专利名称：特异性结合vcam-1并抑制白细胞与内皮细胞之间粘附和变移的人重组单克隆抗体的制作方法
特异性结合VCAM-1并抑制白細胞与内皮細胞之间粘附和变移的人重组单克隆抗体
技术领域：
本发明涉及特异性结合人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)以抑制白細胞与活化的内皮細胞之间粘附和白細胞通过活化的内皮细胞变移的人重组单克隆抗体；和含有该人重组单克隆抗体的炎性疾病或癌症的预防性和治疗性组合物。
背景技木在从血流迁移至组织的过程中，包括白細胞在内的免疫細胞经过活化的内皮細胞从而引起免疫应答，并且许多細胞粘附分子(CAM)，如整联蛋白、选择蛋白、ICAM(胞内粘附分子)和VCAM(血管細胞粘附分子)，涉及白細胞与内皮細胞的粘附及其向组织的迁移。细胞粘附分子在功能上被分为涉及白細胞与内皮細胞相互作用的选择蛋白、涉及白細胞与内皮細胞粘附的整联蛋白和免疫球蛋白如ICAM和VCAM。这些细胞粘附分子在很多生理反应如免疫应答、炎症和血栓形成中发挥重要作用。VCAM-I是血管内皮細胞粘附分子其中之一，其与在大多数白細胞——不包括嗜中性粒細胞——的表面上表达的整联蛋白(VLA-4)发生相互作用。VCAM-I通过炎性信号而被表达，并引起白細胞粘附于血管内皮細胞，和随后白細胞跨内皮迁移至受损组织中。尽管近年来关注于VCAM-1-VLA-4的相互作用，但VCAM-I中和抗体的发展还未被积极地研究。虽然M/K-2. 7——抗小鼠VCAM-I的单克隆抗体——在近期已被开发，并在胶原蛋白引起的关节炎小鼠模型中显示出对关节炎的抑制效果，但该抗体仅对小鼠模型具有特异性，因此应对该抗体的可用性进ー步测试以用于临床应用。进一歩，VCAM-I由7个IgG样结构域組成，并且其结构域1和4实质上參与与其配体整联蛋白(α4β1 或 α 4β 7)的结合(1995，PNAS，92 :ρ5714 ;1995，The journal of immunology,155 :p3135 %=)。在这方面，迫切需要开发如下完全人单克隆抗体其抑制VCAM-I抗原与整联蛋白的相互作用从而有效抑制白細胞向内皮細胞的粘附和变移，并使免疫原性的危险最小化。
发明内容技术问题因此，本发明人已开发人VCAM-I特异性人重组单克隆抗体，其具有人源性重链 (VH)和轻链(VL)结构域，其中该人重组单克隆抗体特异性识别人内皮細胞表面上表达的 VCAM-1，并结合VCAM-I抗原的结构域1或2，以显示抑制U397前单核细胞白细胞与活化的内皮細胞之间的相互作用的强活性，从而实现本发明。技术方案本发明的ー个目的是提供特异性结合人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)以抑制白細胞与活化的内皮細胞之间粘附和白細胞通过活化的内皮细胞变移的人重组单克隆抗体。本发明的另ー个目的是给出提供炎性疾病、心血管疾病或癌症的诊断信息的方法，包括如下步骤检测人重组单克隆抗体与疑患炎性疾病或癌症的对象的生物样本中的 VCAM-I之间的抗原-抗体反应。本发明的又ー个目的是提供利用人重组单克隆抗体抑制白細胞与活化的内皮细胞之间粘附和白細胞通过活化的内皮细胞变移的方法。本发明的又ー个目的是提供用于炎性疾病、心血管疾病或癌症的诊断性組合物， 其含有人重组单克隆抗体。本发明的又ー个目的是提供用于炎性疾病、心血管疾病或癌症的预防性或治疗性組合物，其含有人重组单克隆抗体和药学可接受的载体。本发明的又ー个目的是提供用于治疗炎性疾病、心血管疾病或癌症的方法，包括如下步骤给予用于炎性疾病或癌症的预防性或治疗性组合物。有利效果根据本发明所述的人重组单克隆抗体对人内皮細胞上表达的VCAM-I显示强亲和力，并有效抑制VCAM-I介导的白細胞与活化的内皮細胞之间粘附和白細胞通过活化的内皮细胞变移，从而被用于预防和治疗炎性疾病，如哮喘和关节炎、移植排斥、心血管疾病和附图描述
图1显示根据本发明一个实施方式所述的人重组单克隆抗体可变区的氨基酸序列；图2是ELISA (酶联免疫吸附试验)的結果，显示抗原特异性抗VCAM-I人单克隆抗体对抗原——根据其人VCAM-I结构域——的亲和力，其中VD2表示重组人VCAM-I结构域D1-D2/FC嵌合体，VD4表示重组人VCAM-I结构域D11_D44/Fc嵌合体，VD7表示重组人 VCAM-I结构域Dl-D7/Fc嵌合体；图3显示人VCAM-I抗原特异性抗VCAM-I人单克隆抗体对抗原的结合能力或亲和力，其中抗原-抗体亲和カ通过1 1结合模式、利用BIAC0RE仪(BIACORE AB，Sweden)测定，从而计算抗原-抗体亲和カ常数，KD值；图4是分析抗VCAM-I人单克隆抗体对纯化的人重组VCAM-I抗原与人白細胞之间粘附的抑制活性的結果，其中其抑制活性通过相比于非抗体治疗组荧光強度的降低被确定；图5是分析抗VCAM-I人单克隆抗体对人白細胞与TNF- α (肿瘤坏死因子-α )活化的人内皮細胞之间粘附的抑制活性的結果，其中其抑制活性通过相比于非抗体治疗组荧光強度的降低被确定；图6是分析抗VCAM-I人单克隆抗体对人白細胞通过TNF- α (肿瘤坏死因子-α ) 活化的人内皮细胞变移的抑制活性的結果，其中其抑制活性通过相比于非抗体治疗组变移白細胞量的减少被測定；图7是根据本发明ー个实施方式分析对I h0A(RaS同源基因家族，成员A)活性的抑制活性的结果；图8是根据本发明ー个实施方式分析对ROS (活性氧物质)活性的抑制活性的结果；图9是根据本发明ー个实施方式分析内化的结果；
