专利名称：7S,8R,8′R-(+)-落叶松树脂醇-4,4′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及7S，8R，8' 1 -(+)-落叶松树脂醇-4，4' -二 _0_β-D-卩比喃葡萄糖苷在制药中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
许多病毒性疾病严重威胁着人类的生命安全，如流感病毒(InfluenzaVirus)属于粘病毒科，为包膜的RNA病毒，包括人流感病毒和猪、马等家畜和鸡、鸟等禽类的甲型流感病毒。人流感病毒根据核蛋白抗原性不同可分为甲、乙、丙三型，其抗原性极易发生变异。人类的流行性感冒就是由流感病毒引起的急性上呼吸道传染病，具有传染性高、传播迅速、易发生传染等特点。这是由于病毒只能在活细胞生长的特殊性以及流感病毒的亚型变异速 度很快，使得化学药物和流感病毒疫苗难以发挥其最佳治疗和预防效果。尤其甲型流感病毒每隔10年左右就暴发一次世界性大流行。目前，流感的威胁依然存在，据统计，全世界平均每年有50-100万人死于流感。WHO早在1948年就已启动了流感计划，并已经在全世界83个国家建立了 111个国家研究中心和4个协作中心，对流感病毒进行样本收集、检测和研究。尽管如此，科学家们仍然希望用5年时间投入万美元建立一个全球实验室来研究流感。由此可见，流感作为一种病毒性传染病不仅严重威胁着公众健康，而且给国家和社会带来了学生的经济负担。流感作为严重危害公众健康的病毒性传染病，始终伴随着人们的生活。虽然已知的流感病毒已经得到控制，但是，由于流感病毒的抗原变异能力极强且相当频繁，疫苗的研制和生产相对滞后，对于易感人群的保护率不高，因此，新的流感大流行随时都有可能爆发。在这种情况下，寻找具有预防和治疗作用的抗流感药物就显得尤为重要和紧迫。当前美国食品和药物管理局(FDA)批准用于防治流感的药物有多金刚烷胺(Amantadine)、金刚乙胺(Rimantadine)和扎那米韦(Zanamivir),但分别存在易引起流感病毒耐药株的出现和服用不方便的问题。中医药治疗药物包括清开灵口服液、双黄连注射液、藿香正气丸、参脉注射液等清热解毒、增强人体免疫力的中成药，这些药物具有综合疗效好、毒副作用低等优势。因此，抗流感病毒药物的研究方兴未艾。中草药是天然宝库，以其内在科学性和实践的有效性，正日益受到世界各国医药学工作都的关注。中药不仅具有耐药性低、副作用和不良反应少等优点，而且还有抑制病毒复制、调节免疫功能、改善血液循环、解热镇痛及抗菌消炎等综合功效，其在防治流感病毒方面具有独特的优势和广阔的发展前景。因此，近年来，国内外均开展了抗病毒流感病毒中草药的研究，取得了较好的成果O板蓝根Isatis infigotica Fort.为临床常用的抗病毒药物，对流感病毒、柯萨奇B3病毒、肾综合征出血热病毒、乙型脑炎病毒、腮腺炎病毒、单纯疱疹病毒以及乙型肝炎病毒均有抑制作用。板蓝根中含有丰富的化学成分包括生物碱、黄酮、苷类、多糖和凝集素等，但是其具体的有文献报道的抗流感病毒成分仍不明确，为此有必要对其抗流感病毒的化学成分进行深入的研究。本发明所述的7S，8R，8' R_(+)_落叶松树脂醇-4，4 ' -二 -O- P -D-吡喃葡萄糖苷(7S，8R, 8 ' R- (-) -lariciresinol-4,4' -bis-0-0-D-glucopyranoside LBG)为从板蓝根中分得天然产物,体外和体内实验均表明有明显的抗流感病毒作用，而目前的文献中还没有其在抗流感病毒方面应用的报道
发明内容
本发明的目的之一在于弥补现有技术的不足，提供7S，SR, 8，R- (+)-落叶松树脂醇_4，4' -二-0-0 -D-批喃葡萄糖苷在抗流感药物中的应用，从而为临床上流感病毒性疾病的治疗提供一种安全有效毒副作用小的天然药物。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是7S，8R，8' R_(+)_落叶松树脂醇_4，4' -二 _0_P-D-吡喃葡萄糖苷在制备抗流感病毒药物中的应用。7S，8R，8' R_(+)_落叶松树脂醇_4，4' -二 _0_P-D-吡喃葡萄糖苷可以制成抗流感病毒复方药物，也可以单独制成抗流感病毒药物。本发明的另一目的是提供一种抗流感病毒的药物。