专利名称：一种抗her2或/和抗her3抗体蛋白的纯化方法
技术领域：
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种抗HER2或/和抗HER3抗体蛋白的
纯化方法。
背景技术：
随着生物医药技术的发展，越来越多的哺乳动物细胞用于生产治疗性重组蛋白质，比如单克隆抗体、细胞因子、激素、生长因子、其它还有某些酶类、凝血因子等。涉及到的治疗领域也越来越广泛，包括内分泌、心脑血管、外科、血液病、抗肿瘤等等。治疗性重组蛋白的生产过程中，人们常根据每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异通过采用离子交换(IEX)、凝胶过滤 (GF)、疏水(HIC)、反相(RPC)、亲和(AC)等多种方法组合分离出目的蛋白，比如单克隆抗体，从细胞发酵上清液产生后，需要经过多个步骤的纯化过程，才能达到足够的纯度，用于人体的注射。发酵料液的成分非常复杂，而目的蛋白只占其中很小的部分，蛋白纯化步骤越多，目的蛋白的回收率就越低。如市面上销售的抗HER2的单克隆抗体药物Hercept in 是由美国Genentech公司生产，其纯化工艺流程为细胞上清收获、蛋白A层析、低pH病毒灭活、阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析。此工艺的不足有1)层析步骤多，有四个层析过程。2、无病毒过滤步骤。具有潜在病毒风险。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有抗HER2或/和抗HER3纯化方法的问题， 提供了一种抗HER2或/和抗HER3的纯化方法，以便能简化纯化步骤，提高目的蛋白的回收率，且能清除病毒，降低潜在病毒风险。为此，本发明公开了一种抗HER2或/和抗HER3抗体蛋白的纯化方法，包括下列步骤澄清发酵液；亲和层析；酸性pH值病毒灭活；阳离子交换层析；阴离子交换层析；病毒过滤；其中所述酸性pH值病毒灭活步骤和病毒过滤步骤可随意穿插在亲和层析步骤后任一步骤位置。在一些实施例中，所述抗HER2或/和抗HER3抗体蛋白为抗HER2抗体蛋白。在一些实施例中，所述发酵料液的澄清方式为离心、深层过滤或终端微滤中之一或任何组合，可根据发酵料液的状态和处理体积，可采用不同的处理方式或组合。其中优选深层过滤，最优选为采用两级深层过滤，滤膜为Millipore公司DOHC和AlHC滤膜。深层过滤是比较新的一种过滤方式，它采用了疏松多空的纤维素骨架结构，并填充了硅藻土成分，进样端的表面孔径成漏斗状，这些结构摈弃了传统微滤表面截留结构易造成阻塞、过滤效率低的缺点，又具备了离心机所没有的截留小体积细胞碎片的优势，同时依靠硅藻土的吸附作用，能截留高达50 %的DNA和15 %的HCP。在一些实施例中，所述抗HER2或/和抗HER 3抗体蛋白具有的标签蛋白或标签多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(GST-Tag)、六聚组氨酸肽(His-Tag)、Arg-tag、蛋白质A(protein A)、FLAG-Tag和Mr印-tag等。通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His-Tag与Ni-Chelating kpharose柱特异性结合；Arg-tag可结合到阳离子交换树脂SP-S^hadexi ；GST-Tag与交联谷胱甘肽的层析介质结合；所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和fe 因子等，以获得目标蛋白。在一些实施例中，所述亲和层析为蛋白A亲和层析，利用蛋白A对抗体Fc片段高特异性的吸附，能够达到95%以上的抗体回收率和99%以上的纯度。所述蛋白A亲和层析的条件为流速300士 lOOcm/h ；柱高20士2cm ；平衡缓冲液 25mM Tris-HCl+75mM NaCl, pH 7. 2士0. 2 ；洗脱液IOOmM 醋酸钠，pH 3. 6士0.1。所述酸性pH值病毒灭活为调整pH值至微酸性(pH值约3. 7)。在该pH值下，膜病毒的外膜破坏，失去感染性。但是，对于没有外膜的病毒类型，则无灭活效果。所述酸性PH 值病毒灭活步骤为加入20%乙酸，调整pH值到3.7士0. 1，室温放置1-2小时，加入2M Tris 调整PH值到5. 2 士0.2。在一些实施例中，所述阳离子交换层析的条件为流速100-180cm/h;柱高 20士2cm ；预平衡缓冲液100mM醋酸盐缓冲液加IM NaCl, pH 5. 