专利名称：固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法
技术领域：
本发明属于白藜芦醇技术领域，具体涉及白藜芦醇的制备方法。
背景技术：
白藜芦醇(化学名为芪三酚)是含有芪类结构的非黄酮多酚类化合物，是植物在受到应激时自身合成的一种抗毒素，难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂。主要有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗自由基、保护肝脏、保护心血管和抗心肌缺血等功能，被广泛应用于食品保健品、化妆品及医药领域。目前白藜芦醇的生产主要是植物提取法。提取白藜芦醇的植物有葡萄、花生、桑葚、虎杖等。然而，植物中的白藜芦醇含量非常低，使得其分离纯化成本偏高。而白藜芦醇类似物白藜芦醇苷在植物中的含量为白藜芦醇的7 12倍，如果将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，白藜芦醇的产率可大大提高。酶法水解白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，因条件温和，反应产物较单一，产率高，而被广泛采用。现有的制备白藜芦醇的方法，如2008年9月3日公开的公开号为CN101255449的 “β-葡萄糖苷酶在转化白藜芦醇苷制备白藜芦醇中的应用”专利，公开的是以含白藜芦醇苷的植物为原料，先利用微生物法发酵制得β -葡萄糖苷酶，再经酶转化、离心、乙醇提纯而得产品。该方法的主要缺点是①利用微生物法发酵制得的葡萄糖苷酶在水解反应中是以游离状态发挥催化作用，游离状态的酶在水溶液中不稳定，对热、强酸、强碱、高离子浓度、及有机溶剂等均敏感，容易失活。②游离状态的酶难以与反应产物分离，导致产物纯化困难，增加生产成本。③游离状态的酶只能使用一次，酶的用量较大，不利于节约能源。④ 不能连续进行生产，延长了生产周期，对原料的利用率低。
发明内容
本发明的目的是针对现有制备白藜芦醇方法的不足之处，提供一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法。具有操作简单实用、设备通用、酶稳定性好、重复利用率高、节约能源、无有害物质排放，清洁安全，生产成本低，可连续生产等特点。本发明的主要原理是在适宜条件下，以二醛类化合物与接枝赖氨酸壳聚糖微球的游离氨基及β-葡萄糖苷酶的游离氨基发生交联反应，就将游离β-葡萄糖苷酶束缚于接枝赖氨酸壳聚糖微球载体，即制备出固定化酶；固定化酶具备与游离酶同样的水解特性， 可反复使用，连续水解白藜芦醇苷，生成白藜芦醇。实现本发明目的的技术方案是一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂、β -葡萄糖苷酶、白藜芦醇苷和XAD-7HP大孔吸附树脂为原料，先制备出固定化β -葡萄糖苷酶，后装柱成柱式酶反应器，再经连续水解，吸附，洗脱，结晶得到白藜芦醇产品。其具体步骤如下(1)配制β -葡萄糖苷酶缓冲溶液以市售的β -葡萄糖苷酶为原料，按照β -葡萄糖苷酶的质量(mg)缓冲溶液体积(L)比为1 0.5 1.5的比例，将β-葡萄糖苷酶加入缓冲溶液中，搅拌混合均勻，就制备出β-葡萄糖苷酶缓冲溶液。其中，所述的缓冲溶液为PH值6.0 8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。(2)制备固定化β -葡萄糖苷酶第(1)步完成后，以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树为原料，按照赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂的质量(g)第(1)步制备出得β-葡萄糖苷酶缓冲溶液的体积(HiL) 的戊二醛溶液的体积(mL)比为1 10 20 1 3的比例， 先将赖氨酸修饰的壳聚糖微球阳离子交换树脂加入到β-葡萄糖苷酶缓冲溶液中，搅拌吸附1 3小时后再加入戊二醛溶液，反应1 3小时后将反应产物放置于真空过滤器中，进行真空过滤，分别收集滤液和滤渣。对于收集的滤液，用于回收缓冲溶液。对于收集的滤渣， 按照滤渣的质量(g)缓冲溶液体积(mL)之比为1 10 50的比例，用缓冲溶液对糖渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣。