专利名称：石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及到一种石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和ELISA检测试剂盒的制备和应用。
背景技术：
目前，麻痹性贝类毒素(Paralytic shellfish poison,PSP)已成为世界上分布范围最广、发生频率最高、危害程度最大的一类海洋生物毒素，它通过影响钠离子通道而抑制神经的传导。而石房蛤毒素(Mxitoxin，STX)为麻痹性贝类毒素的主要成分之一，是四氢嘌呤的一种衍生物，其外部形态是呈白色、吸湿性很强的固体，溶于水，微溶于甲醇和乙醇。 STX及天然衍生物所构成的PSP有很高的致死率，STX对成年人轻度中毒量为110 μ g，致死剂量为 540 ~ IOOOyg, LD50 为 9 μ g/kg (小鼠，ip)。贝类毒素的分析方法主要有小鼠生物测试法、HPLC法及免疫方法等。小鼠生物测试法是是国际上都能接受的唯一的方法。该方法在检测样本总毒性方面相当成功，但此种方法不能确知毒素的组成及含量，且重复性差，灵敏度不高。近几年发展起来的HPLC法及其联用技术，具有灵敏、高效的特点，能够提供更多的毒素信息，是PSP毒素检测的主要手段，但存在成本高，费时，需要较高的仪器设备及分析技术等缺点。而酶联免疫吸附测定技术(ELISA)具有简便、快速、灵敏、成本低廉等特点，ELISA法与传统的动物生物法及色谱方法相比较，更快速经济，可以满足大批量样品的快速筛查需要。国内对麻痹性贝毒中的膝沟藻毒素(gonyautoxin，GTX)研究的比较多，暨南大学的向军俭制备了抗麻痹性贝毒素GTX2，3的单克隆抗体，同时也比较了间接竞争和直接竞争ELISA方法的灵敏度和检出限。但对STX的酶联免疫吸附法研究还没有开展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和ELISA 检测试剂盒的制备和应用，将制备的抗体用于石房蛤毒素的检测，以弥补现有技术的不足。制备抗体的关键是制备人工免疫抗原，因为石房蛤毒素是一种相对分子质量只有 299的小分子半抗原，没有抗原性，不能刺激动物体产生相应的抗体，需要和某种大分子的物质偶联形成完全抗原，小分子的半抗原就成为新的偶联物的抗原决定簇，这样小分子物质就具有了抗原性。而制备人工抗原要选择合适的载体蛋白，本发明选择碳化二亚胺法， 载体蛋白选用卵清白蛋白(OVA)，将石房蛤毒素上的氨基与卵清白蛋白(OVA)上的羧基相连，采用梯度法透析后得到高纯度的石房蛤毒素免疫抗原STX-0VA。同时本发明还选择用牛血清白蛋白(BSA)来制备包被抗原STX-BSA，在制备ELISA试剂盒时需要用包被抗原包被酶标板。本发明的技术方案如下一、免疫抗原STX-0VA，其结构式为
权利要求
1. 一种石房蛤毒素人工抗原，为石房蛤毒素人工抗原STX-0VA，其结构式为
2.如权利要求1所述的石房蛤毒素人工抗原的制备方法，其特征在于是将石房蛤毒素上的氨基与卵清白蛋白OVA上的羧基相连得到石房蛤毒素人工抗原，包括以下步骤(1)将石房蛤毒素STX溶于二甲基亚砜DMSO中，配成0.1 μ g/ μ L的STX母液；将水溶性碳化二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS用0. OlM ρΗ7. 5磷酸盐缓冲液PBS，分别配制成lmg/mL相应工作液；(2)取100μ L STX母液，加入20 μ L EDC工作液和12 μ L NHS工作液，室温震荡反应 3h制成最初反应液；(3)用0.OlM pH7. 5的PBS缓冲液将卵清白蛋白配成lmg/mL的卵清白蛋白工作液；(4)将步骤O)中的最初反应液加入到IOOyL卵清白蛋白工作液中，震荡反应12h获得最终反应液；(5)将上述的最终反应液转移到透析卡中，用300mL0.01M pH7. 5的PBS缓冲液和DMSO 的混合液透析72h，每1 换液1次，透析完后取出反应物即制得石房蛤毒素人工抗原。