图10显示根据本发明一个实施方式的人重组单克隆抗体的重链和⑶R序列；图11显示根据本发明一个实施方式的人重组单克隆抗体的轻链和⑶R序列；图12显示根据本发明一个实施方式的动物实验的概括；图13是根据本发明ー个实施方式所述通过体外粘附试验分析VCAM-IAb对炎性细胞粘附的抑制效应的結果，其中(A)显示结合的单核細胞的数量图，(B)显示代表性照片；图14是根据本发明ー个实施方式所述通过体外变移试验分析VCAM-IAb对炎性细胞变移的抑制效应的結果，其中(A)显示4hrs后变移細胞的数量图，(B)显示IShrs后变移細胞的数量图；图15是根据本发明ー个实施方式所述测试VCAM-lAb(7HT)的体内结合能力的 en face共焦显微镜结果((A)PBS, (B)高剂量对照Ab，(C)低剂量VCAM-lAb，(D)高剂量 VCAM-IAb)；图16是根据本发明ー个实施方式測量小鼠体重和供食消耗变化的结果；图17是根据本发明ー个实施方式的小鼠血液的血液学分析结果((A)总胆固醇水平(T-CHO)、HDL-胆固醇水平(HDL-C)和LDL-胆固醇水平(LDL-C ； (B)甘油三酯水平(TG) 和葡萄糖水平(GLU) ； (C)谷氨酸草酰乙酸转氨酶水平(GOT)和谷氨酸丙酮酸转氨酶水平 (GPT) ； (D)白蛋白水平(ALB))；图18是根据本发明ー个实施方式測量主动脉弓动脉粥样硬化斑块形成及其大小的結果；图19是显示根据本发明一个实施方式所述En face法分析动脉中形成的动脉粥样硬化斑块的结果的图；图20是显示根据本发明一个实施方式所述En face法分析动脉中形成的动脉粥样硬化斑块的结果的图；图21是根据本发明ー个实施方式所述通过H&E染色对肝脏切片进行病理分析从而测试VCAM-I抗体注射的毒性的结果；图22是根据本发明ー个实施方式所述通过H&E染色对肾脏切片进行病理分析从而测试VCAM-I抗体注射的毒性的结果；和图23是根据本发明ー个实施方式所述通过H&E染色对脾脏切片进行病理分析从而测试VCAM-I抗体注射的毒性的結果。最佳实施方式下文中，将參考实施例对本发明进行详细描述。但是，提供下列实施例仅以示例本发明为目的，因此其不意为限制本发明。在实现上述目的的一方面中，本发明涉及人重组单克隆抗体，其特征在于其特异性结合人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)，从而抑制白細胞与活化的内皮細胞之间的粘附和白細胞通过活化的内皮细胞变移。提供以下术语描述是为了更好地理解说明书，并且提供本文所用的术语仅以示例为目的，并不意为本发明受限于这些术语。应当注意的是，如本说明书和所附权利要求书中所用，除非上下文另外明确表示，単数物体意为包括多个对象。如本文所用，“抗体”包括參考对特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，并包括多克隆和单克隆抗体。该术语还包括基因工程改造的形式，如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)和杂结合抗体(例如，双特异性抗体)。术语“抗体”还包括抗体的抗原结合形式，包括具有抗原结合能力的片段(例如， Fab，、F(ab，)2、Fab、Fv和rlgG)。该术语还指重组单链Fv片段(scFv)。术语抗体还包括ニ价或双特异性分子、双抗体、三抗体和四抗体。ニ价和双特异性分子被述及干，例如， Kostelny 等(1992，J. Immunol. 148 15467)、Pack 禾ロ Pluckthun (1992，Biochemistry 31 1579)、Hollinger 等(1993，supra)、Gruber 等(1994，J. Immunol. :5368)、Zhu 等(1997， Protein Sci. 6 :781)、Hu等(1996,Cancer Res. 56 :3055)、Adams等(1993,Cancer Res. 53 4026)和 McCartney 等(I995，Protein Eng. 8 :301)。此外，本文所用的术语“单克隆抗体”，指已得自基本相同的抗体克隆的抗体分子， 其对于特异表位显示单一的结合特异性和亲和力。一般，免疫球蛋白具有重链和轻链。每条重链和轻链包含恒定区和可变区(该区域也被称为“结构域”)。轻链和重链可变区包含三个高变区，称为“互补决定区”(下文中被称为“⑶R”)和四个“框架”区。⑶R主要负责结合抗原表位。各链的⑶R—般被称为 ⑶R1、⑶R2和⑶R3，从N端开始依次编号，并且还一般通过特定⑶R所在的链确定。如本文所用，术语“人源化抗体”是得自人免疫球蛋白的分子，并意为构成抗体的全部氨基酸序列——包括互补决定区和框架区——由人免疫球蛋白組成。术语“人重组单克隆抗体”指单分子組成的抗体分子，得自人免疫球蛋白。人源化抗体用于人类治疗一般具有至少三个潜在的优势。第一，其可与人免疫系统更好地进行相互作用，例如，从而通过补体依赖性細胞毒性(CDC)或抗体依赖性細胞毒性(ADCC)更有效地消灭目标細胞。第二，人免疫系统不识别抗体作为外源的。第三，在人体循环中的半衰期将类似于天然存在的人抗体，允许给予较小剂量或较低频率的用药。因此，根据本发明所述的人单克隆抗体对人内皮細胞上表达的VCAM-I显示强亲和力，并有效抑制白細胞粘附于表达VCAM-I的活化内皮細胞。此外，由于其重链和轻链结构域均得自人細胞以显示低免疫原性，根据本发明所述的人单克隆抗体可用于治疗炎性疾病或癌症，该炎性疾病可选自肿瘤坏死因子-α (TNF-α)介导的疾病、肠道疾病、动脉硬化和心肌梗塞， 并优选选自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、关节强直性脊椎炎、脓毒症、内毒素休克、血流动カ休克、脓毒症综合征、缺血再灌注损伤、疟疾感染、分枝杆菌感染、脑膜炎、银屑病、充血性心脏衰竭、纤维化疾病、Kachexie、移植排斥、癌症、自身免疫性疾病、AIDS相关的机会性感染、关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风、关节強直性痛风、克罗恩病、溃疡性膀胱三角炎、多发性硬化症、麻风结节性红斑(ENL)、辐射损伤和高氧引起的肺泡损伤。根据本发明的优选实施方式，本发明的人重组单克隆抗体可含有重链可变区，该重链可变区包含⑶Rl，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 2 ；⑶R2，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 3 ； 和⑶R3，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 4。同吋，本发明的人重组单克隆抗体可通过如下制备使已知治疗性抗体的框架区(FR)连接于互补决定区(CDR)。更优选地，本发明的人重组单克隆抗体可以是包含SEQ ID NO. 1限定的重链氨基酸序列的人重组单克隆抗体(參见图1)。进一歩，根据本发明的优选实施方式，本发明的人重组单克隆抗体可含有轻链可变区，该轻链可变区包含⑶町，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 6 ；⑶R2，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 7 ；和氨基酸序列SEQ ID N0. 