再按洗涤后的滤渣的质量(g)缓冲溶液的体积(mL)之比为1 10 50的比例，再用缓冲溶液对洗涤后的滤渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣。如此重复，直至洗涤液中检测不出酶蛋白质为止。最后合并各次收集的洗涤液和第( 步收集的滤液，用于回收缓冲溶液。对于洗涤后的滤渣，即为制得的固定化β-葡萄糖苷酶，用于组装固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器。其中，所述的缓冲溶液为ρΗ值6. 0 8. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(3)制备白藜芦醇苷水解液第( 步完成后，以市售的白藜芦醇苷为原料，先将第( 步制得的固定化葡萄糖苷酶装入夹套保温层析柱中，升温至30 60°C，就组装出固定化β -葡萄糖苷酶柱式反应器，用于水解白藜芦醇苷。再按照市售的白藜芦醇苷的质量(g)乙醇体积浓度为 30 50%的乙醇溶液体积(L)之比为1 0. 5 1. 5的比例，将市售的白藜芦醇苷加入到乙醇溶液中，搅拌至溶解，就制备出白藜芦醇苷溶液，用于制备白藜芦醇水解液。然后，将制得的白藜芦醇苷溶液泵入到组装的固定化葡萄糖苷酶柱式反应器中，控制白藜芦醇苷溶液的泵入速度为固定化β -葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的2 6倍/小时(BV/h)， 进行连续水解反应26 40小时。分别收集固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器的流出液和固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，对于收集的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，可再生利用；对于收集的固定化葡萄糖苷酶柱式反应器的流出液，即为白藜芦醇苷水解液，用于吸附分离白黎芦醇。(4)再生固定化β -葡萄糖苷酶柱式反应器第C3)步完成后，向第C3)步收集的固定化葡萄糖苷酶柱式反应器中，泵入纯净水进行清洗，控制纯净水泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的2 6倍/小时(BV/h)，直至清洗液中无白藜芦醇苷和白黎芦醇时止，分别收集清洗液和清洗后的固定化葡萄糖苷酶柱式反应器。对收集的清洗液，因含有大量的白藜芦醇苷和白藜芦醇，用于下步处理；对收集的清洗后的固定化β -葡萄糖苷酶柱式反应器，即为再生的固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器，可再使用。使用后又用纯净水清洗再生，又再使用。如此使用-清洗再生-再使用……，可反复使用，充分利用固定化β -葡萄糖苷酶柱式反应器， 且清洗液又回收利用。因此，操作简便，又降低了生产成本，并有利于环保。(5)制备白藜芦醇晶体
第(4)步完成后，以市售的活化的XAD-7HP大孔吸附树脂为原料，先将市售活化的XAD-7HP大孔吸附树脂装入中压层析柱中，先泵入第C3)步收集的白藜芦醇苷水解液，控制白藜芦醇苷水解液泵入速度为XAD-7HP大孔吸附树脂柱体积的2 6倍/小时(BV/h)， 直至流出液中出现白藜芦醇为止。分别收集流出液和吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱，对于收集的流出液，含有葡萄糖，用于制备葡萄糖酸。再将收集的吸附白藜芦醇的 XAD-7HP大孔吸附树脂柱泵入等树脂柱体积的蒸馏水进行洗涤，用于洗涤夹杂于树脂间的杂质。分别收集洗涤液及洗涤后的吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱。收集的洗涤液，用于第(3)步配制白藜芦醇苷溶液。对于收集的洗涤后吸附有白藜芦醇的XAD-7HP 大孔吸附树脂柱，按照XAD-7HP大孔吸附树脂质量(g)乙醇体积浓度为50 90%的乙醇溶液体积(mL)之比为1 40 80的比例，向洗涤后的吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱泵入流速为2 6倍树脂体积/小时(BV/h)的乙醇溶液。分别收集洗脱流出液和洗脱吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂。