞，而且能在体外通过公知培养方法来扩增(例如Kawakami et al., JImmunol. , 142, 3452-3461 (1989)) 0本发明的CTL可用于形成在需要治疗或防护的患者中治疗或预防癌症方面有用的免疫原性组合物(W02006/031221)。预防和防范包括降低来自疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防和防范可发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的发生，而二级和三级预防和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病进展和症状出现以及降低已建立的疾病的负面影响的活动，这通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来实现。或者，预防和防范包括广泛的预防疗法，它们旨在减轻特定病症的严重性，例如降低肿瘤的增殖和转移、降低血管发生。治疗和/或预防癌症，和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术清除癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和遏制癌症发生、肿瘤消退、及降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防降低患癌个体的死亡率并改善其预后，降低血液中肿瘤标志物的水平，及减轻伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构成有效治疗和/或预防，而且此类症状的减轻或改善包括10^,20^^30%或更多降低，或维持病情稳定。IX.药剂或药物组合物由于WDRPUH表达在肝细胞癌中与正常组织相比特异性升高(上调)(Silva et al. , Neoplasia 2005 Apr ；7 (4) :348-55)，本发明的肽或多核苷酸可用于治疗和/或预防癌症或肿瘤，和/或预防它们的手术后复发。因此，本发明提供用于治疗和/或预防癌症或肿瘤，和/或预防它们的手术后复发的药剂，其包括一种或多种本发明肽或多核苷酸作为活性组分。或者，可以在任何上述外来体或细胞诸如APC的表面上表达本发明的肽，以用作药剂或药物组合物。另外，上述靶向任何本发明的肽的CTL也可用作本发明药剂或药物组合物的活性组分。在另一个实施方案中，本发明还提供选自下组的活性组分在制备用于治疗或预防癌症或肿瘤的药物组合物或药剂中的用途(a)本发明的肽，(b)处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，(c)在其表面上呈递本发明肽的APC或外来体，和(d)本发明的 CTL。或者，本发明进一步提供用于治疗或预防癌症或肿瘤的选自下组的活性组分(a)本发明的肽，(b)处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，(c)在其表面上呈递本发明肽的APC或外来体，和(d)本发明的 CTL。或者，本发明进一步提供一种制备用于治疗或预防癌症或肿瘤的药物组合物或药剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括配制药学或生理学可接受载体与选自下组的活性组分作为活性组分的步骤(a)本发明的肽，(b)处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，(c)在其表面上呈递本发明肽的APC或外来体，和(d)本发明的 CTL。在另一个实施方案中，本发明还提供一种制备用于治疗或预防癌症或肿瘤的药物组合物或药剂的方法或工艺，其中该方法或工艺包括混合活性组分与药学或生理学可接受载体的步骤，其中所述活性组分选自下组(a)本发明的肽，(b)处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸，
17
(c)在其表面上呈递本发明肽的APC或外来体，和(d)本发明的 CTL。或者，本发明的药物组合物或药剂可用于防范癌症或肿瘤和/或预防其手术后复发。本发明的药剂或药物组合物可用作疫苗。在本发明的语境中，短语“疫苗”(也称作“免疫原性组合物”)指具有在接种入动物后诱导抗肿瘤免疫力的功能的物质。本发明的药剂或药物组合物可用于在受试者或患者(包括人和任何其它哺乳动物，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬、绵羊、山羊、猪、牛、马、猴、狒狒、和黑猩猩， 特别是商业上重要的动物或驯养的动物)中治疗和/或预防癌症或肿瘤，和/或预防其手术后复发。依照本发明，已经发现具有选自SEQ ID No :1，2，3，4，16，17，30，31，34，36，37，40，
