专利名称：预防和治疗pcv-2病毒的肽核酸及其制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预防和治疗PCV-2病毒的肽核酸及其制剂。
背景技术：
猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)是由德国学者Tischer I等1974年首次由多株连续传代的猪肾细胞系(PK-15)中分离得到，实验结果显示，该病毒可以持续感染PK-15细胞，但不引起细胞病变，该病毒于1982年获得命名。根据圆环病毒的致病性和核酸序列的不同，将PCV划分为两个型=PCV-1和PCV-2。目前认为PCV-1不会引起疾病。猪圆环病毒2型(PCV-2)感染是近20年来发现的猪的一种新疾病，该病已经在世界范围内广泛流行，对养猪业的危害日益被人们重视。PCV-2可造成猪断奶后多系统衰竭综合症(Post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、皮炎和肾病综合症(Porcinedermatitisand nephropathy syndrome, PDNS)、繁殖障石寻(Reproductive failure)>A2型先天性震颤(Congenital tremors)、猪呼吸道病复合征(Porcine respiratorydisease complex, PRDC)以及猪增生性坏死性间质性肺炎(Porcine proliferative andnecrotizing pneumonias)等疾病。1991年Clark E G首次报道在加拿大猪场发生断奶仔猪多系统衰竭征(Post-weaning multisystemic wating syndrome, PMWS),此后该病在世界范围内广泛流行，给养猪业带来极大危害，尤其是引起发病猪群免疫抑制而倍受人们关注。我国由郎洪武等于2001年首次报道，从北京、河北的疑似PMWS的发病猪群中分离到PCV-2,王忠田等在对北 京、天津、广东、深圳、山东、山西等地12个规模化养猪场进行圆环病毒流行病学调查时发现，11个猪场有PMWS的发生，表明PCV-2的感染已在我国规模化养殖场普遍存在。PCV-2感染能造成猪的生长缓慢，饲料报酬降低，同时侵害猪的免疫系统，导致机体的免疫力下降，引起其他疾病的大爆发，给世界各国养猪业的发展造成了严重威胁和巨大的经济损失。经过各国研究人员几十年的共同努力，基本清楚了 PCV-2的生物学特性、流行病学、感染的危害，但对其致病机制尚不清楚，同时如何防治PCV-2和研制PCV-2疫苗的成为当前兽医科研人员的研究热点。PCV的分布极为广泛，一般认为，PCV的唯一宿主是猪。病猪和带毒(隐性感染)猪是主要传染源。病毒存在于感染猪的呼吸道、肺、脾和淋巴结中，主要从鼻液和粪便等废物中排出病毒，感染公猪的精液被认为是一种潜在的PCV-2病毒来源。PCV-2 —年四季均可发生，既可接触感染、空气传播，也可经胎盘垂直感染和通过口腔、呼吸道、鼻液、粪便等途径水平传播而感染不同年龄的猪群。育肥猪多表现为阴性感染，不表现临床症状。少数怀孕母猪感染PCV后，可经胎盘垂直感染给仔猪，造成仔猪先天性震颤或断奶仔猪多系统衰竭综合征。PCV常与PPV或猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)混合感染，造成许多附加症状，使疾病的诊断更趋于复杂化和多样化。年龄在5 12周的仔猪感染后多表现为PMWS, 一般于断奶后2 3天或I周开始发病，发病率20 % 60 %，病死率5 % 35 %。到目前为止，PCV-2引起各类疾病的发病机理尚不完全清楚，但许多研究证据表明，猪感染PCV-2可导致机体的免疫抑制，影响猪的免疫功能。PCV-2感染总是与淋巴器官的粒细胞炎性浸润有关。PCV-2感染猪体后在猪体内增殖，导致感染猪发生一系列临床和组织病理学变化，主要存在于淋巴组织、肺、肝和肾等组织器官中，使淋巴组织(淋巴结、胸腺、扁桃体和脾)、肺、肝和肾出现以细胞浸润为主要特征的炎性病理变化和淋巴细胞萎缩。McNeilly等(1996)通过研究PCV感染猪肺泡巨噬细胞体外免疫功能的影响，发现对FC和补体受体或者吞噬作用没有影响。在感染4d后对MHC-1类抗原有上调作用，8d后降低了细胞对MHC-2类抗原的表达。Darwich等将猪血液样品用抗凝剂作用后，再用植物血凝素(PHA)和超抗原葡萄球菌肠毒素B (SEB)作用，PCV-2感染猪形成炎症反应能力受损和细胞因子合成下降，即PCV-2感染猪淋巴细胞和巨噬细胞激活途径存在缺陷。