实现上述目的的技术方案如下一种抗流感病毒的药物，其活性成份为7S，8R，8' R_(+)_落叶松树脂醇_4，4' -二-0-0-D-吡喃葡萄糖苷。上述流感病毒为甲型流感病毒。本发明的另一目的是提供7S，8R，8 ' R-(+)-落叶松树脂醇_4，4' -二-0-0-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法。实现上述目的的技术方案如下所述7S，8R，8' 1 -(+)-落叶松树脂醇_4，4' -二 _0_ P-D-卩比喃葡萄糖苷的制备方法为A)取板蓝根切碎，加入8-12倍量水回流提取2-4次，每次I. 5_2. 5小时，合并提取液，减压浓缩，得浓缩液；B)将浓缩液置DlOl大孔树脂中，分别用水、10%乙醇、30%乙醇洗脱，收集30%乙
醇洗脱液，减压浓缩得浸膏；C)浸膏以适量的水溶解后，置MCI凝胶柱中，分别以水、10%和25%的甲醇洗脱，收集25%甲醇的洗脱液，浓缩至干；D)甲醇溶解，置LH-20凝胶中甲醇洗脱，浓缩，甲醇中结晶，得黄白色粉末。本发明对7S，8R，8' R-(+) _落叶松树脂醇_4，4' -二 _0_ P-D-吡喃葡萄糖苷进行体内外抗流感病毒的研究其中体外抗病毒利用直接、治疗及保护3种策略，以细胞病变抑制法和空斑减少试验，评价对不同流感病毒亚型的抑制作用，包括甲型HlNl流感病毒PR8 株(A/PR/8/34, H1N1)、甲型 HlNl 流感病毒 FMl 株(A/FM1/47, H1N1)、甲型 H3N2 流感病毒 Aichi 株(A/Aichi/2/68，H3N2)、新甲型 HlNl 流感病毒株(A/Guangzhou/GIRD07/09，H1N1)、季节性甲型HlNl流感病毒株(A/Guangzhou/GIRD02/2009, H1N1)、乙型流感病毒(B/Guangzhou/GIRD08/09)、甲型 H6N2 流感病毒(A/Duck/Guangdong/2009，H6N2)、甲型 H7N3 流感病毒(A/Duck/Guangdong/1994，H7N3)、甲型 H9N2 流感病毒(A/Chicken/Guangdong/1996,H9N2);体内抗病毒利用小鼠感染甲I型流感病毒FMl鼠肺适应株模型，评价了 LBG的体内抗病毒药效。结果表明在LBG治疗作用模式，对不同亚型流感病毒都显示了不同程度的抑制作用(半数有效浓度IC5tl, O. 087 O. 79mg/ml);体内抗流感病毒研究则表明LBG高中剂量组的肺指数(LI)，分别为1.08±0. 14，I. 12±0. 14)均显著低于病毒模型组(2. 00±O. 48)，P < O. 05，且呈剂量依赖性；另外，透射电镜实验也表明药物LBG能够有效抑制病毒在宿主细胞复制增殖。因此表明该化合物具有开发成抗流感病毒的有效药物而用于临床，并且可以作为临床上潜在的抗病毒药物进一步开发的广阔前景。结合现代常用药物制剂手段，还可将LBG制成薄膜包衣片、胶囊剂、颗粒剂、分散剂，从而采用比较方便的口服给药形式。本发明所述抗病毒药物的使用剂量可随特定的给药方式、病症的严重程度等而相应调整。一般情况下，临床口服使用的参考剂量是10-180mg/d。综上所述，本发明与现有技术相比具有以下有益效果
1、7S，8R，8' R_(+)_落叶松树脂醇_4，4' -二 _0_ β-D-吡喃葡萄糖苷是一种纯天然药物，细胞毒性作用小，在16μ g-10mg/ml范围内没有细胞毒性。2、能够抑制多种甲型流感病毒，包括甲型HlNl (A/PR/8/34)、HlNl (A/FM1/47)、HlNl (A/Guangzhou/GIRD07/09)、HlNl (A/Guangzhou/GIRD02/2009)、H7N3 (A/Duck/Guangdong/1994)、H9N2 (A/Chicken/Guangdong/1996)。3、对甲型流感病毒感染具有直接的治疗作用。4、可口服给药，服用方便。5、纯天然产物，与西药比较不容易产生耐药性。
图I为体外抗流感病毒治疗、保护和直接作用三种策略模式操作步骤；图2为LBG体外抗甲I型流感病毒PR8株的空斑减少实验图；图3为透射电镜观察药物处理后的病毒超微结构，其中，A病毒组8h，B病毒组24h, C LBG 组 8h，D LBG24h, E 病毒唑组 8h，F 病毒唑组 24h ；图4为LBG对鼠肺悬液的感染性病毒的定量检测。
