专利名称：利用三尖杉培养细胞生物合成松香烷二萜类化合物的方法
技术领域：
本发明涉及植物细胞培养技术，具体的说是一种诱导三尖杉液体悬浮培养细胞生物合成松香烷二萜类化合物的方法，同时产物中包括一个新的化合物。
背景技术：
松香烷二萜类化合物属于三环二萜类化合物，是一类重要的天然化合物。这类化合物之所以引起人们的研究兴趣主要是因为它们中的很多物质具有良好的活性，很多民间用药中含有这类物质。比如，本发明中的hinokioK化合物幻对金黄色葡萄球菌、链球菌、 大肠杆菌、绿脓杆菌等具有抑制作用，是很好的抗菌先导化合物。然而，目前这类化合物主要来源于从植物中提取，关于其化学合成的报道很少，且还处于实验室研究阶段。由于这类化合物在植物中的含量很低，获得困难，大大限制对其进一步的研究和应用。利用植物细胞培养技术生产生物活性物质因其环境友好、生产周期短、可控性强等优点日益受到人们的重视，成为天然活性物质的潜在来源。而目前人们遇到的主要问题是怎样调控植物的代谢途径进而获得预期的产物，像控制化学合成一样来控制生物合成。目前常见的调控方法主要是促进细胞中已经存在的次生代谢产物的生产，也就是提高其产率。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用三尖杉(C印halotaxus fortunei,Hook, f.)液体悬浮培养细胞，以诱导剂诱导和吸附剂吸附相结合的联合调控技术生物合成7种松香烷二萜类化合物，包括一个新的松香烷二萜化合物的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为将三尖杉细胞置于其常用培养基中培养，细胞接种量为50 150g/L湿重，在细胞指数生长初期，于每升培养基中同时加入浓度为10 2000 μ M的诱导剂和50 200g的吸附剂，所述诱导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子；继续培养7 14天后，分别收获细胞和吸附剂；第一次提取室温下，将真空抽滤后的吸附剂先用极性或中等极性有机溶剂提取 2 5次；合并提取液，过滤，旋转蒸干；第二次提取在蒸干的粗提物中加入低浓度的碱液以及等体积的非极性有机溶剂萃取，粗提物与低浓度的碱液质量体积比例Ig 3 15ml ；分离纯化萃取8 16小时后，将有机层分离出来，将有机层旋转蒸干，然后置于硅胶柱上分离，所用硅胶为200 300目硅胶，洗脱方式为梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液的体积为200-800ml，用样品瓶连续收集洗脱液，每个样品瓶收集5_15ml洗脱液，同时利用薄层色谱对样品瓶收集的洗脱液进行检测，当所用的洗脱液为环己烷-乙酸乙酯(8 Lv/ ν)时，分别得到化合物1和4的粗品；环己烷-乙酸乙酯(5 1,ν/ν)时，分别得到化合物 3和6的粗品；环己烷-乙酸乙酯O 1，ν/ν)时，分别得到化合物2、5和7的粗品。将这7个化合物的粗品分别置于凝胶柱上完成进一步的纯化，得到7个化合物的纯品。这7个化合物分别为化合 物 1 :3-hydroxy-2-isopropyl-6-methyl-5-(4-methyl-3-oxopentyl) naphthalene化合物2 :abieta-8,11，13-triene_3 β，12-diol化合物 3 12-hydroxyabieta~6,8,11，13-tetraene-3-one4 :abietatriene-3 β _ol化合物 5 :11，12-dihydroxy-8，11，13-abietatriene-3，7-dione化合物 6 11 -hydroxy-12~methoxyabieta~8,11，13-triene-3, 7-dione化合物 7 :3β , ll-dihydroxy-12-methoxyabieta-8,11，13-triene-7_one三尖杉培养细胞的常用培养基组成为，于MS基础培养基中添加终浓度为0. 