8。同吋，本发明的人重组单克隆抗体可通过如下制备使已知治疗性抗体的框架区(FR)连接于互补决定区(CDR)。更优选地，本发明的人重组单克隆抗体可以是包含SEQ ID NO. 5限定的轻链氨基酸序列的人重组单克隆抗体(參见图1)。更优选地，本发明的人重组单克隆抗体可以是包含所有轻链和重链可变区的人单克隆抗体。也就是说，本发明的人重组单克隆抗体可包括重链可变区——其包含SEQ ID NO. 2限定的重链CDRl ；SEQ ID NO. 3限定的重链CDR2 ；和SEQ ID NO. 4限定的重链CDR3—— 和轻链可变区——其包含SEQ ID NO. 6限定的轻链⑶Rl ；SEQ ID NO. 7限定的轻链⑶R2 ； 和SEQ ID NO. 8限定的轻链⑶R3。同吋，本发明的人重组单克隆抗体可通过如下制备使已知治疗性抗体的框架区(FR)连接于互补决定区(CDR)。最优选地，本发明的人重组单克隆抗体可以是包含SEQ ID NO. 1限定的重链氨基酸序列和SEQ ID NO. 5限定的轻链氨基酸序列的人重组单克隆抗体(參见图1)。此外，根据本发明的优选实施方式，本发明的人重组单克隆抗体可含有重链可变区，该重链可变区包含⑶Rl，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 10 ；⑶R2，具有氨基酸序列SEQ ID NO. 11 ；和⑶R3，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 12。同吋，本发明的人重组单克隆抗体可通过如下制备使已知治疗性抗体的框架区(FR)连接于互补决定区(CDR)。更优选地，本发明的人重组单克隆抗体可以是包含SEQ ID N0. 9限定的重链氨基酸序列的人重组单克隆抗体 (參见图10)。进一歩，根据本发明的优选实施方式，本发明的人重组单克隆抗体可含有轻链可变区，该轻链可变区包含⑶R1，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 14 ；⑶R2，具有氨基酸序列SEQ ID N0. 15 ；和氨基酸序列SEQ ID N0. 16。同吋，本发明的人重组单克隆抗体可通过如下制备使已知治疗性抗体的框架区(FR)连接于互补决定区(CDR)。更优选地，本发明的人重组单克隆抗体可以是包含SEQ ID N0. 13限定的轻链氨基酸序列的人重组单克隆抗体(參见图11)。更优选地，本发明的人重组单克隆抗体可以是包含所有轻链和重链可变区的人单克隆抗体。也就是说，本发明的人重组单克隆抗体可含有重链可变区——其包含SEQ ID NO. 10限定的重链CDRl ；SEQ ID NO. 11限定的重链CDR2 ；和SEQ ID NO. 12限定的重链 ⑶R3——和轻链可变区——其包含SEQ ID N0. 14限定的轻链⑶Rl ；SEQ ID N0. 15限定的轻链⑶R2;和SEQ ID N0. 16限定的轻链⑶R3。同吋，本发明的人重组单克隆抗体可通过如下制备使已知治疗性抗体的框架区(FR)连接于互补决定区(CDR)。最优选地，本发明的人重组单克隆抗体可以是包含SEQ ID N0. 9限定的重链氨基酸序列和SEQ ID N0. 13限定的轻链氨基酸序列的人重组单克隆抗体(參见图11)。在这方面，人重组单克隆抗体提供对人VCAM-I的亲和力，根据ー个优选的实施方式，人重组单克隆抗体与人VCAM-I抗原的缔合/解离常数(KD值)可以是0.1 X KTi3M至 7. 0 X IO-9M,其可通过利用BIAC0RE分析測定各抗体与人VCAM-I抗原的缔合/解离常数(KD 值)而得到。也就是说，人VCAM-I抗原作为配体被固定于传感器芯片(传感器芯片CM5， BIAC0RE, BR-1003-99)，然后各抗体稀释液利用BIAC0RE仪被施加于固定的配体，以引起抗原与抗体的缔合和解离，从而测定缔合(Ka)/解离(Kd)常数KD值和卡方△ (x2)值—— 即与可信度相关的统计学值。本发明的人重组单克隆抗体可通过用于生成单克隆抗体的公知方法容易地生成。 例如，制备单克隆抗体的方法可通过利用得自免疫动物的B白細胞生成杂交瘤(Koeher andMilstein, 1976, Nature, 256 :495)或利用噬菌体展示法进行，但不限于此。利用噬菌体展示的抗体库是以直接得自B淋巴細胞的抗体基因在噬菌体表面表达抗体的方法，而无需制备杂交瘤。与通过B细胞无限増殖化生成单克隆抗体相关的很多困难可通过噬菌体展示法克服。常规的噬菌体展示包括1)将具有随机序列的寡核苷酸插入相应于噬菌体衣壳蛋白pill(或pIV)N端的区域；幻表达天然衣壳蛋白和所述具有随机序列的寡核苷酸编码的多肽的融合蛋白；3)处理可结合于所述寡核苷酸编码的多肽的受体物质；4)利用低pH 或具有结合竞争力的分子洗脱结合于受体的肽-噬菌体颗粒ホ)扩增宿主細胞中通过淘选洗脱的噬菌体；6)重复所述步骤以得到所需量的噬菌体；和7)由通过淘选而选择的噬菌体克隆的DNA测序确定活性肽的序列。在优选的实施方式中，本发明的人重组单克隆抗体的制备方法可通过噬菌体展示法进行。本发明所属领域技术人员通过參考公知的噬菌体展示技术可容易地进行上述步骤，所述公知噬菌体展示技术公开于，例如，Barbas等(METHODS :A Companion to Methods in Enzymology 2 :119,1991 and J. Virol.2001 Jul ；75(14) :6692-9)和 Winter 等(Ann. Rev. Immunol. 12 :433,1994)。可用于构建抗体库的噬菌体可以是丝状噬菌体，例如，fd、 M13、Π、IfU Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pfl和Pf3，但不限于此。同样，可用于异源基因在丝状噬菌体表面表达的载体可以是噬菌体载体，如fUSE5、fAFFl、fd-CATl或fdtetDOG ；或噬菌粒载体,如pHEm、pComb3、pComb8或pSEX，但不限于此。进一歩，辅助噬菌体，其可用于提供成功再感染重组噬菌体所需的天然衣壳蛋白， 可由Mi;3K07或VSCM13示例，但不限于此。