专利名称：一种土贝母苷甲的高效分离提纯方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及一种土贝母苷甲的高效分离提纯方法。
背景技术：
土贝母系葫芦科植物土贝母(Bolbostemma paniculatum)的干燥鳞莖。广泛产于河南、河北、山西、山东、甘肃、宁夏、陕西、青海、云南等地，是一种传统中药，载于清代赵学敏氏编著的《本草纲目拾遗》。古代用它的块茎来治疗乳岩、乳痈、乳腺增生和瘰疬等疾患， 临床上显示出明显的散结毒、消痈肿效果。土贝母苷甲是从土贝母中提取分离得到的自然界首例糖链以环状结构连接的皂苷，具有免疫抑制、抗病毒、抗肿瘤、杀精等多种活性。黄霈等研究发现土贝母苷甲(TBMSl) 呈浓度依赖性显著抑制Bewo细胞的生长；流式细胞术分析显示TBMSl能促进细胞凋亡，将细胞周期阻滞在Gl期，并导致线粒体跨膜电位降低，细胞色素c (Cyt c)释放，caspase-3 表达增强；DNA梯状区带验证了药物诱导细胞凋亡的发生；Bax表达上调，Bcl-2及磷酸化的 P38表达下调等结果表明，TBMSl可能是通过p38/MAPK信号通路调控作用，导致线粒体功能紊乱，从而影响凋亡相关基因表达，有效诱导Bewo细胞凋亡。于立坚等发现土贝母苷甲可明显抑制HUVECs的生长，其抑制效果与剂量和作用时间相关，另外还有明显的抑制血管生成活性，其抑制血管生成作用与诱导血管内皮细胞凋亡，抑制其运动能力，下调VEGF、bFGF 和TOGF的表达有关。苷甲抑制人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞的粘附、侵袭和迁移能力，其对PGCL3细胞的侵袭和粘附的影响可能与其降低PGCL3细胞MMP-2的分泌量及其活性，降低PGCL3细胞对层粘连蛋白、纤维粘连蛋白的粘附率有关。苷甲有快速激活MAPK的效果， 激活MAPK信号转导通路可能是苷甲诱导肿瘤细胞凋亡的途径之一。土贝母皂苷甲、丙能够诱导SW480细胞凋亡，这可能是土贝母皂苷抗肿瘤作用的又一途径。微管是构成细胞骨架的重要组成成分，是肿瘤细胞的特定靶成分，实验表明土贝母皂苷、苷甲具有一定的抗微管作用，从而诱导癌细胞的凋亡。目前尚未见有高纯度土贝母苷甲制备的文献和专利报导。为了能满足市场上对土贝母苷甲的需求，我们研究并总结发现了一种操作简单、产品纯度高、从土贝母中分离纯化土贝母苷甲的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种土贝母苷甲的高效分离提纯方法，得到的土贝母苷甲纯度大于95%。本发明所提供的一种土贝母苷甲的高效分离提纯方法，包括以下步骤(I)将土贝母材料粉碎，采用50-90%乙醇或甲醇提取，合并得提取液；(2)上述提取液加入活性炭和硅藻土脱色，将脱色液减压浓缩至干，得固形物；(3)将上述固形物加水溶解，上非极性大孔树脂柱吸附2次，依次用水和60-80% 乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，减压回收试剂得土贝母总苷；
(4)将土贝母总苷经制备型HPLC色谱分离，乙醇/水、乙腈/水或甲醇/水为流动相洗脱，流速2-10ml/min，根据色谱图分段收集目标流分，回收溶剂后得土贝母苷甲粗晶；(5)将上述粗晶采用两相溶剂进一步纯化得高纯度产品，再用高效液相色谱仪对其纯度进行检测。所述步骤(2)活性炭和硅藻土加入量为提取液的O. 5-1. 5% (W/V)，活性炭和硅藻土比例为2-5 I。所述步骤(3)中大孔树脂可选D101、HPD100、X_5等非极性大孔吸附树脂。所述步骤⑷流动相中乙醇_水体积比为30-60 : 40-70、乙臆-水体积比为 30-45 55-70、甲醇-水体积比为 68-80 20-32。所述步骤(5)所用结晶溶剂为二氯甲烷-甲醇。本发明的有益效果是，利用本分离提纯方法，可快速从土贝母中提取分离得到高纯度的土贝母苷甲；整体工艺操作简单、产率高、产品纯度好，适合工业化生产。本发明为土贝母苷甲的进一步开发利用提供药理原料、理论和实践支持。
具体实施例方式实施例I :将土贝母鳞茎粉碎过20目筛，称取lkg，按I : 6的质量比加入80%的乙醇，加热回流提取2小时，经过滤除渣，将滤渣再用80%乙醇提取I次，提取I小时，合并两次滤液， 加入90g活性炭和硅藻土混合物(活性炭硅藻土比例为3 I)脱色，抽滤，将脱色液减压浓缩至干，得到固形物，将固形物加水溶解，取400g预处理好的DlOl大孔吸附树脂装柱， 溶解液加入树脂柱，重复吸附2次，先用水洗脱杂质，再换用70%乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，得到半成品60g ;将半成品加甲醇300ml加热搅拌溶解， 待半成品全部溶解后，选用O. 22 μ m有机系滤膜过滤，滤液备用。将滤液用高压输液泵泵入高效制备液相柱，流动相为乙腈水(33 67)体积比的混合液，流速8ml/min，收集土贝母苷甲流出液，回收试剂得土贝母苷甲半成品，再采用两相溶剂结晶法得到纯度达95. 5%的产品8.3g。所用结晶溶剂为二氯甲烷-甲醇，其体积比为4 I。