41，45，49，55，57和61的氨基酸序列的肽是分别能诱导强且特异性免疫应答的HLA-AM或 HLA-A2限制表位肽或候选者。因此，包括任何这些具有SEQ ID No 1，2，3，4，16，17，30，31， 34，36，37，40，41，45，49，55，57和61的氨基酸序列的肽的本发明药剂或药物组合物特别适合于对其HLA抗原为HLA-AM或HLA-A2的受试者施用。尤其，含有具有SEQ ID No =1,2,3, 4，16和17的氨基酸序列的肽的制剂适合于HLA-AM类型的受试者施用，而含有具有SEQ ID No :30，31，34，36，37，40，41，45，49，55，57和61的氨基酸序列的肽的制剂适合于HLA-A2类型的受试者施用。这同样适用于含有编码任何这些肽的多核苷酸(即本发明的多核苷酸) 的药剂和组合物。要用本发明的药剂或药物组合物治疗的癌症或肿瘤不受限制，包括其中涉及 WDRPUH的所有种类的癌症或肿瘤，例如肝细胞癌。除上述活性组分之外，本发明的药剂或药物组合物还可含有其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽、编码所述其它肽的其它多核苷酸、呈递所述其它肽的其它细胞等等。在本文中，其它具有诱导针对癌性细胞的CTL的能力的肽以癌症特异性抗原(例如已鉴定的TAA)为例，但是不限于此。如果需要，本发明的药剂或药物组合物可任选包括其它治疗性物质作为活性组分，只要该物质不抑制活性组分例如任何本发明肽的抗肿瘤效果。例如，配制剂可包括抗炎剂、镇痛剂、化疗剂、诸如此类。除了在药物自身中包括其它治疗性物质之外，本发明的药物还可以与一种或多种其它药理学作用剂顺序或同时施用。药物和药理学作用剂的量取决于例如所使用的药理学作用剂的类型、所治疗的疾病、及施用的时序安排和路径。应当理解，除在本文中具体提及的组分之外，本发明的药剂或药物组合物可包括与所讨论的配制剂类型相关的本领域常规的其它制剂。在本发明的一个实施方案中，本发明的药剂或药物组合物可包括在制品和试剂盒中，该制品和试剂盒含有可用于治疗要治疗的疾病(例如癌症)的病理状况的材料。制品可包括任何本发明药剂的容器及标签。合适的容器包括瓶、管形瓶、和试管。容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器上的标签应指明该药剂或组合物用于治疗或预防一种或多种疾病状况。标签还可指明关于施用的指导等等。除上文描述的容器之外，包括本发明药剂或药物组合物的试剂盒还可任选进一步包括第二容器，其中装有药学可接受稀释剂。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器、和载有使用说明的包装插页。如果期望的话，药剂或药物组合物可存在于药包或分配器装置中，该药包或分配器装置可装有一个或多个含有活性组分的单位剂型。例如，药包可包括金属或塑料箔，诸如泡罩包。药包或分配器装置可附有施用说明书。(1)含有肽作为活性组分的药剂或药物组合物本发明的肽可以作为药剂或药物组合物直接施用，或者如果必要，通过常规配制方法来配制。在后一种情况中，除本发明的肽之外，还可以视情况包括通常用于药物的载体、赋形剂、等等，没有特别限制。此类载体的例子有灭菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养基、等等。另外，药剂或药物组合物可在必要时含有稳定剂、悬浮液、防腐剂、表面活性剂等等。本发明的药剂或药物组合物可用于抗癌目的。本发明的肽可制备成由两种或更多种本发明肽构成的组合以在体内诱导CTL。肽组合可采取鸡尾酒的形式，或者可使用标准技术彼此缀合。例如，可以将各个肽化学连接或表达成为单一融合多肽序列。组合中的各个肽可以是相同的或不同的。通过施用本发明的肽，肽被HLA抗原以高密度展示在APC上，然后诱导出与所展示的肽与HLA抗原之间形成的复合物特异性起反应的CTL。或者，可以给受试者施用这样的APC 它们在其细胞表面上展示任何本发明的肽，可以通过用本发明的肽刺激来源于受试者的APC(如DC)而获得；结果在受试者中诱导CTL，从而可提高针对癌细胞的攻击性。包括本发明的肽作为活性组分、用于治疗和/或预防癌症或肿瘤的药剂或药物组合物还可包括已知可有效建立细胞免疫的佐剂。或者，药剂或药物组合物可以与其它活性组分一起施用，或者通过配制成颗粒来施用。佐剂指在与具有免疫学活性的蛋白质一起 (或顺序)施用时增强针对该蛋白质的免疫应答的化合物。本文中涵盖的佐剂包括文献中记载的那些(Clin Microbiol Revl994，7 :277-89)。合适佐剂的例子包括但不限于磷酸铝、 氢氧化铝、明矾、霍乱毒素、沙门氏菌毒素、诸如此类。另外，可方便地使用脂质体配制剂、其中肽结合至几微米直径的珠子的颗粒配制剂、和其中脂质结合至肽的配制剂。在一些实施方案中，本发明的药剂或药物组合物可进一步包括引发(Prime)CTL 的成分。已经确认脂质是能够在体内引发针对病毒抗原的CTL的作用剂。例如，可将棕榈酸残基连接至赖氨酸残基的和α-氨基，然后连接至本发明的肽。然后脂化肽可以在胶束或颗粒中直接施用，掺入脂质体，或在佐剂中乳化。作为脂质引发CTL应答的另一个例子，大肠杆菌(E. coli)脂蛋白，诸如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，当与适宜的肽共价连接时，可用来引发CTL(参见例如Deres et al.，Nature 1989,342 :561-4)。施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，及系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。