在本发明的具体实施例中，对人VCAM-I具有特异性的人抗体通过噬菌体展示技术被作为scFv获得，并作为单噬菌体克隆筛选得到，从而获得对人VCAM-I具有特异性的20 种单克隆噬菌体。在本发明的具体实施例中，检查通过重组技术获得的VCAM-I的分子量和纯度，然后用于制备单克隆抗体。VCAM-I与来自具有多祥性的人天然scFv库细胞的库噬菌体发生反应，然后淘选和筛选牢固结合VCAM-I抗原的单克隆抗体(參见表1)。所选单克隆抗体通过指纹分析得到确认，然后经测序确定抗体VH和VL的⑶R区。通过NCBI网站(http:// www, ncbi. nlm. nih. Rov/iRblast/)的IgBLAST程序检查上述抗体与种系抗体组之间的同源性。因此，得到20种对VCAM-I具有特异性的噬菌体抗体。进一歩，根据本发明的具体实施例，构建表达载体，该表达载体包含编码所选20 种人抗体噬菌体的重链和轻链的多核苷酸或其片段，具有免疫活性。在构建表达载体吋，表达调控元件如启动子、终止子和增强子；靶向膜或分泌的序列可结合目的被适当地选择和联合应用，其取决于意图生成人抗体轻链和重链或其片段的宿主細胞。本发明的表达载体包括质粒载体、粘粒载体、细菌噬菌体载体、病毒载体或类似物，但不限于此。适当的表达载体包括靶向膜或分泌的信号序列或前导序列以及表达调控元件如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号和增强子，并可取决于其目的以多种形式构建。进一歩，根据本发明一个实施方式，本发明提供鉴定结合人重组单克隆抗体的人 VCAM-I抗原结构域位置的方法。已报告VCAM-I由7个IgG样结构域組成，并且其结构域1和4实质上參与与其配体——整联蛋白(α4β1或α4β7)——的结合。因此，为确定对于根据本发明所述的人重组单克隆抗体来说具有特异性的VCAM-I抗原表位，在具体实施例中进行下列程序。本发明人在表达和纯化人VCAM-I抗原的各结构域(VD2、VD4、VD7)后通过ELISA 分析了 20种抗体的抗原结合区。因此，抗原结合区取决于抗体类型而不同，其中，获得结合结构域1或2的抗体Η6和7ΗΤ (參见图2)。进一歩，根据本发明所述的人重组单克隆抗体提供了对人VCAM-I抗原的亲和力。 在本发明的具体实施例中，抗体与人VCAM-I抗原的缔合/解离常数(KD值)通过BIAC0RE 分析被測定，从而确定亲和力。发现抗体Η6和7ΗΤ对人VCAM-I具有强亲和力(參见图3)。 因此，发现Η6抗体对人VCAM-I抗原具有优越的结合能力，达约0. 6ηΜ的水平，并且7ΗΤ抗体对人VCAM-I抗原具有结合能力，达约6. 3ηΜ的水平。因此，根据本发明所述的人重组单克隆抗体可用于检测VCAM-I的組合物和方法， 包括如下步骤检测人重组单克隆抗体与生物样本中的VCAM-I之间的抗原-抗体反应。进一歩，在本发明的具体实施例中，发现根据本发明所述的人重组单克隆抗体(Η6)抑制人白細胞(U937細胞)与用重组人VCAM-I或人TNF-α刺激的人内皮細胞 (HUVEC)之间的粘附，因为白细胞与活化的内皮細胞之间的相互作用由VCAM-I介导。根据本发明的一个实施方式，用不同浓度的抗体处理人VCAM-I固定的固体支撑板或HUVEC单层板。为检查抗体是否抑制荧光标记的U937細胞和抗原的结合，測量荧光强度。結果，抗体显示对于粘附的抑制活性。特别是，发现抗体即使在低浓度下也呈现强抑制活性(參见图 4 禾ロ 5)。此外，在本发明中，确定在人白細胞(U937細胞)与人TNF-a刺激的人内皮細胞 (HUVEC)之间的相互作用中，根据本发明所述的人重组单克隆抗体抑制人白细胞进入人内皮细胞单层的渗透性，因为白细胞与活化的内皮細胞之间的相互作用由VCAM-I介导。在本发明的实施例中，用抗体处理在跨孔板(transwell plate)铺的HUVEC单层，然后通过计数跨孔底部收集的U937細胞来确定HUVEC单层的U937细胞渗透性。結果，上述抗体对于渗透性显示出强抑制活性(參见图6)。进一歩，确定在用VCAM-I抗体(7HT)处理表达VCAM-I的小鼠的动脉内皮細胞吋， 炎性細胞的粘附和变移被有效抑制。其后，还确定在将抗体腹膜内注射到高脂肪饮食喂养的小鼠中吋，VCAM-I抗体(7HT)特异性结合动脉内皮細胞(图11)。为检查VCAM-I抗体 (7HT)对心血管疾病的治疗效果，将ApoE-/-小鼠分为四組。第1组给予PBS，并以正常饮食喂养一周两次；第2组给予对照抗体，4BT(10mg/kg)，并以高脂肪饮食喂养一周两次；第 3组给予VCAM-I抗体，7HT (低剂量lmg/kg)，并以高脂肪饮食喂养一周两次；以及第4组给予VCAM-I抗体，7HT (高剂量10mg/kg)，并以高脂肪饮食喂养一周两次，进行12周。然后， 对主动脉损伤实施en-face技术以分析动脉硬化，发现第4组的动脉硬化相比于第2组显著减轻(图17和18)。此外，随后制备和分析冷冻心脏切片以观察主动脉弓中形成的动脉硬化。結果，发现第3和4组的动脉硬化减轻(图19至21)。通过血液学分析，确定该结果并非归因于胆固醇代谢/排泄(图15)。实验期间体重和消耗的饲料量没有明显差异(图 14)。实验后，进行毒性测试以检查抗体的肝脏毒性(图15)。经确定VCAM-I抗体(7HT)抑制VCAM-I的功能，导致动脉硬化缓解。
因此，由于本发明的人重组单克隆抗体对人内皮細胞上表达的VCAM-I具有强亲和力，其可用于需要VCAM-I抗原识别的任何应用。特別是，其有效抑制白細胞至活化内皮細胞的粘附和变移，从而提供有效的对于VCAM-I介导的疾病如炎性疾病、心血管疾病和癌症的诊断和治疗方法。因此，根据另ー个实施方式，本发明给出了提供炎性疾病、心血管疾病或癌症的诊断信息的方法，包括如下步骤检测人重组单克隆抗体与疑患炎性疾病或癌症的对象的生物样本中的VCAM-I之间的抗原-抗体反应；和用于炎性疾病、心血管疾病或癌症的诊断性組合物。也就是说，含有特异性结合人VCAM-I的单克隆抗体的诊断性組合物可用于诊断 VCAM-I表达相关的疾病或VCAM-I介导的疾病，例如，炎性疾病、心血管疾病或癌症。炎性疾病可选自肿瘤坏死因子-a (TNF- α )介导的疾病和肠道疾病，但不限于此。