专利名称：一种h1亚型特异性保守表位、抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及流感病毒，特别是可用于该病毒所致疾病的诊断和预防领域的新表位和相应的抗体。
背景技术：
甲型流感病毒(简称IAV)是正粘病毒科的重要成员，广泛分布于自然界，对多种禽类和哺乳动物具有高度传染性。甲型流感病毒可引起每年季节性流行和反复的大流行，对全世界经济和公共卫生都造成了严重的危害。上世纪曾发生过三次流感大流行，其流行毒株分别是1918A/H1N1，1957A/H2N2和1968A/H3N2。1918年西班牙流感是其中最严重的大流行，共造成全球至少5000万人死亡。与1918大流行相比，其余的两次大流行危害较小，但也分别造成了近200万和100万人的死亡。2009年暴发的甲型HlNl流感大流行已遍布 全球，在214个国家和地区造成了 18389人死亡。甲型流感病毒的基因组由八个单股负链RNA片段组成，至少编码10种蛋白，包括两种表面糖蛋白(HA和NA)，六种内部蛋白(NP，PBl，PB2，PA，Ml和M2)和两种非结构蛋白(NSl和NS2)。根据HA和NA抗原性不同，甲型流感病毒可分为16个HA亚型(Hl H16)和9个NA亚型(NI N9)。目前16个HA亚型均可感染禽类，而感染人的流感目前只发现!11、!12、!13、册、!17及!19六个拟亚型。Hl，H2和H3亚型可引起流感大流行。Hl和H3两种亚型在人群中一直存在，与こ型流感病毒一起构成了季节性流感的主要病原。HA由病毒基因组片段4编码，是ー个长约550个氨基酸的糖蛋白，其生物活性形式为同源三聚体分子。HA是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，其疏水性羧基端插入病毒囊膜的脂质双层。HA在流感病毒的致病过程中发挥了重要作用。HA的主要作用是与靶细胞表面受体结合，进而介导病毒与细胞膜的融合。HA也是激发宿主保护性免疫特别是中和抗体的主要病毒成分。由于其免疫反应的特异性，HA也是免疫试验划分亚型的重要依据。目前，甲型流感病毒抗体亚型划分主要依赖于血凝抑制试验(HI试验)。HI试验相对费カ且需要从活病毒中制备抗原，具有潜在危险性。而且，HI试验结果可受NA抗体的干扰，导致非特异性的抑制和误鉴。微量中和试验也是流感病毒抗体亚型划分的替代方法。但是，由于需要细胞培养过程，该方法费时费力，不适合于大規模研究。最近，对不同种类的ELISA方法对IAV抗体进行亚型划分也有报道，然而目前的方法主要依赖于重组HA抗原，在一定程度上可导致非特异性检测。A型流感来源的表位是准确评估免疫反应和区分反应特异性的有用工具。已有报道发现了 HA亚型特异性和亚型间保守表位。利用表位研制的ELISA方法对某ー特定HA亚型是高度保守和特异的将会对IAV的快速简单分型有用。然而，这样的表位仍未被充分研究。Hl亚型流感是人群中最主要的流感亚型，是造成至少两次大流行和多年来季节性流行的病原。2009甲型HlNl流感大流行的到来再次说明了 Hl亚型流感检测，监测和控制的重要性。
发明内容
在本研究中，我们成功鉴定了ー个在所有Hl亚型流感病毒株中高度保守的特异性表位。基于此表位，我们建立了 Hl亚型检测的方法，该方法与HI试验具有良好的相关性。这种使用本发明的抗原表位检测Hl亚型的方法快速、简便并且没有活病毒的潜在危险。在本发明的第一方面，提供ー种高度保守的Hl亚型特异性流感病毒血凝素抗原表位，该抗原表位是由15个氨基酸残基构成的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :I所示。在本发明的第二方面，提供一种检测Hl亚型的方法，该方法使用第一方面所述抗原表位进行检測。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤 a)使待测样品与权利要求I所述抗原表位接触；b)向步骤a)的所得物中加入带标记的对应二抗；c)直接检测所述标记或者向步骤b)的所得物中加入与所述标记发生反应的指示剂后检測。