本发明肽的剂量可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当加以调整，通常是0. OOlmg 至lOOOmg，例如0. OOlmg至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每少数天施用一次至每少数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。(2)含有多核苷酸作为活性组分的药剂或药物组合物本发明的药剂或药物组合物也可含有处于可表达形式的编码本文中公开的肽的核酸。在本文中，短语“处于可表达形式的”意味着多核苷酸在导入细胞时会在体内表达成诱导抗肿瘤免疫力的多肽。在一个例示性的实施方案中，感兴趣的多核苷酸的核酸序列包括多核苷酸表达所必需的调节元件。多核苷酸可具有为实现稳定插入靶细胞的基因组所需的配置(关于同源重组盒载体的描述参见例如Thomas KR&Capecchi MR,Cell 1987,51 503-12)。参见例如 Wolff et al.，Science 1990，247 1465-8 ；美国专利 No. 5，580，859 ； 5，589，466 ；5，804，566 ；5，739，118 ；5，736，524 ；5，679，647 ；及 WO 98/04720。基于 DNA 的投递技术的例子包括“裸DNA”、易化(布比卡因、聚合物、肽介导的)投递、阳离子脂质复合物、和颗粒介导的(“基因枪”)或压力介导的投递(参见例如美国专利No. 5，922，687)。本发明的肽还可用病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括减毒病毒宿主， 诸如牛痘或禽痘。这种办法涉及使用例如牛痘病毒作为载体来表达编码肽的核苷酸序列。 在导入宿主后，重组牛痘病毒表达表达免疫原性肽，并由此引发免疫应答。可用于免疫接种方案的牛痘载体和方法记载于例如美国专利No. 4，722，848。另一种载体是卡介苗(BCG， Bacille Calmette Guerin)。BCG 载体记载于 Stover et al. , Nature 1991,351:456-60。 有很多种可用于治疗性施用或免疫接种的其它载体是显而易见的，例如腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、去毒炭疽毒素载体、诸如此类。参见例如Shata et al.，Mol Med Today 2000,6 :66-71 ；Shedlocket al.，J Leukoc Biol 2000,68 :793-806 ；Hipp et al.，In Vivo 2000，14 :571_85。将多核苷酸投递入受试者可以是直接的，其中受试者直接暴露于携带多核苷酸的载体，或者是间接的，其中首先在体外用感兴趣多核苷酸转化细胞，然后将细胞移植入受试者。这两种办法分别称作体内和离体基因疗法。关于基因疗法的方法的一般综述参见Goldspiel et al.，Clinical Pharmacyl993,12 :488-505 ；Wu 禾口 Wu，Biotherapy 1991,3 :87-95 ；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993,33 :573-96 ；Mulligan, Science 1993,260 :926-32 ； Morgan&Anderson,Ann Rev Biochem 1993,62 191-217 ；Trends in Biotechnology 1993, 11(5) :155-215。重组DNA技术领域普遍知道的也可用于本发明的方法记载于eds. Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, NY,1993 ；及 Krieger,Gene Transfer 禾口 Expression,ALaboratory Manual,Stockton Press, NY,1990。施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，而且可使用系统施用或局部施用至靶位点附近。施用可以通过单次施用来实施，或者通过多次施用来强化。可以依据要治疗的疾病、患者的年龄、重量、施用的方法等等恰当调整合适载体或经编码本发明肽的多核苷酸转化的细胞中的多核苷酸的剂量，而且通常是0. OOlmg至lOOOmg，例如0. OOlmg 至lOOOmg，例如0. Img至10mg，而且可以每数天施用一次至每数月施用一次。本领域技术人员能恰当选择合适的剂量。X.使用肽、外来体、APC和CTL的方法本发明的肽和多核苷酸可用于诱导APC和CTL。本发明的外来体和APC也可用于诱导CTL。肽、多核苷酸、外来体和APC可以与任何其它化合物组合使用，只要该化合物不抑制它们的CTL诱导能力。因此，任何前文所述的本发明药剂或药物组合物均可用于诱导 CTL，而且除它们之外，那些包括肽和多核苷酸的也可用于诱导APC，如下文讨论的。(1)诱导抗原呈递细胞(APC)的方法
技术领域：