3.如权利要求2所述的石房蛤毒素人工抗原的制备方法，其特征在于STX EDC NHS 反应的摩尔比为1 3 2。
4.如权利要求2所述的石房蛤毒素人工抗原的制备方法，其特征在于上述的透析是采用梯度透析法，第一次透析的溶液中PBS缓冲液和DMSO的体积比为100 4-5，第二次透析的体积比为100 3-4，第三次透析的体积比为100 2-3，第四次透析的体积比为 100 1-2，第五次透析的体积比为100 0.5-1，以后透析的溶液不加DMS0。
5.权利要求1所述的石房蛤毒素人工抗原用于制备石房蛤毒素抗体。
6.如权利要求5所述的石房蛤毒素抗体，其特征在于是用石房蛤毒素人工抗原 STX-OVA作为免疫抗原免疫小鼠，分离纯化血清得到的石房蛤毒素多克隆抗体。
7.权利要求6所述的石房蛤毒素抗体的制备步骤如下用STX-OVA免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，首次免疫用200 μ L STX-OVA与等体积弗氏完全佐剂，充分乳化后制成乳浊液，腹腔注射小鼠，之后每隔两周取同量STX-OVA与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，腹腔注射；免疫三次后取尾血测定小鼠血清效价，若效价不高，继续免疫；待效价大于要求值后取血，室温放置30min，8000r/min离心20min，取上层血清，用蛋白A抗体离心纯化试剂盒纯化血清，得到石房蛤毒素多克隆抗体。
8.权利要求6所述的石房蛤毒素多克隆抗体应用于制备石房蛤毒素的酶联免疫检测试齐U盒。
9.如权利要求8所述的检测石房蛤毒素的ELISA试剂盒，其特征在于所述试剂盒依间接竞争ELISA原理研制而成，包括a、ELISA板条每个试剂盒含4块真空包装的ELISA板，每块板含包被抗原包被的可拆卸的ELISA微孔板条，规格为8孔X 12条；b、洗涤液PBS-T10倍浓缩的pH为7. 4的含0. 1 %体积分数的吐温20的PBS溶液 200mL ；c、纯化的石房蛤毒素多克隆抗体血清5mL；d、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG酶标二抗ImL；e、底物显色液50mL配制方法为取50 μ L TMB溶液+IOmL底物缓冲液十10 μ L 30%过氧化氢，混勻；底物缓冲液的配制为称取柠檬酸19. 2g加水至IOOOmL,为甲液；称取磷酸氢二钠71. 7g，加水至1000m L，为乙液；取甲液24. 3mL,乙液25. 7mL，加水至IOOmL即为底物缓冲液；f、终止液2M硫酸溶液IOmL；g、石房蛤毒素标准抗原液lmL，浓度为9.65 μ M/L ；h、稀释液0.OlM pH 为 7. 5 的 PBS 溶液 500mL。
全文摘要
本发明涉及一种石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和应用，是采用碳化二亚胺法，将石房蛤毒素STX上的氨基与载体蛋白卵清白蛋白OVA上的羧基相连，采用梯度法透析后得到高纯度的石房蛤毒素免疫抗原STX-OVA。将获得的人工抗原去制备石房蛤毒素的多克隆抗体，而制备的多克隆抗体可用于制备石房蛤毒素的酶联免疫检测试剂盒。本发明成功合成了石房蛤毒素人工抗原STX-OVA和STX-BSA，将制备的免疫抗原免疫BALB/c小鼠，可得到效价高、特异性强的多克隆抗体，利用建立的酶联免疫分析方法制备的试剂盒可用于石房蛤毒素的快速检测。
文档编号C07K14/77GK102206270SQ20111005458
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年1月27日
发明者刘帅帅, 周德庆, 朱兰兰, 柳淑芳, 赵峰 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所