1 2. 5mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸，0. 1 lmg/L激动素以及10 50g/L蔗糖，pH值为5. 4 6. 2 ；细胞指数生长初期是细胞接种于培养基后的第4 10天。三尖杉细胞的培养条件为旋转式摇床，转速80 150rpm，培养温度为20 300C，暗培养；培养周期为14 25天，每隔14 21天传代一次。非生物诱导剂为硝酸银、水杨酸、茉莉酸或茉莉酸甲酯；吸附剂为对萜类化合物具有较强的吸附能力并对细胞无毒的大孔吸附树脂，包括XAD-7HP，XAD-4，XAD-1600或 HP2MG。第一次提取时所用的极性或中等极性的有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯；每次提取过程中，吸附剂与有机溶剂质量体积比例Ig 3-15ml，每次提取先采用振荡提取30分钟 3小时，然后超声提取10 60分钟。第二次提取时所用的低浓度的碱液是指体积浓度为0. 1 的氨水、质量浓度为0. 05 0. 5%的氢氧化钠或质量浓度为0. 05 0. 5%的氢氧化钾；第二次提取时所用的非极性溶剂是指氯仿或二氯甲烷。硅胶柱的洗脱液组成依次为环己烷、环己烷-乙酸乙酯(60 10 1，ν/ν)、环己烷-乙酸乙酯(8 1，ν/ν)、环己烷-乙酸乙酯(5 1，ν/ν)、环己烷-乙酸乙酯(3 1， ν/ν)、环己烷-乙酸乙酯O 1，ν/ν)、环己烷-乙酸乙酯(1 1，ν/ν)、乙酸乙酯。凝胶柱的填料Skphadex LH-20 ；所用洗脱液为甲醇或体积比1 1的甲醇-二
氯甲烷。本发明方法原理通过添加诱导剂和吸附剂能够诱导三尖杉液体悬浮培养细胞合成松香烷二萜类化合物，其原理主要有以下三个方面1.诱导剂能够作为信号分子激活特定的代谢途径， 引发合成反应；2.吸附剂能够吸附产物，增加产物的储藏位点，消除反馈抑制，同时可防止产物的降解。3.两者必须联合使用，可能是由于产物对细胞有毒性作用，使得如果只使用诱导剂而不加吸附剂，虽然能诱发反应，但产物刚刚积累即对细胞产生抑制作用，被细胞降解，不能得到产物。本发明具有如下优点1.联合应用诱导剂诱导和吸附剂吸附来诱导三尖杉液体悬浮培养细胞合成松香烷二萜类化合物，实现了该类化合物的人为可控生产还未见报道，目前这类化合物主要来源于植物的提取。2.本发明中得到了一个新的松香烷二萜化合物。3.本发明中产物完全被吸附在吸附剂中，易于分离纯化，降低了成本，为进一步工业化生产提供了很大的可能性。4.本发明中的细胞培养条件可以保证细胞的快速生长并保证良好的均一性。5.本发明中利用低浓度碱液除去杂质，大大提高了纯化效率。文献中记录的三尖杉所含的天然产物主要是生物碱，而松香烷二萜类化合物还未见报道。经过对三尖杉的叶、茎以及未经过诱导的液体悬浮培养细胞进行HPLC的分析，均未检测到本发明中的七个化合物。三尖杉属为一属9种，目前，在三尖杉属植物中仅在日本粗榧中分离得到过松香烷二萜，而在其它8种中还未见报道。本发明的特点在于，在诱导前的三尖杉液体悬浮培养细胞中未检测到本发明中的产物，而诱导后的三尖杉培养细胞合成了 7种松香烷二萜类化合物，包括一个新的松香烷二萜化合物。说明本发明是一种利用三尖杉液体悬浮培养细胞生物合成松香烷二萜类化合物的有效方法。