本发明提供了使用本发明的肽或多核苷酸来诱导具有高CTL诱导能力的APC的方法。本发明的方法包括在体外、离体或在体内用本发明的肽接触APC的步骤。例如，离体用肽接触APC的方法可包括下述步骤a:自受试者收集APC;并b 用肽接触步骤a的APC。APC不限于特定种类的细胞，包括DC、Langerhans细胞、巨噬细胞、B细胞、和活化的T细胞，已知它们在它们的细胞表面上呈递蛋白质性质的抗原，从而被淋巴细胞识别。优选地，由于DC是APC中具有最强CTL诱导能力的，可使用DC。任何本发明肽可以以它们自身或与其它本发明肽组合使用。或者，可如下诱导APC，即对受试者施用本发明肽以使肽与APC在体内接触，并因此在受试者的身体中诱导具有高CTL诱导能力的APC。如此，本发明还涵盖为诱导APC而对受试者施用本发明的肽。作为另一种方法，可以以可表达形式对受试者施用本发明的多核苷酸以表达本发明的肽，并在体内使肽与APC接触。与使用本发明的肽类似，在受试者的身体中诱导具有高CTL诱导能力的APC。如此，本发明还涵盖为了诱导APC而对受试者施用本发明的多核苷酸。对于短语“可表达形式”的解释，见“IX.药剂( 含有多核苷酸作为活性组分的药剂”部分。另外，本发明还涵盖将本发明的多肽导入APC以诱导具有CTL诱导能力的APC。例如，所述方法可包括下述步骤a:自受试者收集APC;并b 将编码本发明肽的多核苷酸导入收集的APC。步骤b可如上文“VI.抗原呈递细胞”部分中所述来实施。(2)诱导CTL的方法另外，本发明提供了使用本发明的肽、多核苷酸、或外来体或APC来诱导CTL的方法。当本发明的肽、多核苷酸、APC、或外来体被施用给受试者后，受试者的身体中诱导出CTL以增强靶向癌细胞的免疫应答。如此，本发明的另一个目的是提供用于诱导CTL的方法，所述方法可包括对受试者施用本发明的肽、多核苷酸、APC或外来体的步骤。或者，也可离体诱导CTL，并在诱导后，可将活化的CTL返还受试者。例如，所述方法可包括下述步骤a:自受试者收集APC;b 用本发明的肽接触步骤a的APC ；并c 将步骤b的APC与⑶8阳性细胞共培养。上文步骤c中要与⑶8阳性细胞共培养的APC也可通过将编码本发明肽的多核苷酸转移入APC来制备，如上文“VI.抗原呈递细胞”部分所述；但是不限于此，而且任何在其表面上有效呈递HLA抗原和本发明肽的复合物的APC均可用于本发明的方法。此类APC也可使用在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽的复合物的外来体来代替。即，本发明用于诱导CTL的方法可包括共培养在其表面上呈递HLA抗原和本发明肽的复合物的外来体的步骤。此类外来体可通过上文“V.外来体”部分中描述的方法来制备。另外，可通过将编码与本发明的肽结合的TCR亚单位的多核苷酸导入⑶8阳性细胞来诱导CTL。此类转导可如上文“VIII. T细胞受体(TCR) ”部分中所述来实施。(3)诱导免疫应答的方法本发明进一步提供了用于在受试者中诱导抗癌症免疫应答的方法。所述方法包括施用本发明的疫苗，其包含(a) 一种或多种本发明肽，或其免疫学活性片段；(b) 一种或多种编码(a)的肽或免疫学活性片段的多核苷酸；(c) 一种或多种分离的本发明CTL ；或(d) 一种或多种分离的本发明抗原呈递细胞。在本发明中，过表达WDRPUH的癌症可用这些活性组分来治疗。因而，在施用包含活性组分的疫苗或药物组合物之前，优选确认要治疗的癌细胞或组织中的WDRPUH表达水平与相同器官的正常细胞相比增强了。如此，在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗过表达WDRPUH的癌症的方法，所述方法可包括下述步骤i)测定自具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中的WDRPUH表达水平；ii)比较WDRPUH表达水平与正常对照；并iii)对具有与正常对照相比过表达WDRPUH的癌症的受试者施用至少一种选自上文所述(a)至(d)的成分。或者，本发明还提供了包含至少一种选自上文所述(a)至(d)的成分的疫苗或药物组合物，其用于对具有过表达WDRPUH的癌症的受试者施用。换言之，本发明进一步提供了用于鉴定要用本发明WDRPUH多肽来治疗的受试者的方法，所述方法可包括测定源自受试者的癌细胞或组织中的WDRPUH表达水平的步骤，其中该水平与该基因的正常对照水平相比的升高指示该受试者具有可用本发明WDRPUH多肽来治疗的癌症。本发明的治疗癌症的方法将在下面更加详细的加以叙述。需用本方法治疗的患者优选为哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不仅限于，例如， 人类，非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马以及牛。根据本发明，测定在自受试者获得的癌细胞或组织中WDRPUH的表达水平。表达水平可在转录产物(核酸)水平确定，使用本领域熟知的方法。举例而言，可通过杂交方法 (例如，Northern杂交)使用探针来定量WDRPUH的mRNA。可在芯片或阵列上实施所述检测。对检测WDRPUH的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用WDRPUH的序列信息制备上述探针。