优选地，肿瘤坏死因子_α (TNF-α)介导的疾病可选自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、关节强直性脊椎炎、脓毒症、内毒素休克、血流动カ休克、脓毒症综合征、缺血再灌注损伤、疟疾感染、分枝杆菌感染、脑膜炎、银屑病、充血性心脏衰竭、纤维化疾病、Kachexie、移植排斥、自身免疫性疾病、AIDS相关的机会性感染、关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风、关节強直性痛风、 克罗恩病、溃疡性膀胱三角炎、多发性硬化症、麻风结节性红斑(ENL)、辐射损伤和高氧引起的肺泡损伤。进一歩，心血管疾病可选自心肌梗塞、心脏病发作、中风、心率失常、高血压、高血脂和动脉硬化。进一歩，癌症可选自脑瘤和脊髄瘤、头部和颈部癌症、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、间皮瘤、食管癌、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖細胞肿瘤、卵巢癌、子宫颈癌、子宮内膜癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多发性骨髄瘤、肉瘤、恶性黑素瘤和皮肤癌。进一歩，诊断性組合物可包含根据本发明所述的人重组单克隆抗体。如本文所用，术语“生物样本”可以是组织、細胞、全血、血清、血浆液、组织解剖样本(脑、皮肤、淋巴结、脊髄)、細胞培养物上清液、破碎的真核生物細胞和細菌表达系统，但不限于此。通过使经处理或未经处理的生物样本与本发明抗体发生反应，可检测VCAM-I或 VCAM-I相关疾病的存在。如本文所用，术语“抗原-抗体复合物”指样本中的VCAM-I抗原与识别抗原的本发明单克隆抗体的組合物质。这种抗原-抗体复合物的形成可通过选自如下的任意方法检测比色法、电化学方法、荧光法、发光法、颗粒计数法、目测评估和闪烁计数法。但是，该方法不限于上述实例，并且具有多种应用。在本发明中，多种标记可用于检测抗原-抗体复合物。其具体实例可选自酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒和放射性同位素，但不限于此。适合用作标记的物质实例包括乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β -D-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶和β -内酰胺酶，作为酶；荧光素、Eu3+、Eu3+螯合物和穴状化合物，作为荧光剂；生物素衍生物，作为配体；吖啶酷、异氨基苯ニ酰胼衍生物，作为发光剂；胶体金、有色乳胶，作为微粒；和57Co、3H、125I、125I-Bonton Hunter试剂，作为放射性同位素。优选地，通过利用酶联免疫吸附试验(ELISA)可检测抗原-抗体复合物。ELISA技术包括直接ELISA，其利用识别粘附于支撑体的抗原的标记抗体；间接ELISA，其利用标记的第二抗体，该标记的第二抗体识别抗原-抗体复合物的捕获抗体，其中抗原粘附于支撑体；直接夹心ELISA，其利用另ー种标记的抗体，该标记的抗体识别粘附于支撑体的抗原-抗体复合物的抗原；和间接夹心ELISA，其利用另ー种标记的第二抗体，该标记的第二抗体在与识别粘附于支撑体的抗原-抗体复合物的抗原的抗体反应后识别抗体。单克隆抗体可具有可检测的标记，否则可通过处理可捕获单克隆抗体并具有可检测标记的另ー种抗体来检测抗原-抗体复合物。本发明的人重组单克隆抗体，其特异性结合人VCAM-1，可単独或与常规的载体一起以药物組合物的形式用于预防和治疗炎性疾病、心血管疾病或癌症。因此，在还有另一个实施方式中，本发明提供了炎性疾病、心血管疾病或癌症的预防性或治疗性组合物，包含人重组单克隆抗体和药学可接受的载体；和治疗炎性疾病、心血管疾病或癌症的方法，包括向对象给予所述組合物的步骤。如本文所用，术语“对象”包括马、狗、猫、猪、山羊、兔、仓鼠、猴、豚鼠、大鼠、小鼠、
蜥蜴、蛇、绵羊、牛、鱼和鸟，并且意为任何动物(例如，人)。如本文所用，术语“预防”意为通过给予含有根据本发明所述的人重组单克隆抗体和药学可接受的载体的組合物来使疾病的出现受限或延缓的所有行为。如本文所用，术语“治疗”意为通过给予含有根据本发明所述的人重组单克隆抗体和药学可接受的载体的組合物来使疾病转好或有益地改变的所有行为。本发明的人重组单克隆抗体也可与其他抗体、生物活性剂或生物活性物质联合应用，以用于多种用途。例如，本发明的人重组单克隆抗体可在以内皮中VCAM-I表达为特征的疾病的治疗中与其他抗VCAM-I抗体联合应用。或者，本发明的人重组单克隆抗体可与识别炎性事件中所确定的其他内皮细胞受体(例如，ELAMU ICAMl等)的抗体和已知的炎性疾病治疗药物联合应用。炎性疾病可选自肿瘤坏死因子-a (TNF- α )介导的疾病和肠道疾病，但不限于此。优选地，肿瘤坏死因子-a (TNF-α)介导的疾病可选自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、关节强直性脊椎炎、脓毒症、内毒素休克、血流动カ休克、脓毒症综合征、缺血再灌注损伤、疟疾感染、分枝杆菌感染、脑膜炎、银屑病、充血性心脏衰竭、纤维化疾病、Kachexie、移植排斥、自身免疫性疾病、AIDS相关的机会性感染、关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风、关节強直性痛风、 克罗恩病、溃疡性膀胱三角炎、多发性硬化症、麻风结节性红斑(ENL)、辐射损伤和高氧引起的肺泡损伤。进一歩，心血管疾病可选自心肌梗塞、心脏病发作、中风、心率失常、高血压、高血脂和动脉硬化。进一歩，癌症可选自脑瘤和脊髄瘤、头部和颈部癌症、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、间皮瘤、食管癌、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖細胞肿瘤、卵巢癌、子宫颈癌、子宮内膜癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多发性骨髄瘤、肉瘤、恶性黑素瘤和皮肤癌。含有本发明的人重组单克隆抗体的組合物可以以药学上有效的量以单剂或多剂给予。在此方面，組合物可以以溶液、粉末、气溶胶、胶囊、肠溶片剂或胶囊或栓剂形式给予。 多种给予方式被考虑，包括腹膜内、静脉内、肌内、皮下、皮内、ロ服、局部、鼻内、肺内和直肠内，但本发明不限于这些示例性给予方式。