具体实施例方式为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例对本发明的内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。实施例I :制备7S，8R，8' R_(+)_落叶松树脂醇_4，4' -二 _0_ β-D-吡喃葡萄糖苷取板蓝根10kg，切碎，加入100L水回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩，置DlOl大孔树脂中，先用水洗脱，再分别用10%，30%乙醇洗脱，收集30%醇洗脱液，减压浓缩得浸膏。浸膏以适量的水溶解后，置MCI凝胶柱中，分别以水、10%和25%的甲醇洗脱，收集25%的洗脱液，浓缩至干，甲醇溶解，置LH-20凝胶中脱色，浓缩，甲醇中结晶，得黄白色粉末，经红外、紫外、核磁共振和质谱等分析确定其结构为7S，8R，8' R_(+)_落叶松树脂醇-4，V -二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(7S，8R，V R-(-)-lariciresinol-4,4' -bis-Ο-β -D-glucopyranoside), HPLC 检测其纯度为 98. 5%,分子式 C32H44O16,分子量684，其结构如下
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卜CC\卜 ^——Ch实施例2 7S，8R，8' R_(+)_落叶松树脂醇_4，4' -二 _0_P _D_吡喃葡萄糖苷体外抗流感
病毒作用I实验材料
I. I药物受试样品LBG为实验室自制，经HPLC检测其纯度为98. 5%。I. 2 细胞狗肾细胞(MDCK)引自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。人喉癌细胞(HEp-2)、猴肾细胞(LLC-MK2)、人胚肺成纤维细胞(MRC-5)分别引自美国经典培养物收藏中心(ATCC)及中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。I. 3病毒株甲型HlNl流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)、甲型HlNl流感病毒FMl株(A/FM1/47, H1N1)、甲型H3N2流感病毒Aichi株(A/Aichi/2/68，H3N2)均购自美国经典培养物收藏中心(ATCC);新甲型 HlNl 流感病毒株(A/Guangzhou/GIRD07/09，H1N1, GenebankNo. HMO14332. I)、季节性甲型 HlNl 流感病毒株(A/Guangzhou/GIRD02/2009, H1N1)、乙型流感病毒(B/Guangzhou/GIRD08/09)为本室临床分离株，甲型流感病毒H6N2 (A/Duck/Guangdong/2009, H6N2)、H7N3(A/Duck/Guangdong/1994, H7N3)、H9N2(A/Chicken/Guangdong/1996, H9N2)由华南农业大学兽医学院陈建新教授惠赠。上述病毒均以9 11日龄鸡胚扩增，收获尿囊液，测定其相应血凝效价。以Reed-Muench法测定其半数感染量(TCID5tl)作为病毒滴度，用于细胞病变抑制法；根据空斑形成法的滴度计算感染复数(Multiplicity Oflnfection, M. 0. I)，用于空斑减少实验。I. 4主要试剂MEM (基础培养基)GIBCOLot :699642胎牛血清GIBCOLot :721229MTT (3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2) GenebaseLot :0793Agar (低熔点琼脂)OXOIDLot : 1042795-02DEAE (二乙氛乙基纤维素)MP Biomedicals Lot 3967J结晶紫天津大茂2实验方法2. I药物细胞毒性试验(MTT法)