在ー个具体实施方案中，所述方法为ELISA方法，并使用所述抗原表位作为包被抗原。在本发明的第三方面，提供ー种Hl流感病毒的诊断试剂盒，该试剂盒包括第一方面所述抗原表位。在本发明的第四方面，提供第一方面所述抗原表位在制备Hl流感病毒的诊断试剂中的应用。在本发明的第五方面,提供由第一方面所述抗原表位制备的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。在ー个具体实施方案中，所述抗体是由第一方面所述抗原表位免疫小鼠而获得的抗血清。在另ー个实施方案中，所述抗原先与大分子偶联再用于制备所述抗体。在ー个优选实施方案中，所述大分子是KLH。在本发明的第六方面，提供一种检测Hl亚型的方法，该方法使用第五方面所述抗体进行检測。在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤a)使待测样品与权利要求7-11任ー项的抗体接触；b)向步骤a)的所得物中加入带标记的对应二抗；c)直接检测所述标记或者向步骤b)的所得物中加入与所述标记发生反应的指示剂后检測。在ー个具体实施方案中，所述方法为ELISA方法，并使用所述抗体作为包被抗体。在另ー个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤a)将待测样品经SDS-PAGE后转至硝酸纤维素膜并使所述膜与所述抗体接触；b)加入荧光标记的对应ニ抗；c)用成像系统对所述膜成像。
在本发明的第七方面，提供ー种Hl流感病毒的诊断试剂盒，该试剂盒包括第五方面所述抗体。在本发明的第八方面，提供第五方面所述抗体在制备Hl流感病毒的诊断试剂中的应用。
图I为流感毒株A/California/04/2009血凝素蛋白(NCBI登录号ACP41105)免疫优势表位的合成肽筛选图。图2为合成肽抗血清的滴度及其与纯化HAO蛋白(未切割的成熟血凝素蛋白)的反应。
图3为免疫印迹确定合成肽诱导抗体的特异性。A H1 H16亚型HA蛋白分别与合成肽P3、P5和P31所诱导的抗体反应，Actin为肌动蛋白，作为细胞内參；B :不同年代来源的Hl亚型HA蛋白分别与合成肽P5和P31所诱导的抗体及Hl亚型HA抗血清(由本实验室制备)反应。图4为合成肽的三维结构位置及保守性。图5为P5合成肽表位的精细定位。用ELISA方法检测在表6所示合成肽存在吋P5与相应抗体结合的百分率。
具体实施例方式所述Hl亚型流感病毒血凝素线性抗原表位，是Hl亚型流感病毒HAl亚基膜外茎状区的一种线性抗原表位。本发明提供的Hl亚型流感病毒血凝素线性抗原表位是采用人工合成肽库与HlNlpdm流感病人恢复期血清IgG结合筛选得到的。本发明的技术途径是首先人工合成HlNlpdm流感病毒株A/California/04/2009血凝素膜外区的肽库。每条肽段的长度为15个氨基酸残基，与相邻肽段重合5个氨基酸残基。以合成肽包被酶标板，用HlNlpdm流感病人恢复期血清进行筛选，获得反应性强的合成肽。将反应性强的合成肽与KLH偶联后免疫小鼠，收获抗血清。通过免疫印迹鉴定、生物软件Bioedit比对和swiss_model数据库同源建模等方法,确定了ー种高度保守的Hl亚型流感病毒特异性抗原表位。下面结合优选实施例进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实验方法，通常按照常规条件和方法，如分子克隆实验室手册' (Sambrook, et al. New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述方法或试剂制造商提供的方法。实施例实施例I. A/HlNlpdm血凝素蛋白免疫优势表位的鉴定I. ΙΑ/HlNlpdm流感血凝素蛋白膜外区肽库的合成以固相方式合成了 50条A/HlNlpdm流感血凝素蛋白膜外区(18_523a. a)肽库。肽库由上海生物工程技术有限公司合成。每条肽的长度为15个氨基酸残基，与邻近肽重叠5个氨基酸残基。所用合成肽通过高效液相色谱纯化，纯度> 95%，并通过质谱鉴定。