圆环病毒可以诱导淋巴系统中的B细胞凋亡，使患猪处于免疫抑制状态，这是导致混合感染和继发感染的主导因素。Joagnin等认为PCV-2的感染对免疫系统的效应来讲似乎是一把双刃剑:一方面，PCV-2与其他病毒(如PRRSV和PPV)同时实验感染时，这些病毒可以刺激和活化免疫系统，增加了混合感染猪体内的PCV-2的增殖；另一方面，严重的淋巴组织病损，包括淋巴细胞缺失和这些组织中免疫细胞亚群的其他变化，是严重发病猪的规律性特征，因此，PCV-2感染猪对其它免疫原不能产生有效的免疫应答成为本病致病机制的重要原因。Krakowka等对I日龄患病猪进行了试验，发现所有PCV-2和PPV混合感染猪都出现了 PMWS症状，在巨噬细胞中可检测到PCV-2抗原，而PCV-2单独感染猪不能复制出PMWS症状。PCV作为圆环病毒属的代表种，无囊膜，单股环状DNA，病毒粒子直径为17 20nm，呈二十面体对称。病毒粒子由衣壳蛋白和核酸组成，是迄今为止发现的一种最小的动物病毒。在分类地位上属圆环病毒科(Circoviridae)、圆环病毒属(Circovirus)。PCV-1与PCV-2在核苷酸序列上约有76%的同源性。PCV-1基因组为1759bp，PCV-2基因组为1768bp或1767bp。PCV-1有7个ORFs，均编码大于5ku的蛋白质。PCV-2通常含有11个ORFs，预计分别编码1.Sku 35.SKu的蛋白质，各阅读框大小相差悬殊，且大部分ORF都有部分重叠，其中 0RF1、0RF5、0RF7 和 ORFlO 在正义链，0RF2、0RF3、0RF4、0RF6、0RF8、0RF9 和 ORFll位于负义链，这些基因表现为重叠基因，充分利用了病毒有限的遗传物质。研究发现，病毒基因组由2个相对排列的ORF和其间的基因间隔组成，其中较大的ORFl经病毒正向DNA转录，为Rep基因，有945个碱基，编码314个氨基酸，大小为35.6ku，编码病毒复制酶相关蛋白(Itep);较小的0RF2经病毒DNA互补链转录，为Cap基因，含有705个碱基，编码234个氨基酸，编码大小约27.9ku的主要结构蛋白或衣壳蛋白。该结构蛋白构成病毒的核衣壳，其抗原性具有型特异性。PCV相同基因型不同毒株之间序列同源性大于90%，不同基因型毒株之间同源性为68% 79%。Rep蛋白由病毒的正向链转录而成的，是PCV基因中最大的阅读框(ORFl)编码而成，它编码的复制酶蛋白在所有的圆环病毒中高度保守。Rep基因分别编码R印(312个氨基酸，35.6ku)和R印’(168个氨基酸，19.2ku)。Rep蛋白和R印’蛋白是PCV病毒复制所必需的，Rep蛋白单独不能启动病毒复制，必须与R印’蛋白共同作用才能启动PCV的复制。系统发生结果表明，圆环病毒Rep蛋白可能是通过在微粒病毒的Rep蛋白和小RNA病毒样编码的RNA结合蛋白或原核生物的螺旋酶重组作用而产生。PCV-2的Rep基因位于第51 995位核苷酸，含有945个碱基，编码315个氨基酸，编码病毒的复制相关蛋白R印。Rep 185位 211位氨基酸区域内存在PCV-1和PCV-2共有表位。 PCV-1与PCV-2相比较，R印蛋白相对比较保守，氨基酸序列同源性达86 %，这也是两种血清型PCV病毒产生抗原交叉性的主要原因所在。PCV-1R印蛋白仅有一个糖基化位点，位于20 22aa(NpS) ;PCV2R印蛋白则含有 3 个糖基化位点，23 25aa (NPS)，256 258aa (NQT)及 286 288aa (NAT)。Rep 蛋白具有与典型滚环复制(RCR)相关的3个保守基序以及结合dNTps的P环(P-1oop)结构(序列为G-GKs)，这些结构对于维持Rep蛋白的功能至关重要，突变或缺失均会影响病毒的复制，这也进一步证明PCV病毒DNA进行滚环式复制。 Cap蛋白即0RF2，分子量为27.8ku，位于DNA互补链上，编码病毒衣壳蛋白，位于细胞核中，其N端富含精氨酸和碱性氨基酸，编码234个氨基酸。该基因可能是在病毒感染细胞后由宿主所编码的各种蛋白酶的参与下催化合成的中间产物，所编码的蛋白是PCV-2囊膜的主要成分，目前对0RF2的研究已经成为PCV-2研究的热点。PCV-2与PCV-1的0RF2相似，其起始密码子位于第1033位核苷酸或第1034位核苷酸，PCV-1和PCV-2的Cap基因都只有一个糖基化位点，分别位于PCV-2Cap蛋白的143_145aa(NYS)及PCV-1的102-104aa(NYS)。