实施例2:将土贝母鳞茎粉碎过20目筛，称取5kg，按I : 8的质量比加入90%的甲醇，超声提取I小时，经过滤除渣，将滤渣再用90%甲醇提取I次，提取I小时，合并两次滤液，加入 1200g活性炭和硅藻土混合物(活性炭硅藻土比例为4 I)脱色，抽滤，将脱色液减压浓缩至干，得到固形物，将固形物加水溶解，取2kg预处理好的X-5大孔吸附树脂装柱，溶解液加入树脂柱，重复吸附2次，先用水洗脱杂质，再换用80%乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，得到半成品316g ;取50g半成品加甲醇280ml加热搅拌溶解，待半成品全部溶解后，选用O. 22μηι有机系滤膜过滤，滤液备用。将滤液用高压输液泵泵入高效制备液相柱，流动相为乙醇水(30 70)体积比的混合液，流速2ml/min，收集土贝母苷甲流出液，回收试剂得土贝母苷甲半成品，再采用两相溶剂结晶法得到纯度达96. 3%的产品7.2g。所用结晶溶剂为二氯甲烷-甲醇，其体积比为6 I。实施例3:将土贝母鳞茎粉碎过20目筛，称取15kg，按I : 10的质量比加入70%的甲醇，加热回流提取I. 5小时，经过滤除渣，将滤渣再用70%甲醇提取I次，提取I. 5小时，合并两次滤液，加入90g活性炭和硅藻土混合物(活性炭硅藻土比例为2 I)脱色，抽滤，将脱色液减压浓缩至干，得到固形物，将固形物加水溶解，取6kg预处理好的DlOl人孔吸附树脂装柱，溶解液加入树脂柱，重复吸附2次，先用水洗脱杂质，再换用60%乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，得到半成品907g ;取50g半成品加甲醇300ml加热搅拌溶解，待半成品全部溶解后，选用O. 22 μ m有机系滤膜过滤，滤液备用。将滤液用高压输液泵泵入高效制备液相柱，流动相为甲醇水出8 32)体积比的混合液，流速10ml/min， 收集土贝母苷甲流出液，回收试剂得土贝母苷甲半成品，再采用两相溶剂结晶法得到纯度达95. 8%的产品6. 9g。所用结晶溶剂为二氯甲烷-甲醇，其体积比为3 I。实施例4 将土贝母鳞茎粉碎过20目筛，称取30kg，按I : 7的质量比加入50%的乙醇，超声提取2小时，经过滤除渣，将滤渣再用50%乙醇提取I次，提取I小时，合并两次滤液，加入90g活性炭和硅藻土混合物(活性炭硅藻土比例为5 I)脱色，抽滤，将脱色液减压浓缩至干，得到固形物，将固形物加水溶解，取12kg预处理好的HPDlOO大孔吸附树脂装柱， 溶解液加入树脂柱，重复吸附2次，先用水洗脱杂质，再换用70%乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，得到半成品1900g ;取50g半成品加甲醇280ml加热搅拌溶解，待半成品全部溶解后，选用O. 22 μ m有机系滤膜过滤，滤液备用。将滤液用高压输液泵泵入高效制备液相柱，流动相为乙腈水(47 53)体积比的混合液，流速6ml/min，收集土贝母苷甲流出液，回收试剂得土贝母苷甲半成品，再采用两相溶剂结晶法得到纯度达 97.2%的产品6.8g。所用结晶溶剂为二氯甲烷-甲醇，其体积比为5 I。
权利要求
1.一种土贝母苷甲的高效分离提纯方法，其特征在于(1)将土贝母材料粉碎，采用50-90%乙醇或甲醇提取，合并得提取液；(2)上述提取液加入活性炭和硅藻土脱色，将脱色液减压浓缩至干，得固形物；(3)将上述固形物加水溶解,上非极性大孔树脂柱吸附2次，依次用水和60-80%乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，减压回收试剂得土贝母总苷；(4)将土贝母总苷经制备型HPLC色谱分离，乙醇/水、乙腈/水或甲醇/水为流动相洗脱，流速2-10ml/min，根据色谱图分段收集目标流分，回收溶剂后得土贝母苷甲粗晶；(5)将上述粗晶采用两相溶剂进一步纯化得高纯度产品，再用高效液相色谱仪对其纯度进行检测。
2.按照权利要求I所述土贝母苷甲的高效分离提纯方法，其特征在于所述步骤(2) 活性炭和硅藻土加入量为提取液的O. 5-1. 5% (W/V)，活性炭和硅藻土比例为2-5 I。
3.按照权利要求I所述土贝母苷甲的高效分离提纯方法，其特征在于所述步骤(3) 中大孔树脂可选D101、HPD100、X-5等非极性大孔吸附树脂。
4.按照权利要求I所述土贝母苷甲的高效分离提纯方法，其特征在于所述步骤(4) 流动相中乙醇-水体积比为30-60 40-70、乙腈-水体积比为30-45 55-70、甲醇-水体积比为68-80 20-32。
5.按照权利要求I所述土贝母苷甲的高效分离提纯方法，其特征在于所述步骤(5) 所用结晶溶剂为二氯甲烷-甲醇。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，提供了一种土贝母苷甲的高效分离提纯方法，以土贝母为原料，通过溶剂提取方法得到提取液，加入活性炭和硅藻土脱色，脱色液浓缩至干，加水溶解，经2次非极性树脂柱吸附，洗脱液减压回收试剂，再经制备型高效液相分离精制得到土贝母苷甲纯品。本发明操作简单、产率高、产品纯度好。
文档编号C07H1/08GK102603853SQ201110026200
公开日2012年7月25日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者刘东锋, 李法庆 申请人:苏州宝泽堂医药科技有限公司