举例而言，WDRPUH的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物来标记，所述标记物例如染料、荧光物质和同位素，且所述基因的表达水平可以作为发生了杂交的标签的强度检测。进一步，WDRPUH的转录产物(SEQ ID NO 63)可通过基于扩增的检测方法(例如， RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因的可用的序列信息来制备。具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、温和条件与低严格条件下与 TORPUH的mRNA杂交。如本文中所使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的， 在不同的环境下会不同。较长序列与较短序列相比在较高温度观察到特异杂交。一般地， 严格条件的温度应选择比特定序列在限定的离子强度和PH下的熔点(Tm)低大约5°C。Tm是(在限定的离子强度、PH和核酸浓度下)平衡状态下有50%的与靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm下，平衡时50%的探针被占据。典型地，严格条件是这样的其中盐浓度小于大约1. OM钠离子，典型地大约0. 01-1. OM钠离子 (或其它盐)，pH7. 0-8. 3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约 30°C，用于较长的探针或引物是至少大约60°C。严格条件也可以通过添加去稳定剂，例如甲酰胺，来实现。或者，可以检测翻译产物以进行本发明的诊断。例如，可以确定WDRPUH蛋白(SEQ ID NO 64)的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定法，此类方法使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，抗体的任何片段或修饰(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测，只要该片段或经修饰抗体保留对 TORPUH蛋白的结合能力即可。制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。作为另一种基于WDRPUH的翻译产物检测其基因的表达水平的方法，可利用针对 TORPUH蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察其染色的强度。意即，观察到强染色表明所述蛋白质存在量增加，且同时表明WDRPUH基因的高表达水平。对于包括WDRPUH基因在内的靶基因，如果其较之相应的靶基因的对照水平增加了例如10%，25%或50%的话，或增加到超过1. 1倍，超过1. 5倍，超过2. 0倍，超过5. 0倍， 超过10倍或者更多，则可以认为其在癌细胞中的表达水平增加了。对照水平可以与癌细胞同时确定，使用先前从疾病状态(患癌或未患癌)已知的受试者收集和保存的样品。另外，自具有要治疗的癌症的器官的非癌性区获得的正常细胞可用作正常对照。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的WDRPUH基因表达水平获得的结果加以确定。进一步，对照水平可以是来自先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中WDRPUH基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与受试者衍生样品组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中 TORPUH基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值+/-2S.D.或平均值+/-3S.D.的范围可以用作标准值。在本发明的语境下，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果对照水平从癌性生物样品确定，则称作“癌对照水平”。当WDRPUH基因的表达水平相比正常表达水平有所提高或与癌性对照水平相似， 则受试者可诊断为具有要治疗的癌症。本发明还提供了用于确定能用本发明WDRPUH多肽来治疗的患有癌症的受试者的试剂盒，其亦可用于评价和/或监测癌症疗法功效。优选地，所述癌症为肝细胞癌。更特别地，所述试剂盒优选包含至少一种在受试者衍生癌细胞中检测WDRPUH基因表达的试剂，所述试剂可选自下组(a)检测WDRPUH基因的mRNA的试剂；(b)检测TORPUH的蛋白质的试剂；(c)检测WDRPUH的蛋白质的生物学活性的试剂。