但是，由于肽在ロ服给予时被分解，ロ服给予的組合物的活性成分应被包被或配制成以防止在胃中降解。此外，药物组合物可利用某种能够将活性成分输送至目标细胞中的设备给予。含有本发明的人重组单克隆抗体的組合物可以药学有效量被给予。“药学有效量” 指在可适用于医疗或预防的合理利益/危险比下足以预防或治疗疾病的量。有效剂量水平可根据如下确定疾病的严重程度；药物活性；患者的年齢、重量、健康状况和性別；患者的药物敏感性；给予时间、途径和释放速率；治疗持续时间；或包括与本发明组合物混合或同时施用的药物的因素或其他医学领域公知的因素。此外，含有本发明单克隆抗体的組合物可単独或联合其他治疗剂给予，或者也可以相继或同时的方式与常规的治疗剂一起给予。在以药学有效量给予本发明药物组合物的情况下，本发明的人重组单克隆抗体， 其对VCAM-I具有强亲和力，特异性结合内皮細胞上表达的VCAM-I并导致VCAM-I被中和。 最终，本发明的人重组单克隆抗体抑制白細胞与白細胞粘附和白細胞通过内皮细胞变移， 从而治疗炎性疾病、心血管疾病和癌症。炎性疾病可选自肿瘤坏死因子-α (TNF-α)介导的疾病和肠道疾病，但不限于此。优选地，肿瘤坏死因子-a (TNF-a)介导的疾病可选自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、关节强直性脊椎炎、脓毒症、内毒素休克、血流动カ休克、脓毒症综合征、缺血再灌注损伤、疟疾感染、分枝杆菌感染、脑膜炎、银屑病、充血性心脏衰竭、纤维化疾病、Kachexie、移植排斥、自身免疫性疾病、AIDS相关的机会性感染、关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风、关节強直性痛风、克罗恩病、溃疡性膀胱三角炎、多发性硬化症、麻风结节性红斑 (ENL)、辐射损伤和高氧引起的肺泡损伤。进一歩，心血管疾病可选自心肌梗塞、心脏病发作、中风、心率失常、高血压、高血脂和动脉硬化。进一歩，癌症可选自脑瘤和脊髄瘤、头部和颈部癌症、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、间皮瘤、食管癌、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖細胞肿瘤、卵巢癌、子宫颈癌、子宮内膜癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多发性骨髄瘤、肉瘤、恶性黑素瘤和皮肤癌。进一歩，根据又一方面，本发明提供了利用根据本发明所述的人重组单克隆抗体抑制白細胞与活化的内皮細胞粘附和白細胞通过活化的内皮细胞变移的方法。也就是说，VCAM-I结合炎症和免疫排斥中活化的白細胞上表达的VLA-4(非常晩期的抗原-4)和 α4β1整联蛋白，并在促进内皮細胞与白細胞——包括单核細胞和T細胞——的相互作用中具有关键作用。根据本发明所述的单克隆抗体特异性结合VCAM-1，从而抑制白細胞与活化的内皮細胞之间的粘附和白細胞通过活化的内皮细胞变移。本文引用了多个出版物，在此将其全部内容引入作为參考。通过常规的实验，本领域技术人员将知道或理解，本文考虑多种等同的实施方式。因此这种等同方式被意为包括在权利要求中。发明方式下文中，将參考实施例更详细地描述本发明。但是，提供下列实施例仅为示例本发明的目的，因此其不意为本发明受限于此。1.制备人和小鼠的VCAM-I抗原1. 1.克隆人 VCAM-I
包含人VCAM-I 基因的质粒(hMU012650) (Kugi # IRAU_75_G02)购自 KUGI (Korean UniGene ^formation)，由韩国生物科学与生物技术研究所(KRIBB)人类基因组功能分析中心提供。该质粒用作模板DNA，并且为了仅表达VCAM-I的D1-D2结构域和D1-D4结构域， 对于 VCAM-I 的 D1-D2 结构域各基因用正向引物(5，-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTTAAAATCGAGACC ACCCC-3，)和反向引物(5，-TAGCGGCCGACGCGGCCAATTGCAATTCTTTTACAGCCTG-3，)扩增，对于 VCAM-I 的 D1-D4 结构域各基因用正向引物(5，-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTTAAAATCGAGACCACCC C-3，)和反向引物(5，-TAGCGGCCGACGCGGCCAAGAGCTCCACCTGGATTCCCT-3')扩增。在 sfil 处理后，用连接酶分别将基因克隆到pI602-Fc载体和仅pI602-His载体(通过KRIBB构建的载体)中。在下列PCR条件下得到PCR产物对于50 μ 1的总反应体积，IOOng模板在 94°C下反应2min，然后在94°C下反应30sec，在55°C下反应30sec，和在72°C下反应Imin和 30sec(Dl-D4)和45sec (D1-D2)，进行30个循环，然后在72°C下反应lOmin。此外，检查克隆的 pYK602-FC-VCAM-l-Dl-D2、pYK602-His-VCAM-l-Dl-D2, pYK602-FC-VCAM-l-Dl-D4 和 pYK602-His-VCAM-l-Dl-D4 载体的碱基序列。1. 2.表达和纯化VCAM-I蛋白质在多种蛋白质中，包含hVCAM-Fc-嵌合体(R&D系统，cat# :862_VC)和mVCAM-l_Fc 嵌合体(R&D系统，Cat# :643-VM)的整个分子是商业采购的，并如下进行具有各VCAM-I结构域的片段的表达和纯化。首先，将5Χ1(^93Ε細胞在10个150mm直径板中铺平板，并在第二天， 用 PEI Q3966 =Polysciences, Inc, USA)处理克隆的 pYK602-VCAM-l-Dl_D2 载体和 PYK602-VCAM-1-D1-D4载体各20 μ g，以进行转染。第二天，将培养基更换为无血清DMEM，然后每隔一天收集上清液，然后在10% SDS-PAGE凝胶中进行电泳并进行蛋白质印迹以分析表达水平。将上清液-其中 hVCAM-l-Dl-D2-Fc 和 hVCAM-l-Dl-D4_Fc 的表达被确定-