具体实施例方式实施例1(1)三尖杉细胞的培养采用三尖杉液体悬浮培养细胞本发明中的细胞株最初由三尖杉(C. fortunei)幼茎诱导的愈伤组织悬浮培养而来，采用Murashige-Skoog(MS)培养基，添加浓度为^ig/L 2,4- 二氯苯氧基乙酸，0. lmg/L 激动素以及30g/L蔗糖，培养基pH值为5. 8。将过滤得到的7. 5克湿细胞接种到含有IOOml 上述培养基的500ml摇瓶中，然后置于旋转式摇床上培养，转速为100rpm，25°C，暗培养。(2)松香烷二萜的联合诱导合成于细胞生长的第7天向培养基中添加茉莉酸甲酯(MJA)(培养基中的终浓度为 300 μ M/L)和XAD-7HP树脂(100g/L)，继续培养至第14天，分别收获细胞和XAD-7HP，经测定，产物完全被吸附在XAD-7HP中，细胞中未检测到产物。(3)松香烷二萜类化合物的提取、纯化和结构鉴定室温下将真空抽滤后的吸附剂300g先用甲醇提取3次，每次提取所用甲醇的体积为0. 9L，每次提取包括振荡提取1小时，然后超声提取30分钟。然后合并三次的甲醇提取液，过滤，旋转蒸干。在蒸干的甲醇提取物中加入0. 5% (ν/ν)氨水2L以及等体积的二氯甲烷。萃取12小时后，将二氯甲烷层分离出来并旋转蒸干，然后置于硅胶柱上分离，所用硅胶为200 300目硅胶，洗脱方式为梯度洗脱。硅胶柱的洗脱液组成依次为环己烷(300ml)、 环己烷-乙酸乙酯(50 1，v/v，500ml)、环己烷-乙酸乙酯(30 1，v/v，300ml)、环己烷-乙酸乙酯OO 1，v/v，300ml)、环己烷-乙酸乙酯(10 1，v/v，500ml)、环己烷-乙酸乙酯(8 1，v/v，400ml)、环己烷-乙酸乙酯(5 1，v/v，400ml)、环己烷-乙酸乙酯 (3 l，v/v，400ml)、环己烷-乙酸乙酯(2 1，v/v，600ml)、环己烷-乙酸乙酯(1 Lv/ν, 300ml)、乙酸乙酯(300ml)。用样品瓶连续收集洗脱液，每个样品瓶收集IOml洗脱液，同时利用薄层色谱进行检测，当所用的洗脱液为环己烷-乙酸乙酯(8 l,v/v)时，分别得到化合物1和4的粗品；环己烷-乙酸乙酯(5:1，ν/ν)时，分别得到化合物3和6的粗品； 环己烷-乙酸乙酯O 1，ν/ν)时，分别得到化合物2、5和7的粗品。将这7个化合物的粗品分别置于填料为LH-20的凝胶柱上完成进一步的纯化，所用洗脱液为甲醇或体积比1 1 的甲醇-二氯甲烷，得到7个化合物的纯品，其中化合物1 (3. 8mg)，化合物2 (10. 4mg)，化合物3 (14. 2mg)，化合物4 (6. 5mg)，化合物5 (200mg)，化合物6 (4mg)，化合物7 (12. 8mg)，经过
波谱分析，化合物1为新的化合物，七个化合物的结构确定如下
OH 16 12 1权利要求
1.利用三尖杉培养细胞生物合成松香烷二萜类化合物的方法，其特征在于将三尖杉细胞置于其常用培养基中培养，细胞接种量为50 150g/L湿重，在细胞指数生长初期，于每升培养基中同时加入终浓度为10 2000 μ M的诱导剂和50 200g的吸附剂，所述诱导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子；继续培养7 14天后，分别收获细胞和吸附剂；第一次提取室温下，将真空抽滤后的吸附剂先用极性或中等极性有机溶剂提取2 5 次；合并提取液，过滤，旋转蒸干；第二次提取在蒸干的粗提物中加入低浓度的碱液以及等体积的非极性有机溶剂萃取，粗提物与低浓度的碱液质量体积比例Ig 3 15ml ；分离纯化萃取8 16小时后，将有机层分离出来，将有机层旋转蒸干，然后置于硅胶柱上分离，所用硅胶为200 300目硅胶，洗脱方式为梯度洗脱，每个梯度所用洗脱液的体积为200-800ml，用样品瓶连续收集洗脱液，每个样品瓶收集5_15ml洗脱液，同时利用薄层色谱对样品瓶收集的洗脱液进行检测，当所用的洗脱液为环己烷-乙酸乙酯(8 1, ν/ν) 时，分别得到化合物1和4的粗品；环己烷-乙酸乙酯(5 1, ν/ν)时，分别得到化合物3 和6的粗品；环己烷-乙酸乙酯O 1，ν/ν)时，分别得到化合物2、5和7的粗品；将这7 个化合物的粗品分别置于凝胶柱上完成进一步的纯化，得到7个化合物的纯品；这7个化合物分别为 化合物1 3-hydroxy-2-isopropyl-6-methyl-5-(4-methyl-3-oxopentyl) naphthalene化合物 2 :abieta-8，11，13_triene_3 β，12-diol化合物 3 :12-hydroxyabieta-6,8,11，13-tetraene-3-one化合物 4 :abietatriene-3 β -ol化合物 5:11，12-dihydroxy-8,11，13_abietatriene_3，7-dione 化合物 6 ll-hydroxy-12-methoxyabieta-8,11，13-triene-3, 7-dione 化合物 7 :3 β，ll-dihydroxy-12-methoxyabieta-8,11，13_triene-7_one
2.按照权利要求1所述方法，其特征在于所述三尖杉培养细胞的常用培养基组成为， 于MS基础培养基中添加终浓度为0. 1 2. 5mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸，0. 1 lmg/L激动素以及10 50g/L蔗糖，pH值为5. 4 6. 2 ；所述细胞指数生长初期是细胞接种于培养基后的第4 10天。
3.按照权利要求1所述方法，其特征在于所述三尖杉细胞的培养条件为旋转式摇床，转速80 150rpm，培养温度为20 30°C，暗培养；培养周期为14 25天，每隔14 21天传代一次。
4.按照权利要求1所述方法，其特征在于所述非生物诱导剂为硝酸银、水杨酸、茉莉酸或茉莉酸甲酯；所述吸附剂为对萜类化合物具有较强的吸附能力并对细胞无毒的大孔吸附树脂，包括 XAD-7HP, XAD-4, XAD-1600 或 HP2MG。
5.按照权利要求1所述方法，其特征在于所述第一次提取时所用的极性或中等极性的有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯；每次提取过程中，吸附剂与有机溶剂质量体积比例Ig 3-15ml，每次提取先采用振荡提取30分钟 3小时，然后超声提取10 60分钟。
6.按照权利要求1所述方法，其特征在于所述第二次提取时所用的低浓度的碱液是指体积浓度为0. 1 的氨水、质量浓度为0. 05 0. 5%的氢氧化钠或质量浓度为 0. 05 0. 5%的氢氧化钾；所述第二次提取时所用的非极性溶剂是指氯仿或二氯甲烷。
7.按照权利要求1所述方法，其特征在于所述硅胶柱的洗脱液梯度组成依次为环己烷、环己烷-乙酸乙酯(60 10 1，ν/ν)、环己烷-乙酸乙酯(8 1，ν/ν)、环己烷-乙酸乙酯(5 1，ν/ν)、环己烷-乙酸乙酯(3 1，ν/ν)、环己烷-乙酸乙酯O 1，ν/ν)、环己烷-乙酸乙酯(1 1，ν/ν)、乙酸乙酯。
8.按照权利要求1所述方法，其特征在于所述凝胶柱的填料为kphadexTMLH-20；所用洗脱液为甲醇或体积比11的甲醇-二氯甲烷。
全文摘要
本发明涉及植物细胞培养技术，具体的说是一种利用三尖杉液体悬浮培养细胞生物合成松香烷二萜类化合物的方法。将三尖杉细胞置于其常用培养基中培养，细胞接种量为50～150g/L湿重，在细胞指数生长初期，于每升培养基中同时加入终浓度为10～2000μM的诱导剂和50～200g的吸附剂，所述诱导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子。本发明为生物合成方法，方法稳定，环境友好；产物完全被吸附到吸附剂上，大大简化了分离纯化的操作流程，不仅降低了成本，而且易于实现工业化生产。同时，本发明合成了包括一个新的化合物在内的7个松香烷二萜类化合物。松香烷二萜类化合物具有良好的生物活性，是一类重要的先导化合物，该技术具有重要的商业应用前景。
文档编号C07C35/42GK102295545SQ201010206950
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月23日 优先权日2010年6月23日
发明者张卫, 徐晓辉 申请人:中国科学院大连化学物理研究所