适于检测WDRPUH基因mRNA的试剂包括特异性结合或识别WDRPUHmRNA的核酸，诸如具有与WDRPUH mRNA的一部分互补的序列的寡核苷酸。这类寡核苷酸的例子有对WDRPUH mRNA为特异性的引物与探针。可基于本领域众所周知的方法制备这类寡核苷酸。如果需要，检测WDRPUHmRNA的试剂可固定化在固体基质上。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种检测WDRPUH mRNA的试剂。另一方面，适于检测WDRPUH蛋白质的试剂包括针对WDRPUH蛋白质的抗体。所述抗体可为单克隆的或多克隆的。进一步，任何所述抗体的片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、 Fab、F(ab，)2、Fv等等)均可用作所述试剂，只要所述片段或经修饰抗体保留与WDRPUH蛋白的结合能力。为检测蛋白制备此类抗体的方法在本领域是众所周知的，且可在本发明中使用任何方法制备上述抗体及其等价物。进一步，所述抗体可用能产生信号的分子通过直接连接或简介标记技术进行标记。标记物与标记抗体以及检测抗体与其靶的结合的方法在本领域是众所周知的，且本发明可使用任何标记物与方法。另外，在所述试剂盒中可包括多于一种用于检测WDRPUH蛋白质的试剂。所述试剂盒可包含多于一种前述的试剂。举例而言，从患有或没有癌症的受试者获取的组织样品可用作有用的对照试剂。本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业或用户角度而言期望的材料，包括缓冲液、稀释液、滤器、针头、注射器和带有使用说明书(例如， 书面的、磁带、CD-ROM等等)的装箱单。这些试剂之类的可标上标签包含在容器中。合适的容器包括瓶、管状瓶(vials)和试管。所述容器可用多种材料制造，例如玻璃或塑料。作为本发明的一个实施方案，当所述试剂是针对WDRPUH mRNA的探针时，所述试剂可固定化于固体基质上，例如多孔条，以形成至少一个检测位置。所述多孔条的测量或检测区域可包含多个位置，每个都包含核酸(探针)。测试条亦可包含阴性和/或阳性对照的位置。此外，对照位置可位于与测试条不同的条上。任选地，不同的检测位置可包含不同量的固定化核酸，即，在第一个检测位置上量较大而在后面的位置上量较小。在加入测试样品之后，显示可检测信号位置的数目提供了在样品中存在的WDRPUH mRNA量的定量指征。所述检测位置可设置成具有任何合适可检测的形状，通常是横跨测试条宽度的条状或点状。本发明所述试剂盒可进一步包括阳性对照样品或WDRPUH标准样品。本发明的所述阳性对照样品可通过收集WDRPUH阳性血液样品，随后分析其WDRPUH水平来制备。此夕卜， 可将纯化的WDRPUH蛋白或多核苷酸添加到不表达WDRPUH的细胞中以形成所述阳性样品， 或TORPUH标准品。在本发明中，纯化的WDRPUH可以是重组蛋白。例如，阳性对照样品的 WDRPUH水平大于截留值。提供下面的实施例来例示本发明及帮助本领域普通技术人员来制备和使用本发明。实施例并非意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例材料和方法细胞系AM淋巴母细胞样细胞系(AMLCL)通过借助Epstein-Bar病毒转化入HLA-AM阳性人B淋巴细胞而建立。T2 (HLA-A2)、C0S7、非洲绿猴肾细胞系均购自ATCC。WDRPUH衍生的肽的候选者的选择
24
使用结合预测软件“BIMAS“ (http//www-bimas. cit. nih. gov/molbio/hla_ bind)预测了 WDRPUH衍生的结合HLA_A*M02和HLA_A*0201分子的9聚物和10聚物肽(Parker et al. (J Immunol 1994,152(1) :163-75)， Kuzushima et al. (Blood 2001， 98(6) :1872-81))。由 Sigma(札幌，日本)或 Biosynthesis Inc. (Lewisville, TX)依照标准固相合成法合成了这些肽，并通过反相高效液相层析(HPLC)进行了纯化。分别通过分析性HPLC和质谱术分析测定了肽的纯度(> 90% )和身份。将肽以20mg/ml在二甲亚砜 (DMSO)中溶解，并保存于_80°C。体外CTL诱导使用单核细胞衍生树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞(APC)来诱导针对人白细胞抗原(HLA)上呈递的肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。如别处(Nakahara S et al.，Cancer Res 2003 Jul 15，63 (14) :4112-8)所述在体外生成 DC。具体而言，将用 Ficoll-Plaque (Pharmacia)溶液自正常志愿者(HLA_AM402 阳性和 HLA_A*0201 阳性)分离的外周血单个核细胞(PBMC)通过粘附至塑料组织培养皿(Becton Dickinson)来加以分离，以将它们作为单核细胞级分富集。在含有2%热灭活自体血清(AS)的AIM-V培养基 (Invitrogen)中在1000U/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) (R&D System)和 1000U/ml白介素(IL)-4 (R&D System)存在下培养富集了单核细胞的群体。