收集，并用0. 22μπι Top-过滤器(Millipore, Cat# =SCGP T05 RE)过滤，得到足量的蛋白质。在使用前如下纯化蛋白质。首先，用PBS洗涤Econo-柱(Bio-Rad Cat. No 737-1006， 1 X5cm)，装填500 μ 1蛋白质A(Amersham Cat. No. 17-1279-30)。在进行装填的过程中，将 10ml PBS (pH 7. 4)施加于柱以洗涤小珠，并施加30ml的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7. 0)作为结合缓冲液。随后，用蠕动泵(Bio-Rad Cat. No. 73ト8142)以0. 5ml/min的流速对其施加得到的上清液。结合至柱后，用PBS以aiil/min的流速将其洗涤lhr，然后进行洗脱。用 500 μ 1 0. IM甘氨酸-HCl (pH 2. 5)进行洗脱，并添加1/10体积的IM Tris-HCl (pH 9. 0)以进行中和。在6个洗脱馏分中，蛋白质主要在#1和#2馏分中被洗出。将这两馏分置于10Κ 透析膜，然后在4L PBS中进行ο/η透析。上述过程均在4°C冷室中进行。定量后，将产物等分并储存于_70°C下。纯化后，在10% SDS-PAGE凝胶上确定产物。得到hVCAM-l-Dl-D2_Fc
和 hVCAM-l-Dl-D4-Fc，其量分别为 2. 8mg禾Π 800 μ g。将上清液-其中 hVCAM-l-Dl-D2_his
和hVCAM-l-Dl-D4-his 的表达被确定——收集，用 0. 22 μ m iTop-过滤器(Millipore，Cat# SCGP T05 RE)过滤，并用实验室规模 TFF 系统(LabScale TFF System) (Millipore, Cat# XX42LSS11)的 pellicon XL 膜(Millipore, 8K, cat# :ΡΧΒ0 08A 50)浓缩至 1/10 体积。将 10倍体积的IMAC缓冲液(300mM KCl、50mM KH2P04、5mM咪唑，pH 8.0)加至该浓缩液，并用 IMAC缓冲液更换。根据制造商的说明，用ftOfiniaTM蛋白质纯化系统(Bio-Rad)的生物规模的微型试验 IMAC 盒(Bio-kle Mini profinity IMAC cartridge) (cat# :732-4610) 以lml/min的速率进行纯化。将洗脱液在4°C下利用膜(10K，132574 :SPECTRAP0R, USA) 在4LPBS溶液中透析4hr或更长，然后再在4L预先冷却的PBS溶液中透析过夜。ο/η透折后，将所得物转移至e-管，并通过Bradford法測定蛋白质浓度。因此，得到400 μ g hVCAM-l-Dl-D4-his 和 hVCAM-l-Dl-D2_Fc 蛋白，并在 10% SDS-PAGE 凝胶中进行检查。2.构建库噬菌体将具有多祥性的2. 7X 101°人scFv库细胞在包含50 μ g/ml氨苄青霉素和2%葡萄糖的SB培养基(30g細菌用胰蛋白胨、20g酵母提取物、IOg MOPS, pH 7.0)中于37°C下培养2-;3hrS (0D600 = 0. 5)。然后，用VCSM13辅助噬菌体感染该細胞，接着在包含70 μ g/ ml卡那霉素(kanamycin)和ImM IPTG的培养基中于30°C下培养16hrs。对细胞进行离心 (4500rpm, 15min, 4°C )，并得到上清液，该上清液被溶于补充4% PEG 6000和3% NaCl的溶液中，然后在冰中反应lhr。再次离心反应物(8000rpm，20min，4°C )。将小球溶于PBS，再次离心(12000rpm，10min,4°C )。由此，得到包含库噬菌体的上清液，该上清液被转移至新管中，并储存于4°C。3.通过噬菌体展示进行生物淘选当由7个IgG样结构域組成的VCAM-I结合其配体α 4β1整联蛋白(α 4 β 1整联蛋白)吋，已知其结构域1和4充当结合基序。因此，利用人VCAM-l-Dl-D4(hVCAM-l-Dl-D4) 和整个VCAM-I分子进行淘选。在此实施例中，将对hVCAM-l-Dl-D4的淘选方法和结果进行
fejdio3. 1.对 hVCAM-l-Dl-D2 和 hVCAM-l_Dl_D4 抗原的生物淘选首先将涂有10 μ g/ml人重组VACM-I (R&D系统，809-VR)抗原的免疫吸附管 (Nunc 470319)用脱脂乳/PBS封闭，并与制备的库噬菌体(1 XlO12Cfu) —起在室温下培养 Ι-airs。用TBST (0. 05% )将该管洗涤三次。将结合的噬菌体用Iml新制的IOOmM三乙胺溶液在室温下洗脱lOmin。将洗脱的噬菌体用IM Tris (pH 7.4)中和，并感染进大肠杆菌 (E. coli) (ER2537)，和在37°C下培养lhr。将被感染的大肠杆菌在包含2%葡萄糖和氨苄青霉素的LB-琼脂糖培养基板(直径15cm)上铺平板，并在37°C下培养16hr。将培养的大肠杆菌分散在5mL SB中，并将其50ml接种在20ml SB-氨苄青霉素-葡萄糖中，得到包含根据<1.构建库噬菌体〉的方法所述的结合噬菌体的溶液，然后用于下轮淘选。对于第1轮淘选后的第2-4轮淘选，免疫吸附管分别涂有hVCAM-l-Dl-D2和hVCAM_l_Dl_D4抗原中每一种，并进行每一轮淘选(參见表1)。表1hVCAM-1-Dl-D 和 hVCAM-l_Dl_D4 抗原的淘选结果
权利要求
1.人重组单克隆抗体，其特异性结合人血管細胞粘附分子-I(VCAM-I)以抑制白細胞与活化的内皮細胞之间的粘附和白細胞通过所述活化的内皮细胞变移。
2.根据权利要求1所述的人重组单克隆抗体，其中所述人重组单克隆抗体结合人血管細胞粘附分子-1 (VCAM-I)的结构域1或2。
3.根据权利要求2所述的人重组单克隆抗体，其中所述人重组单克隆抗体含有重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO. 2限定的重链⑶Rl、SEQ ID NO. 3限定的重链⑶R2 和SEQ ID NO. 4限定的重链⑶R3;和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO. 6限定的轻链CDRUSEQ ID NO. 7限定的轻链CDR2和SEQ ID NO. 8限定的轻链CDR3。
4.根据权利要求2所述的人重组单克隆抗体，其中所述人重组单克隆抗体含有SEQID NO. 1限定的重链氨基酸序列。