常规制备MDCK细胞接种到96孔板，24h后待细胞长成单层，弃去培养液，加入不同稀释度的药物，空白对照和正常细胞对照孔加入MEM，37°C,5% CO2继续培养36-48小时，每孔加MTT溶液(511^/1^)，置371，5% CO2温箱中继续孵育4小时。吸弃培养上清液，加二甲基亚砜(DMSO)，低速振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。按照下列公式计算抑制率，并用Reed-Muench法计算50%毒性浓度为药物半数毒性浓度(TC5tl)。 (I)空白对照孔(培养基、MTT、DMS0)(2)正常细胞对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、DMS0)(3)抑制率=[(正常-空白)_(给药-空白)]/(正常-空白)X100%2.2.体外抗甲型流感病毒作用2. 2. I对不同亚型的流感病毒抑制作用以空斑减少实验(Plaque Reduction Assay)在治疗、保护和直接作用三种试验策略下进研究LBG对不同流感病毒亚型(H1/H3/H6/H7/H9)的抑制作用。(I)治疗模式12孔细胞培养板内的MDCK细胞吸附病毒2h，同时设定病毒对照和细胞对照，加入不同浓度药物(除病毒和细胞对照外)在37°C 5% CO2环境下培养。(2)保护模式12孔细胞培养板内的MDCK细胞孵育药物2h，加入病毒吸附2h后，换含TPCK胰酶的无血清培养基，在37°C、5% CO2环境下培养。(3)直接杀灭作用病毒与不同浓度的药物37°C孵育Ih后接种于细胞中，置于4°C孵育Ih，吸弃上清，换含TPCK的无血清培养基37°C培养8h。空斑减少试验经过不同的模式处理的单层细胞上加入I. 5mL/孔琼脂糖营养物，内含 O. 2% BSA, O. 8% Agar 和 O. 3% DEAE-Dextran，置 34°C、5% CO2 条件下培养 3 天，以福尔马林缓冲结晶紫溶液(O. 1%)固定和染色并计算空班形成单位(PFU/mL)，按下列公式计算空斑形成单位
权利要求
1.7S，8R，8' R-(+)-落叶松树脂醇-4，4' -二 _0_ β-D-吡喃葡萄糖苷在制备抗流感病毒药物中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征是，所述流感病毒为甲型流感病毒。
3.一种抗流感病毒的药物，其特征是，其活性成份为7S，8R，8' R_(+)_落叶松树脂醇_4，4' -二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
4.根据权利要求2所述的抗流感病毒的药物，其特征是，所述流感病毒为甲型流感病 毒。
5.—种7S，8R，8' 1 -(+)-落叶松树脂醇_4，4' -二 _0_ β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征是，包括以下步骤 Α)取板蓝根切碎，加入8-12倍量水回流提取2-4次，每次I. 5-2. 5小时，合并提取液，减压浓缩，得浓缩液； B)将浓缩液置DlOl大孔树脂中，分别用水、10%乙醇、30%乙醇洗脱，收集30%乙醇洗脱液，减压浓缩得浸膏； C)浸膏以适量的水溶解后，置MCI凝胶柱中，分别以水、10%和25%的甲醇洗脱，收集25%甲醇的洗脱液，浓缩至干； D)甲醇溶解，置LH-20凝胶中甲醇洗脱，浓缩，甲醇中结晶，得黄白色粉末。
全文摘要
本发明公开了一种7S，8R，8′R-(+)-落叶松树脂醇-4，4′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法以及其在制备抗流感病毒药物中的应用，本发明还涉及了活性成份为7S，8R，8′R-(+)-落叶松树脂醇-4，4′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷是抗流感病毒的药物。所述7S，8R，8′R-(+)-落叶松树脂醇-4，4′-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对甲型流感病毒感染具有直接的治疗作用，可口服给药，服用方便，其是纯天然产物，与西药比较不容易产生耐药性。
文档编号C07H1/08GK102614206SQ20111003374
公开日2012年8月1日 申请日期2011年1月31日 优先权日2011年1月31日
发明者何宝, 关文达, 招穗珊, 朱荃, 李楚源, 杨子峰, 林青, 段婷婷, 汤丹, 王德勤, 王玉涛, 秦笙, 莫自耀, 郑兆广, 钟南山, 项平, 顾斐 申请人:呼吸疾病国家重点实验室, 广州呼吸疾病研究所, 广州白云山和记黄埔中药有限公司, 澳门科技大学