Cap基因转录起点位于第1238个核苷酸，转录产物可连接ORFl的外显子，第737位核苷酸为接翻译的起始位点。Rep基因的启动子精确定位于第1353 1168位核苷酸，没有发现PCV编码蛋白对Cap基因转录具有调控作用。0RF2有702个碱基，分析PCV-1和PCV-2高免血清与病毒Cap蛋白的结合部位，结果表明PCV-1和PCV_2Cap蛋白169 183位氨基酸片段，能与PCV-1和PCV-2高免血清发生特异性结合；PCV_2Cap蛋白65 87位，113 139位和193 207位氨基酸片段，仅与PCV-2高免血清发生特异性结合，而与PCV-1高免血清不发生反应，两种血清型的Cap蛋白虽然有共同的抗原决定簇，但没有抗原交叉性。Cap蛋白169 183位氨基酸区域内，存在PCV-1和PCV-2共有表位；PCV2Cap蛋白65 87位，113 139位和193 207位氨基酸区域内，存在3个或3个以上PCV-2型特异性表位。Cap基因可能是造成病毒遗传特性发生根本性改变的惟一基因，因而推测其与病毒致病性密切相关，通过改变病毒的宿主嗜性及病毒蛋白与细胞蛋白因子的相互作用机制，而使病毒获得不同的致病性。由于Cap蛋白具有以上特性，使其成为在分子水平上诊断PCV-2的最佳抗原，同时它在PCV-2血清学研究中发挥巨大的作用，成为PCV-2研究的热点。反义核酸(antisense nucleic acid)是一段与祀基因(mRNA或DNA)的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反义核酸通过碱基配对方式特异性的与病毒靶基因结合形成杂交分子，从而在复制、转录和翻译水平调节靶基因的表达，或诱导RNase H识别并切割mRNA，进而使其功能丧失。反义核酸包括反义RNA (antisense RNA)和反义DNA (antisense DNA),具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力强等特点。反义核酸作为一种新的抗病毒、抗肿瘤药物，掀起了一场药理学领域的革命，即新的药物受体mRNA通过新受体结合方式(Watson-Crick杂交)、引发新的药物受体结合后反应:(I)RNase H介导的祀RNA的降解；(2)抑制DNA的复制和转录及转录后的加工和翻译等。可以说反义寡核苷酸(ODNs)疗法比传统的药物治疗手段有更高的特异性。从二十世纪70年代末到现在，在这三十年的时间中，反义核酸药物已走出实验室，进入了实际临床应用。特别是第一个反义核酸药物Fomivirsen通过FDA批准上市后,人们对反义疗法尤为关注。反义核酸作用原理基于碱基配对原则，可通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与对相关基因表达的调控。其作用方式可能有:①反义RNA与病毒mRNA结合形成互补双链阻断核糖体与病毒mRNA的结合，从而抑制了病毒mRNA翻译成蛋白质的过程。②反义DNA能与祀基因形成一种三链核酸(triple helix nucleic acid),它通过作用于控制基因转录的转录子、增强子和启动子区，对基因的转录进行调控。③反义核酸与病毒mRNA的结合可阻挡mRNA向细胞质的运输。④反义核酸与病毒mRNA结合后使得mRNA更加易被核酸酶识别降解，从而大大缩短mRNA的半衰期。上述四种作用途径都可表现为对病毒基因表达的抑制或调控，且这种调控是高度特异性的。反义核酸是通过碱基互补配对的原理来识别所打靶的基因，从理论来分析，研究人员以动物细胞为例，其染色体大约有几十亿对碱基，如果4个碱基(A、G、C和T)的数目大致相同，并在整个基因中随机分布，那么按照统计学原理，大于17个碱基的反义核酸与非靶基因杂交的可能性不大，所以长度超过17个碱基的反义核酸分子与靶基因的结合可以说是唯一的，从而使反义核酸具有高度的特异性。研究表明，在细胞内部一个拷贝的基因会产生200-300条mRNA，翻译出10万个具有生物活性的蛋白质分子。传统药物主要作用于有生物功能的蛋白分子的某结构域上的几个作用位点，事实上蛋白的结构是非常复杂的，且在生物体内，活性蛋白的空间结构又是千变万化的，以传统药物有限的几种作用位点来控制靶分子的动态的和整体的功能很难达到理想的效果，因而不难看出传统药物的局限性。由mRNA可翻译出几十到几百个蛋白，反义核酸在mRNA水平对靶基因直接进行调控，这个步骤相当于将传统药物作用放大了数十到数百倍，可见反义核酸的调控是极其经济合理的。