培养7天后，将经细胞因子诱导的DC在AIM-V培养基中在3微克/ml β 2-微球蛋白存在下用20微克/ml 每一种合成肽于37°C冲激3小时。所生成的细胞表观上在它们的细胞表面上表达DC相关分子，诸如⑶80、⑶83、CD86和HLA II类(数据未显示)。然后将这些经肽冲激的DC用丝裂霉素C (MMC) (30微克/ml，30min)或X辐照 OOGy)灭活，并以1 20比例与用⑶8阳性分离试剂盒(Dynal)通过正选择获得的自体 ⑶8+T细胞混合。在48孔板(Corning)中设立这些培养物；每个孔在0. 5ml AIM_V/2%AS培养基中含有1. 5xl04个经肽冲激的DC、3xl05个CD8+T细胞和10ng/ml IL-7 (R&D System)。 3天后，给这些培养物补充IL-2 (CHIRON)至终浓度20IU/ml。在第7天和第14天，将T细胞用经肽冲激的自体DC进一步刺激。每次遵循与上文所述相同的步骤来制备DC。在第21 天在第三轮肽刺激后测试针对经肽冲激的A24LCL或T2细胞的CTL (Tanaka Het al.，Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1) :94-9 ；Umano Y et al.，Br J Cancer 2001 Apr20,84(8) 1052-7 ；Uchida N et al.，Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24) :8577-86 ；Suda T et al. , Cancer Sci 2006 May, 97 (5) :411-9 ；Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005 Aug, 96(8) :498-506)。CTL扩增规程使用与Riddell 等人(Walter EA et al.，N Engl J Med 1995 Oct 19,333(16) 1038-44 ；Riddell SR et al.，Nat Med 1996 Feb, 2 (2) :216-23)记载的方法相似的方法在培养中扩增CTL。将总共切104个CTL在25ml AIM_V/5% AS培养基中悬浮，其中有在 40ng/ml抗⑶3单克隆抗体(Pharmingen)存在下经丝裂霉素C灭活的两种人B-淋巴母细胞样细胞系。启动培养后一天，向培养物添加120IU/ml IL-2。在第5天、第8天和第11 天给培养物补加新鲜的含有30IU/ml IL-2的AIM-V/5% AS培养基(Tanaka H et al.，Br J Cancer 2001 Jan 5,84(1) :94-9 ；Umano Y et al.，Br J Cancer 2001 Apr 20,84(8) 1052-7 ；Uchida N et al.，ClinCancer Res 2004 Dec 15,10(24) :8577-86 ；Suda T et
25al. , Cancer Sci 2006 May, 97 (5) :411-9 ；Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005 Aug, 96(8) :498-506)。CTL克降的津立在96圆底微量滴定板(Nalge Nunc International)中进行稀释以获得0. 3、1和 3个CTL/孔。在总体积为150微升/孔的含5% AS的AIM-V培养基中，将CTL与IxlO4个细胞/孔的两种人B-淋巴母细胞样细胞系、30ng/ml的抗⑶3抗体，和125U/ml的IL-2 — 起培养。10天后向培养基中加入50微升/孔的IL-2以达到终浓度125U/ml的IL-2。在第14天测试CTL活性，并使用如上所述的相同方法扩增CTL克隆(Uchida N et al. ,Clin Cancer Res 2004 Dec 15,10(24) :8577-86 ；Suda T et al. , Cancer Sci 2006 May, 97 (5) 411-9 ；Watanabe T et al.，Cancer Sci2005 Aug,96(8) :498-506)。特异件CTL活件为了检查特异性CTL活性，实施了干扰素(IFN)-Y酶联免疫斑点(ELISP0T)测定法和IFN-Y酶联免疫吸附测定法(ELISA)。具体而言，制备经肽冲激的A24LCL (IxlO4/孔) 或T2 (IxlO4/孔)作为刺激细胞。使用48孔中培养的细胞作为应答细胞。依照制造商推荐的规程实施IFN- y ELISP0T测定法和IFN- y ELISA测定法。质粒转染通过PCR来扩增编码靶基因可读框、HLA-A24和HLA_A*0201的cDNA。将PCR扩增的靴基因产物和 HLA-A24 或 HLA-A*0201 克隆入 pIRES 载体(Clontech Laboratories, Inc.，Cat. No. 631605)。使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)依照制造商推荐的规程将质粒转染入C0S7( —种无靶基因和HLA-AM的细胞系)。自转染起2天后，用 Versene (Invitrogen)收获经转染细胞，并用作CTL活性测定法的靶细胞(5X104个细胞/ 孔)。结果TORPUH衍生的HLA-A24和HLA-A2结合肽的预测表1以最高结合亲和力的次序显示WDRPUH的HLA-AM结合肽。选择并检查了总共25种具有潜在HLA-AM结合能力的肽以确定表位肽(表1)。表2以最高结合亲和力的次序显示WDRPUH的HLA-A2结合9聚物和10聚物肽。选择并检查了总共37种具有潜在 HLA-A2结合能力的肽以确定表位肽(表2)。[表 1] 通过BIMAS预测的衍生自WDRPUH的HLA-AM结合性肽