所有合成肽的氨基酸序列及位置示于表I。表ΙΑ/HlNlpdm流感血凝素蛋白膜外区肽库
_代码—位置_序列_代码—位置_序列_
P118-32 DTLCIGYHANNSTDTP228-42NSTDTVDTVLEKNVT
P338-52 EKNVTVTHSVNLLEDP448-62NLLEDKHNGKLCKLR
P558-72 LCKLRGVAPLHLGKCP668-82HLGKCNIAGWILGNP
P778-92 ILGNPECESLSTASSP888-102STASSWSYIVETPSS
P998-112 ETPSSDNGTCYPGDFP10108-122YPGDFIDYEELREQL
P11118-132 LREQLSSVSSFERFEP12128-142FERFEIFPKTSSWPN
P13138-152 SSWP N H DSN KG VTAAP14148-162GVTAACPHAGAKSFY
P15158-172 AKSFYKNLIWLVKKGP16168-182LVKKGNSYPKLSKSY
P17178-192 LSKSYINDKGKEVLVP18188-202KEVLVLWGIHHPSTS
P19198-212 HPSTSADQQSLYQNAP20208-222LYQNADTYVFVGSSR
P21218-232 VGSSRYSKKFKPEIAP22228-242KPEIAIRPKVRDQEG
P23238-252 RDQEGRMNYYWTLVEP24248-262WTLVEPGDKITFEAT
P25258-272 TFEATGNLVVPRYAFP26268-282PRYAFAMERNAGSGI
P27278-292 AGSGIIISDTPVHDCP28288-302PVHDCNTTCQ TPKGA
P29298-312 TPKGAINTSLPFQNIP30308-322PFQNIHPITIGKCPK
P31318-332 GKCPKYVKSTKLRLAP32328-342KLRLATGLRNIPSIQ
P33338-352 IPSIQSRGLFGAIAGP34348-362GAIAGFIEGGWTGMV
P35358-372 WTGMVDGWYG YH HQNP36368-382YHHQNEQGSGYAADL
P37378-392 YAADLKSTQNAIDEIP38388-402AIDEITNKVNSVIEK
P39398-412 SVIEKMNTQFTAVGKP40408-422TAVGKEFNHLEKRIE
P41418-432 EKRIENLNKKVDDGFP42428-442VDDGFLDIWTYNAEL
P43438-452 YNAELLVLLENERTLP44448-462NERTLDYHDSNVKNL
P45458-472 NVKNLYEKVRSQLKNP46468-482SQLKNNAKEIGNGCF
P47478-492 GNGCFEFYHKCDNTCP48488-502CDNTCMESVKNGTYD
P49498-512 NGTYDYPKYS EEAKLP50508-523EEAKLNREEI DGVKLD
I. 2间接ELISA筛选免疫优势表位 11份A/HlNlpdm流感病人恢复期血清于2009年北京甲流暴发期间釆集。10份健康人血清作为阴性对照。
将稀释于包被液(pH9. 6的碳酸盐缓冲液)中的合成肽(I μ g/孔)包被于酶标板，4 °C过夜，加入封闭液(1% BSA) 37 °C 2-3小时，用含O. 1%吐温-20(v/v)的PBST洗涤，甩干洗涤液。每孔加入100 μ 11 200稀释的上述血清，37°C孵育2小时，甩掉液体，用PBST缓冲液洗涤5次。然后每孔加入IOOyll 40000稀释的辣根过氧化物酶山羊抗人IgG，37°C孵育I小时，甩掉液体，用PBST洗涤5次。每孔加入100 μ I 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色，15分钟后加入50 μ I 2Μ H2SO4显色并立即测定450nm处的吸光值。