毒理学研究表明，反义核酸在体内具有很低的毒性，尽管其在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。与传统药物相比，反义核酸药物具有特异性强，效率高和毒副作用低等优点，在抑制肿瘤生长和抗病毒复制等方面显现出了良好的应用价值。目前已有多个药物进入美国和欧洲市场，另还有30多种反义`核酸药物正在进行临床前期的研究或开发后进入了 1、II和III期实验。由于动物体内存在大量的核酸外切酶，反义核酸若不经过化学修饰，很快就被降解，失去活性。目前对反义核酸的化学修饰有很多方法，常见的有硫代修饰反义核酸及2’-甲氧基修饰反义核酸等。且目前硫代修饰药物的研究最为全面，它可有效抵抗核酸酶的降解，同时可促进核酸酶Rase H的活性，目前这种修饰方法已成功用于临床的反义核酸药物。但这些还只是第一代反义核酸的修饰方法，随着技术的发展与进步，新的修饰途径与方法被开发出来，使得反义核酸的研究进入了第二、三代，其中肽核酸的修饰最为引人关注。肽核酸(peptidenucleic acids,PNAs),是一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA类似物，可序列特异的靶向作用于DNA的大沟槽，其骨架的结构单元为N(2-氨基乙基)-甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接于主骨架的氨基N上。为反义核酸的第二代产品。PCV-2是目前严重危害世界养猪业的重要病原之一。PCV2不仅可造成猪断奶后多系统衰竭综合症、皮炎和肾病综合症、繁殖障碍等诸多类型的疾病，该病毒还能导致免疫抑制，引起继发感染，严重影响养猪业的发展。到目前为止，对该病还没有理想的防控措施，开发预防和治疗PCV2感染的新手段显得尤为迫切，但PCV2在细胞中增殖不引起细胞病变，感染后会弓I起免疫抑制，疫苗研究至今没有根本性突破。
发明内容
本发明的目的是提供一种具备高水平的生物利用度、稳定理化性能及高效安全的疗效的用于预防和治疗PCV-2病毒的肽核酸及其制剂。本发明所提供的肽核酸，由序列I和序列3或序列1、序列2、序列5和序列6所示的肽核酸组成；序列1:5，-AGATCTAGGAGCTCCACATTCGATC-3，；序列2:5，-TAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTG-3，；序列3:5，-TACATTGGTCTTCCAATCACGCTTC-3，；序列4:5，-TTGATAGTATATCCGAAGGTGCGGG-3，；序列5:5，-AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3，；序列6:5’ -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3’。其中，所述肽核酸经过咪唑丙烯酸壳聚糖化学修饰。本发明所提供的另一种肽核酸，由序列5和序列6所示的肽核酸组成；序列5:5，-AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3，；序列6:5，-TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3，。其中，所述肽核酸经过咪唑丙烯酸壳聚糖化学修饰。本发明的肽核酸可以制成肽核酸制剂:1、采用控释制药工艺将经修饰过的肽核酸制备成结肠溶控释微丸制剂；2、采用冷冻干燥制药工艺将经修饰过的肽核酸制备成注射用冻干制剂；3、采用冻干后再制粒工艺将经修饰过的肽核酸制备成口服用水溶性颗粒剂。肽核酸制剂稳定性分析高温:流通蒸汽高温105°C，20分钟灭菌不影响其生物活性。极端温度:50°C存放6个月不影响其生物活性。室温:存放24个月不影响其生物活性。低温:-20°C存放48个月不影响其生物活性。本发明针对PCV-2的Rep和Cap两种主要蛋白基因的保守区域设计的病毒特异性的反义寡核苷酸序列，合成肽核酸以及用壳聚糖进行修饰，使其具备高水平的生物利用度、稳定理化性能及高效安全的疗效。