权利要求
1.一种分离的结合HLA抗原且具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)诱导能力的肽，其中该肽由氨基酸序列SEQ ID NO :64组成或为其片段。
2.权利要求1的分离的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2。
3.权利要求1或2的分离的肽，其是九肽或十肽。
4.权利要求1至3任一项的分离的肽，其包含选自SEQID NO :2，1，3，4，16，17，30，31， 34，36，37，40，41，45，49，55，57 和 61 的氨基酸序列。
5.权利要求4的分离的肽，其由选自 SEQ ID NO :2，1，3，4，16，17，30，31，34，36，37，40， 41,45,49,55,57和61的氨基酸序列组成，其中替代、删除、插入和/或添加了 1个、2个或几个氨基酸。
6.权利要求5的肽，其由选自SEQID N0:l，2，3，4，16和17的氨基酸序列组成，其中当所述HLA抗原是HLA-A24时，所述肽具有下面的一项或两项特征(a)N端起的第二个氨基酸选自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，和(b)C端氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
7.权利要求5 的肽，其由选自 SEQ ID NO :30，31，34，36，37，40，41，45，49，55，57 和 61 的氨基酸序列组成，其中当所述HLA抗原是HLA-A2时，所述肽具有下面的一项或两项特征(a)N端起的第二个氨基酸选自亮氨酸和甲硫氨酸，和(b)C端氨基酸选自缬氨酸和亮氨酸。
8.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至7任一项的肽。
9.一种用于诱导CTL的作用剂，其中所述作用剂含有一种或多种权利要求1至7任一项的肽或者一种或多种权利要求8的多核苷酸。
10.一种用于治疗和/或预防癌症和/或防止其手术后复发的药剂，其中所述药剂包含一种或多种权利要求1至7任一项的肽或者一种或多种权利要求8的多核苷酸。
11.权利要求10的药剂，其配制为供施用给其HLA抗原为HLA-A24或HLA-A02的受试者ο
12.—种诱导具有CTL诱导能力的抗原呈递细胞(APC)的方法，其中所述方法包括选自如下的步骤(a)在体外、离体或在体内使APC与权利要求1至7任一项的肽接触；和(b)将编码权利要求1至7任一项的肽的多核苷酸导入APC。
13.一种用于诱导CTL的方法，其中所述方法包括选自如下的步骤(a)共培养⑶8阳性T细胞与APC，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至 7任一项的肽的复合物；(b)共培养CD8阳性T细胞与外来体，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与权利要求 1至7任一项的肽的复合物；和(c)向T细胞中导入编码与权利要求1至7任一项的肽结合的T细胞受体(TCR)亚单位多肽的多核苷酸。
14.一种分离的APC，其在其表面上呈递HLA抗原与权利要求1至7任一项的肽的复合物。
15.权利要求14的APC，其是通过权利要求12的方法被诱导的。
16.一种分离的CTL，其靶向权利要求1至7任一项的任何肽。
17.权利要求16的CTL，其是通过权利要求13的方法被诱导的。
18.一种诱导受试者中抗癌症免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施用包含权利要求1至7任一项的肽、其免疫学活性片段、或编码所述肽或所述片段的多核苷酸的作用剂的步骤。
全文摘要
本发明提供含有氨基酸序列SEQ ID NO1，2，3，4，16，17，30，31，34，36，37，40，41，45，49，55，57和61的肽，以及含有上述氨基酸序列且其中替代、删除、插入或添加了1个、2个、或几个氨基酸但仍具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽。本发明还提供用于治疗或预防肿瘤的药物，该药物含有这些肽。本发明的肽也可用作疫苗。
文档编号C07K7/06GK102307891SQ20098015619
公开日2012年1月4日 申请日期2009年12月3日 优先权日2008年12月5日
发明者吉村祥子, 大泽龙司, 渡边朝久, 角田卓也 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司