对于收集的洗脱吸附有白藜芦醇的 XAD-7HP大孔吸附树脂，用蒸馏水进行洗涤再生，分别收集洗涤液和洗涤后的XAD-7HP大孔吸附树脂。对收集的洗涤后得XAD-7HP大孔吸附树脂，即为再生XAD-7HP大孔吸附树脂，可再使用。使用后，再用蒸馏水洗涤再生，再次使用，如此可反复使用；然后合并洗脱流出液和再生XAD-7HP大孔吸附树脂的洗涤液，并将该合并液泵入真空浓缩器中，在真空度为-0. 6 -0. 9MPa，温度为75 90°C下，进行真空浓缩，直至浓缩液中无乙醇气味时为止， 分别收集白藜芦醇浓缩液和蒸发液(即回收的乙醇)。对于回收的乙醇，调节其浓度后可再次用于洗脱白藜芦醇；最后将收集的白藜芦醇浓缩液，泵入结晶罐中，进行结晶M 36小时。结晶完成后，进行过滤，分别收集滤渣和滤液。对于收集的滤液，为结晶母液，可用于与第(5)中收集的洗脱流出液和再生XAD-7HP大孔吸附树脂的洗涤液合并后再结晶，再用于制备白藜芦醇晶体。对于收集的晶体，置于真空烘箱中，于60-80°C干燥2-3小时，就制备出纯度高达98-99 %的白藜芦醇晶体产品。本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果(1)本发明生产过程的加工工艺和设备通用性强，操作简单实用。本发明仅使用酶水解、真空过滤、真空浓缩等通用设备及简单工艺，总体节约能源，生产成本低。(2)本发明的生产过程反应条件温和，节约能源；工艺全过程无废物排放，全部物料都采用循环后回收利用，并进一步降低生产成本，有利于保护环境。(3)本发明制备出固定化葡萄糖苷酶催化剂，显著增加了葡萄糖苷酶的稳定性，可在更广泛的条件下使用。固定化葡萄糖苷酶可反复使用，再生效果好，减少了对酶的需求量，再进一步降低了生产成本，有利于可持续发展。(4)本发明实现了白藜芦醇苷在固定化β -葡萄糖苷酶树脂柱中连续进行水解反应，减少了生产周期与工艺步骤，提高了转化效率，降低了生产成本，能实现白藜芦醇的规模化生产与连续生产，便于推广使用。(5)本发明制得的固定化β -葡萄糖苷酶反应器和吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂能反复再生利用，进一步降低了生产成本，并有利于环境保护。本发明可广泛应用于制备白藜芦醇，采用本发明制备出的白藜芦醇产品可广泛应用于食品保健、医药、化妆品等行业中。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
，进一步说明本发明。实施例1—种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，具体步骤如下(1)配制β -葡萄糖苷酶缓冲溶液以市售的β -葡萄糖苷酶为原料，按照β -葡萄糖苷酶的质量(mg)缓冲溶液体积(L)比为1 0.5的比例，将β-葡萄糖苷酶加入缓冲溶液中，搅拌混合均勻，就制备出 β -葡萄糖苷酶缓冲溶液。其中，所述的缓冲溶液为PH值6. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。(2)制备固定化β -葡萄糖苷酶第(1)步完成后，以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树为原料，按照赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂的质量(g)第(1)步制备出的β-葡萄糖苷酶缓冲溶液的体积(mL) 的戊二醛溶液的体积(mL)比为1 10 1的比例，先将赖氨酸修饰的壳聚糖微球阳离子交换树脂加入到葡萄糖苷酶缓冲溶液中，搅拌吸附1小时后再加入戊二醛溶液，反应1小时后将反应产物放置于真空过滤器中，进行真空过滤，分别收集滤液和滤渣。对于收集的滤液，用于回收缓冲溶液。对于收集的滤渣，按照滤渣的质量(g)缓冲溶液体积(mL)之比为1 10的比例，用缓冲溶液对滤渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣。再按洗涤后的滤渣的质量(g)缓冲溶液的体积(mL)之比为 1 10的比例，再用缓冲溶液对洗涤后的滤渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣。 如此重复，直至洗涤液中检测不出酶蛋白质为止。最后合并各次收集的洗涤液和第(2)步收集的滤液，用于回收缓冲溶液。对于洗涤后的滤渣，即为制得的固定化葡萄糖苷酶， 用于组装固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器。