具体实施例方式主要材料与试剂病毒 毒株PCV-2毒株:WS01株，毒价为105.20TCID50,由楠森兽医诊断技术研究中心实验室提供。细胞株Dulac细胞,楠森兽医诊断技术研究中心实验室提供。实施例1针对PCV-2的肽核酸体外抗病毒效果分析从GenBank数据库检索出PCV-2的基因组，用生物学软件进行序列分析，综合考虑序列的保守性，G+C%含量，碱基分布特点，然后从中挑选出合适的区域设计反义核酸，然后根据反义核苷酸合成肽核酸。采用肽核酸的合成工艺进行肽核酸的人工合成。Rep-ι:5，-AGATCTAGGAGCTCCACATTCGATC-3’Rep-2:5， -TAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTG-3，Rep-3:5’ -TACATTGGTCTTCCAATCACGCTTC-3’Cap-1:5’ -TTGATAGTATATCCGAAGGTGCGGG-3’Cap-2:5， -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3’Cap-3:5’ -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3’1.1以不同浓度分析它们抗病毒效果取生长状态良好的Dulac细胞，用胰酶消化后，铺板于24孔细胞板中，0.5mL/孔(2.0X105个细胞)，5% C02 37°C条件下培养24h后吸去培养液，加入0.1mL的105TCID50PCV-2 WSOl株感染上述细胞，感染后24h，每孔加入300 μ I待筛选药物，以完全培养基作稀释液，肽浓度(0.05 μ Μ, 0.1 μ Μ, 0.2 μ Μ, 0.4 μ Μ, 0.8 μ Μ, 1.6 μ Μ),每个药物梯度设4个平行孔。加药处理24h后收集上清和细胞，运用TaqMan探针Real-time PCR法定量检测各处理组中PCV2病毒拷贝数。同时设病毒感染阳性对照组，空白对照组，细胞阴性对照组。本发明参考Chung等提供的引物，采用real-time PCR定量检测PCV2。弓丨物PCV2-1: 5' -TAGGTTAGGGCTGT-GGCCTTA-3'弓丨物PCV2-2: 5' -TTCTCCCGCACTTTCGGATAT-3'探针PCV2probe:5' -ATCTCATCATGTCCACCGCCCAGGA-3' -fluorescin以下述公式来计算不同的肽核酸对PCV-2病毒复制产生的抑制率。
权利要求
1.一种预防和治疗PCV-2病毒的肽核酸，由序列I和序列3或序列1、序列2、序列5和序列6所示的肽核酸组成；序列 1:5’ -AGATCTAGGAGCTCCACATTCGATC-3’ ；序列 2:5，-TAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTG-3，；序列 3:5，-TACATTGGTCTTCCAATCACGCTTC-3，；序列 4:5’ -TTGATAGTATATCCGAAGGTGCGGG-3’ ；序列 5:5’ -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3’ ；序列 6:5’ -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGAITTC-3’。
2.根据权利要求1所述的肽核酸，其特征在于:所述肽核酸经过咪唑丙烯酸壳聚糖化学修饰。
3.一种预防和治疗PCV-2病毒的肽核酸，由序列5和序列6所示的肽核酸组成；序列 5:5’ -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3’ ；序列 6:5’ -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3’。
4.根据权利要求3所述的肽核酸，其特征在于:所述肽核酸经过咪唑丙烯酸壳聚糖化学修饰。
5.一种预防和治疗PCV-2病毒的肽核酸制剂，其活性成分为权利要求1-4任一所述的肽核酸。
6.根据权利要求5所述的肽核酸制剂， 其特征在于:还包含可药用载体或赋形剂。
全文摘要
本发明公开了一种预防和治疗PCV-2病毒的肽核酸，由序列1和序列3或序列1、序列2、序列5和序列6所示的肽核酸组成；或由序列5和序列6所示的肽核酸组成。本发明还公开了含有所述肽核酸的肽核酸制剂。本发明针对PCV-2的Rep和Cap两种主要蛋白基因的保守区域设计的病毒特异性的反义寡核苷酸序列，合成肽核酸以及用壳聚糖进行修饰，使其具备高水平的生物利用度、稳定理化性能及高效安全的疗效。
文档编号C07K14/00GK103102397SQ20111035182
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者韩健宝 申请人:韩健宝