以阴性对照血清的0D450nm值加上3倍标准差确定取舍点(cut-off)值(O. 35)。计算每条合成肽在11份A/HlNlpdm流感病人恢复期血清中的阳性反应率，结果见图I。P3、P5、P15、P16和P31五条肽与HlNlpdm流感病人恢复期血清普遍反应，反应率依次为54. 5 %、100 %、81. 8%,81. 8%和 100%。实施例2.免疫优势肽的抗原性2. I肽与KLH的偶联肽与KLH的偶联由上海生物工程技术有限公司完成。 肽的偶联以如下方式进行合成肽P3、P6和P30 (P6和P30为阴性反应对照)分别直接与KLH偶联。为了增加偶联物的溶解性和免疫原性，合成肽P5、P15、P16和P31分别首先与6-氨基己酸连接，然后添加一个三肽(KKC)，再与KLH偶联。表2是免疫所用肽-KLH偶联物的序列表2用于免疫的肽-KLH偶联物的氨基酸序列
权利要求
1.ー种Hl亚型特异性流感病毒血凝素抗原表位，该抗原表位是由15个氨基酸残基构成的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一种检测Hl亚型的方法，其特征在于，使用权利要求I所述抗原表位进行检測。
3.—种权利要求2的方法，包括以下步骤 a)使待测样品与权利要求I所述抗原表位接触； b)向步骤a)的所得物中加入带标记的对应ニ杭； c)直接检测所述标记或者向步骤b)的所得物中加入与所述标记发生反应的指示剂后检测。
4.一种权利要求2或3的方法，其特征在于，所述方法为ELISA方法，并使用所述抗原表位作为包被抗原。
5.ー种Hl流感病毒的诊断试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求I所述抗原表位。
6.权利要求I所述抗原表位在制备Hl流感病毒的诊断试剂中的应用。
7.由权利要求I所述抗原表位制备的抗体。
8.权利要求7的抗体，其特征在于，其是多克隆抗体。
9.权利要求7或8的抗体，其特征在于，其是由所述抗原对小鼠进行免疫而获得的抗血清。
10.权利要求7-9任ー项的抗体，其特征在于，所述抗原先与大分子偶联，再用于制备所述抗体
11.权利要求10的抗体，其特征在于，所述大分子是KLH。
12.—种检测Hl亚型的方法，其特征在于，使用权利要求7-11任ー项的抗体进行检測。
13.—种权利要求12的方法，包括以下步骤 a)使待测样品与权利要求7-11任ー项的抗体接触； b)向步骤a)的所得物中加入带标记的对应ニ杭； c)直接检测所述标记或者先向步骤b)的所得物中加入与所述标记发生反应的指示剂后检测。
14.一种权利要求13的方法，所述方法为ELISA方法，并使用所述抗体作为包被抗体。
15.一种权利要求13的方法，包括以下步骤 a)将待测样品经SDS-PAGE后转至硝酸纤维素膜并使所述膜与所述抗体接触； b)加入突光标记的对应ニ抗； c)用成像系统对所述膜成像。
16.ー种Hl流感病毒的诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求7到9任ー项的抗体。
17.权利要求7到11任ー项的抗体在制备Hl流感病毒的诊断试剂中的应用。
全文摘要
本发明属于流感病毒领域，公开了高度保守的H1型流感病毒血凝素特异性抗原表位及其应用。该高度保守的H1型流感病毒血凝素特异性抗原表位序列如SEQ ID NO1所示。本发明利用人工合成肽库与H1N1pdm流感病人恢复期血清IgG结合筛选反应性强的合成肽。通过合成肽偶联物免疫、免疫印迹鉴定、生物软件Bioedit比对和swiss-model数据库同源建模等方法，确定了一个高度保守的H1亚型流感病毒特异性抗原表位。本发明提供的抗原表位及其抗体可制备H1亚型流感病毒感染的诊断试剂盒。
文档编号C07K16/10GK102702322SQ201110077459
公开日2012年10月3日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者G·弗耐特, 王健伟, 赵荣茂, 郭丽 申请人:中国医学科学院病原生物学研究所