其中，所述的缓冲溶液为PH值6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液(3)制备白藜芦醇苷水解液第( 步完成后，以市售的白藜芦醇苷为原料，先将第( 步制得的固定化葡萄糖苷酶装入夹套保温层析柱中，升温至30°C，就组装出固定化葡萄糖苷酶柱式反应器，用于水解白藜芦醇苷。再按照市售的白藜芦醇苷的质量(g)乙醇体积浓度为30%的乙醇溶液体积(L)之比为1 0.5的比例，将市售的白藜芦醇苷加入到乙醇溶液中，搅拌至溶解，就制备出白藜芦醇苷溶液，用于制备白藜芦醇水解液。然后，将制得的白藜芦醇苷溶液泵入到组装的固定化葡萄糖苷酶柱式反应器中，控制白藜芦醇苷溶液的泵入速度为固定化β -葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的2倍/小时(BV/h)，进行连续水解反应沈小时。分别收集固定化葡萄糖苷酶柱式反应器的流出液和固定化葡萄糖苷酶柱式反应器，对于收集的固定化葡萄糖苷酶柱式反应器，可再生利用；对于收集的固定化 β -葡萄糖苷酶柱式反应器的流出液，即为白藜芦醇苷水解液，用于吸附分离白黎芦醇。(4)再生固定化β -葡萄糖苷酶柱式反应器第C3)步完成后，向第C3)步收集的固定化葡萄糖苷酶柱式反应器中，泵入纯净水进行清洗，控制纯净水泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的2倍 /小时(8V/h)，直至清洗液中无白藜芦醇苷和白黎芦醇时止，分别收集清洗液和清洗后的固定化葡萄糖苷酶柱式反应器。对收集的清洗液，因含有大量的白藜芦醇苷和白藜芦醇，用于下步处理；对收集的清洗后的固定化β -葡萄糖苷酶柱式反应器，即为再生的固定化葡萄糖苷酶柱式反应器，可再使用。使用后又用纯净水清洗再生，又再使用。如此使用-清洗再生-再使用……，可反复使用，充分利用固定化β -葡萄糖苷酶柱式反应器，且清洗液又回收利用。因此，操作简便，又降低了生产成本，并有利于环保。(5)制备白藜芦醇晶体第(4)步完成后，以市售的活化的XAD-7HP大孔吸附树脂为原料，先将市售活化的 XAD-7HP大孔吸附树脂装入中压层析柱中，先泵入第C3)步收集的白藜芦醇苷水解液，控制白藜芦醇苷水解液泵入速度为XAD-7HP大孔吸附树脂柱体积的2倍/小时(BV/h)，直至流出液中出现白藜芦醇为止。分别收集流出液和吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱， 对于收集的流出液，含有葡萄糖，用于制备葡萄糖酸。再将收集的吸附白藜芦醇的XAD-7HP 大孔吸附树脂柱泵入等树脂柱体积的蒸馏水进行洗涤，用于洗涤夹杂于树脂间的杂质。分别收集洗涤液及洗涤后的吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱。收集的洗涤液，用于第(3)步配制白藜芦醇苷溶液。对于收集的洗涤后吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱，按照XAD-7HP大孔吸附树脂质量(g)乙醇体积浓度为50%的乙醇溶液体积(mL) 之比为1 40的比例，向洗涤后的吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱泵入流速为 2倍树脂体积/小时(BV/h)的乙醇溶液。分别收集洗脱流出液和洗脱吸附有白藜芦醇的 XAD-7HP大孔吸附树脂。对于收集的洗脱吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂，用蒸馏水进行洗涤再生，分别收集洗涤液和洗涤后的XAD-7HP大孔吸附树脂。对收集的洗涤后得XAD-7HP大孔吸附树脂，即为再生XAD-7HP大孔吸附树脂，可再使用。使用后，再用蒸馏水洗涤再生，再次使用，如此可反复使用；然后合并洗脱流出液和再生XAD-7HP大孔吸附树脂的洗涤液，并将该合并液泵入真空浓缩器中，在真空度为-0. 6MPa，温度为75°C下，进行真空浓缩，直至浓缩液中无乙醇气味时为止，分别收集白藜芦醇浓缩液和蒸发液(即回收的乙醇)。对于回收的乙醇，调节其浓度后可再次用于洗脱白藜芦醇；最后将收集的白藜芦醇浓缩液，泵入结晶罐中，进行结晶M小时。结晶完成后，进行过滤，分别收集滤渣和滤液。 对于收集的滤液，为结晶母液，可用于与第(5)中收集的洗脱流出液和再生XAD-7HP大孔吸附树脂的洗涤液合并后再结晶，再用于制备白藜芦醇晶体。