5.根据权利要求2所述的人重组单克隆抗体，其中所述人重组单克隆抗体含有SEQID NO. 5限定的轻链氨基酸序列。
6.根据权利要求2所述的人重组单克隆抗体，其中所述人重组单克隆抗体与人VCAM-I 抗原的缔合/解离常数(KD值)为0. 1 X 10、至7. OX 10—1。
7.根据权利要求2所述的人重组单克隆抗体，其中所述人重组单克隆抗体含有重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO. 10限定的重链⑶R1、SEQ ID NO. 11限定的重链⑶R2 和SEQ ID N0. 12限定的重链⑶R3 ；和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID N0. 14限定的轻链CDRU SEQ ID N0. 15限定的轻链CDR2和SEQ IDN0. 16限定的轻链CDR3。
8.根据权利要求2所述的人重组单克隆抗体，其中所述人重组单克隆抗体含有SEQID N0. 9限定的重链氨基酸序列。
9.根据权利要求2所述的人重组单克隆抗体，其中所述人重组单克隆抗体含有SEQID N0. 13限定的轻链氨基酸序列。
10.提供炎性疾病、心血管疾病或癌症的诊断信息的方法，包括如下步骤检测权利要求1-9中任一项所述的人重组单克隆抗体与疑患炎性疾病或癌症的对象的生物样本中的 VCAM-I之间的抗原-抗体反应。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述炎性疾病选自肿瘤坏死因子-α(TNF-a) 介导的疾病和肠道疾病。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述肿瘤坏死因子-a(TNF-a)介导的疾病选自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、关节强直性脊椎炎、脓毒症、内毒素休克、血流动カ休克、脓毒症综合征、缺血再灌注损伤、疟疾感染、分枝杆菌感染、脑膜炎、银屑病、充血性心脏衰竭、纤维化疾病、Kachexie、移植排斥、癌症、自身免疫性疾病、AIDS相关的机会性感染、关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风、关节強直性痛风、克罗恩病、溃疡性膀胱三角炎、多发性硬化症、麻风结节性红斑(ENL)、辐射损伤和高氧引起的肺泡损伤。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述心血管疾病选自心肌梗塞、心脏病发作、中风、心率失常、高血压、高血脂和动脉硬化。
14.抑制白細胞与活化的内皮細胞之间粘附和白細胞通过活化的内皮细胞变移的方法，其利用权利要求1-9中任一项所述的人重组单克隆抗体。
15.用于炎性疾病、心血管疾病或癌症的诊断性組合物，其含有权利要求1-9中任ー项所述的人重组单克隆抗体。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述炎性疾病选自肿瘤坏死因子-a (TNF- α )介导的疾病和肠道疾病。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的疾病选自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、关节强直性脊椎炎、脓毒症、内毒素休克、血流动カ休克、脓毒症综合征、缺血再灌注损伤、疟疾感染、分枝杆菌感染、脑膜炎、银屑病、充血性心脏衰竭、纤维化疾病、Kachexie、移植排斥、癌症、自身免疫性疾病、AIDS相关的机会性感染、关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风、关节強直性痛风、克罗恩病、溃疡性膀胱三角炎、多发性硬化症、麻风结节性红斑(ENL)、辐射损伤和高氧引起的肺泡损伤。
18.根据权利要求15所述的组合物，其中所述心血管疾病选自心肌梗塞、心脏病发作、 中风、心率失常、高血压、高血脂和动脉硬化。
19.用于炎性疾病、心血管疾病或癌症的预防性或治疗性组合物，其含有权利要求1-9 中任一项所述的人重组单克隆抗体和药学可接受的载体。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述炎性疾病选自肿瘤坏死因子-a (TNF- a )介导的疾病和肠道疾病。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述肿瘤坏死因子-a(TNF-α)介导的疾病选自哮喘、糖尿病、葡萄膜炎、关节强直性脊椎炎、脓毒症、内毒素休克、血流动カ休克、脓毒症综合征、缺血再灌注损伤、疟疾感染、分枝杆菌感染、脑膜炎、银屑病、充血性心脏衰竭、纤维化疾病、Kachexie、移植排斥、癌症、自身免疫性疾病、AIDS相关的机会性感染、关节炎、类风湿性脊椎炎、痛风、关节強直性痛风、克罗恩病、溃疡性膀胱三角炎、多发性硬化症、麻风结节性红斑(ENL)、辐射损伤和高氧引起的肺泡损伤。
22.根据权利要求19所述的组合物，其中所述心血管疾病选自心肌梗塞、心脏病发作、 中风、心率失常、高血压、高血脂和动脉硬化。
23.治疗炎性疾病、心血管疾病或癌症的方法，包括如下步骤向对象给予权利要求19 所述的组合物。
全文摘要
本发明涉及人重组单克隆抗体，其特异性结合人血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)以抑制白细胞与活化的内皮细胞之间粘附和白细胞通过活化的内皮细胞的变移；和涉及包含该人重组单克隆抗体的用于炎性疾病或癌症的预防性和治疗性组合物。根据本发明所述的人重组单克隆抗体对人内皮细胞上表达的VCAM-1显示强亲和力，并有效抑制VCAM-1介导的白细胞与活化的内皮细胞之间粘附和白细胞通过活化的内皮细胞的变移，从而被用于预防和治疗炎性疾病如哮喘和关节炎、移植排斥、心血管疾病和癌症。
文档编号C07K16/18GK102574916SQ201080047819
公开日2012年7月11日 申请日期2010年10月22日 优先权日2009年10月23日
发明者姜庆在, 尹志容, 成炳济, 文庆德, 李东垠, 李东宪, 李廷泰, 柳修娟, 沈炫辅 申请人:韩华石油化学株式会社