对于收集的晶体，置于真空烘箱中，于60°C干燥2小时，就制备出纯度高达98%的白藜芦醇晶体产品。实施例2一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，同实施例1，其中第(1)步中，β-葡萄糖苷酶的质量(mg)缓冲溶液体积(L)比为1 1，缓冲溶液PH值为7.0。第( 步中，赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂的质量(g) 葡萄糖苷酶缓冲溶液体积(mL) 的戊二醛溶液体积(mL)比为1 15 2，搅拌吸附时间为 2小时，反应时间为2小时，滤渣的质量(g)缓冲溶液体积(mL)之比为1 30，洗涤后的滤渣的质量(g)缓冲溶液的体积(mL)之比为1 30，缓冲溶液pH值为7.0。第(3)步中，升温至45°C，市售的白藜芦醇苷的质量(g)乙醇体积浓度为40% 的乙醇溶液体积(L)之比为1 1，泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL) 的4倍/小时，水解反应时间为33小时。第(4)步中，泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的4倍/小时。第(5)步中，泵入速度为XAD-7HP大孔吸附树脂柱体积的4倍/小时，XAD-7HP大孔吸附树脂质量(g)乙醇体积浓度为70%的乙醇溶液体积(mL)之比为1 60，泵入流速为4倍树脂体积/小时，真空度为-0. 7MPa，温度为83°C，结晶时间为30小时，干燥温度为70°C，干燥时间为2. 5小时，产品纯度为98. 3%0实施例3—种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，同实施例1，其中第(1)步中，β-葡萄糖苷酶的质量(mg)缓冲溶液体积(L)比为1 1.5，缓冲溶液PH值为8.0。第( 步中，赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂的质量(g) 葡萄糖苷酶缓冲溶液体积(HiL) 的戊二醛溶液体积(mL)比为1 20 3，搅拌吸附时间为 3小时，反应时间为3小时，滤渣的质量(g)缓冲溶液体积(mL)之比为1 50，洗涤后的滤渣的质量(g)缓冲溶液的体积(mL)之比为1 50，缓冲溶液pH值为8.0。第(3)步中，升温至60°C，市售的白藜芦醇苷的质量(g)乙醇体积浓度为50% 的乙醇溶液体积(L)之比为1 1.5，泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积 (mL)的6倍/小时，水解反应时间为40小时。第(4)步中，泵入速度为固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器体积(mL)的6倍/小时。 第(5)步中，泵入速度为XAD-7HP大孔吸附树脂柱体积的6倍/小时，XAD-7HP大孔吸附树脂质量(g)乙醇体积浓度为90%的乙醇溶液体积(mL)之比为1 80，泵入流速为6倍树脂体积/小时，真空度为-0. 9MPa，温度为90°C，结晶时间为36小时，干燥温度为80°C，干燥时间为3小时，产品纯度为99%。
权利要求
1. 一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，其特征在于所述方法的具体步骤如下(1)配制β-葡萄糖苷酶缓冲溶液以市售的β-葡萄糖苷酶为原料，按照β-葡萄糖苷酶的质量缓冲溶液体积比为 Img 0.5 1.5L的比例，将β-葡萄糖苷酶加入缓冲溶液中，搅拌混合均勻，其中，所述的缓冲溶液为ρΗ值6. 0 8. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液；(2)制备固定化葡萄糖苷酶第(1)步完成后，以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树为原料，按照赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂的质量第(1)步制备出的葡萄糖苷酶缓冲溶液的体积的戊二醛溶液的体积比为Ig 10 20mL 1 3mL的比例，先将赖氨酸修饰的壳聚糖微球阳离子交换树脂加入到β -葡萄糖苷酶缓冲溶液中，搅拌吸附1 3小时后再加入戊二醛溶液，反应1 3小时后将反应产物放置于真空过滤器中，进行真空过滤， 分别收集滤液和滤渣，对于收集的滤渣，按照滤渣的质量缓冲溶液体积之比为Ig 10 50mL的比例，用缓冲溶液对滤渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣，再按洗涤后的滤渣的质量缓冲溶液的体积之比为Ig 10 50mL的比例，再用缓冲溶液对洗涤后的滤渣进行洗涤，分别收集洗涤液和洗涤后的滤渣，如此重复，直至洗涤液中检测不出酶蛋白质为止，最后合并各次收集的洗涤液和第(2)步收集的滤液，所述的缓冲溶液为ρΗ值6.0 8. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液；(3)制备白藜芦醇苷水解液第( 步完成后，以市售的白藜芦醇苷为原料，先将第( 步制得的固定化葡萄糖苷酶装入夹套保温层析柱中，升温至30 60°C，再按照市售的白藜芦醇苷的质量乙醇体积浓度为30 50%的乙醇溶液体积之比为Ig 0. 5 1. 5L的比例，将市售的白藜芦醇苷加入到乙醇溶液中，搅拌至溶解，然后，将制得的白藜芦醇苷溶液泵入到组装的固定化 β -葡萄糖苷酶柱式反应器中，控制白藜芦醇苷溶液的泵入速度为固定化β -葡萄糖苷酶柱式反应器体积mL的2 6倍/小时，进行连续水解反应沈 40小时，分别收集固定化 β-葡萄糖苷酶柱式反应器的流出液和固定化β-葡萄糖苷酶柱式反应器；(4)再生固定化葡萄糖苷酶柱式反应器第( 步完成后，向第C3)步收集的固定化葡萄糖苷酶柱式反应器中，泵入纯净水进行清洗，控制纯净水泵入速度为固定化β -葡萄糖苷酶柱式反应器体积mL的2 6倍 /小时，直至清洗液中无白藜芦醇苷和白黎芦醇时止，分别收集清洗液和清洗后的固定化 β-葡萄糖苷酶柱式反应器；(5)制备白藜芦醇晶体第(4)步完成后，以市售的活化的XAD-7HP大孔吸附树脂为原料，先将市售活化的 XAD-7HP大孔吸附树脂装入中压层析柱中，先泵入第C3)步收集的白藜芦醇苷水解液，控制白藜芦醇苷水解液泵入速度为XAD-7HP大孔吸附树脂柱体积的2 6倍/小时，直至流出液中出现白藜芦醇为止，分别收集流出液和吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱， 再将收集的吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱泵入等树脂柱体积的蒸馏水进行洗涤，分别收集洗涤液及洗涤后的吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱，对于收集的洗涤后吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱，按照XAD-7HP大孔吸附树脂质量乙醇体积浓度为50 90%的乙醇溶液体积之比为Ig 40 80mL的比例，向洗涤后的吸附白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂柱泵入流速为2 6倍树脂体积/小时的乙醇溶液， 分别收集洗脱流出液和洗脱吸附有白藜芦醇的XAD-7HP大孔吸附树脂，然后合并洗脱流出液和再生XAD-7HP大孔吸附树脂的洗涤液，并将该合并液泵入真空浓缩器中，在真空度为-0. 6 -0. 9MPa，温度为75 90°C下，进行真空浓缩，直至浓缩液中无乙醇气味时为止， 分别收集白藜芦醇浓缩液和蒸发液，最后将收集的白藜芦醇浓缩液，泵入结晶罐中，进行结晶M 36小时，结晶完成后，进行过滤，分别收集滤渣和滤液，对于收集的晶体，置于真空烘箱中，于60-80°C干燥2-3小时，就制备出纯度高达98-99%的白藜芦醇晶体产品。
全文摘要
一种固定化酶连续水解白藜芦醇苷制备白藜芦醇的方法，涉及白藜芦醇的制备方法。本发明以市售的赖氨酸修饰的壳聚糖微球阴离子交换树脂、β-葡萄糖苷酶、白藜芦醇苷和XAD-7HP大孔吸附树脂为原料，先制备固定化β-葡萄糖苷酶，后装柱成柱式酶反应器，再经连续水解、吸附、洗脱、结晶而得产品。本发明生产过程的工艺，设备及操作简单；反应条件温和，节约能源；在生产过程中的物料都采用循环处理回收利用或再生反复使用，无废物排放，有利于环境保护；生产成本低，便于推广应用，有利于可持续发展。本发明可广泛应用于制备白藜芦醇，采用本发明方法制备出的产品，可广泛应用于医药、食品处理、化妆品等行业中。
文档编号C07C39/21GK102492731SQ20111041075
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者周小华, 徐溢, 徐焕焕, 王丹, 苏昱, 赵红波 申请人:重庆大学