0士0. 4 ；平衡缓冲液50mM 醋酸盐缓冲液，PH 5. 2士0. 2 ；洗脱液260mM醋酸盐缓冲液，pH 6.0士0.2。样品pH为 5. 2士0. 2，电导为 2. 0-3. OmS/cm。阳离子交换层析的原理是分子表面带正电荷的区域和层析填料上带负电荷的基团，通过异性电荷的静电吸引力进行结合。不同的分子表面带电程度决定了其静电结合力的强度，从而在层析过程中得到分离。抗体分子表面往往具有带大量正电荷的区域，其结合填料的能力高于一般的杂质，例如大部分宿主蛋白、内毒素、DNA、脱落的ftOtein A等。此外，阳离子交换层析还能有效地去除抗体聚合物，异构体等杂质。阴离子交换层析往往采用流穿模式，即蛋白流过层析柱而杂质被结合在层析柱上。通过阴离子交换层析这一个步骤，蛋白进一步被去除残余的DNA、潜在的病毒、宿主蛋白、内毒素等杂质，使经过此步骤纯化的蛋白溶液完全符合质量要求。在一些实施例中，所述阴离子交换层析的条件为流速180-360cm/h;柱高 20士2cm ；预平衡缓冲液50mM Tris-HCl 加 IM NaCl，pH 8. 0士0. 4 ；平衡缓冲液50mM Tris-HCl加IOmM NaCl, pH 8. 0 士 0. 2 ；样品阴离子交换层析洗脱蛋白，调整pH到 8. 0 士0. 2，电导 3. 0-5. OmS/cm。在一些实施例中，所述病毒过滤为一步20nm孔径的病毒过滤，确保任何可能存在的病毒颗粒都被去除。由于病毒颗粒的直径往往都大于20nm，病毒经过该过滤步骤，能够稳定可靠地被去除(> 4个log值的去除率)。用压缩空气(2. 0-2. 2Bar)将阴离子交换层析后样品，滤过病毒过滤膜。
本发明所述方法具有如下优点1)层析步骤减少为三步，提高了生产效率，减少了生产成本。幻增加了病毒过滤过程，提高了安全性。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。1.发酵液上清的收获采用两级深层过滤的方法。发酵液嘉和生物药业的细胞株所表达产生的含有抗HER2单克隆抗体的发酵液。滤膜=Millipore公司DOHC和AlHC滤膜。(也可以采用其他厂家的深层过滤滤膜)过程使用前用纯化水排空滤器中气体，并充分浸润滤器；发酵液过滤前取样测浊度，利用蠕动泵在100-300LMH的流速使发酵液通过滤器；发酵液过滤完后向膜包通入空气排空膜包中残留液体，过滤后的料液混合均勻后取样测量浊度。5个批次的澄清结果
权利要求
1.一种抗HER2或/和抗HER3抗体蛋白的纯化方法，包括下列步骤a)澄清发酵液；b)亲和层析；c)酸性pH值病毒灭活；d)阳离子交换层析；e)阴离子交换层析；f)病毒过滤；其中所述酸性PH值病毒灭活步骤和病毒过滤步骤可随意穿插在亲和层析步骤后任一步骤位置。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于所述抗HER2或/和抗HER3抗体蛋白为抗HER2抗体蛋白。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于所述澄清方式为离心、深层过滤或终端微滤中之一或任意两种或两种以上组合。
4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于所述深层过滤为两级深层过滤，滤膜为Millipore公司DOHC和AlHC滤膜。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于所述亲和层析为蛋白A亲和层析。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于所述蛋白A亲和层析的条件为流速 300士 100cm/h ；柱高:20士2cm ；平衡缓冲液:25mM Tris-HCl+75mM NaCl, pH 7. 2士0· 2 ；洗脱液IOOmM 醋酸钠，pH 3. 6 士0.1。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于所述酸性pH值病毒灭活步骤为加入 20%乙酸，调整pH值到3. 7士0. 1，室温放置1-2小时，加入2M Tris调整pH值到5. 2士0. 2。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于所述阳离子交换层析的条件为流速100-180cm/h ；柱高20 士 2cm ；预平衡缓冲液IOOmM醋酸盐缓冲液加IM NaCl，pH 5. 0士0. 4 ；平衡缓冲液50mM醋酸盐缓冲液，pH 5. 2士0. 2 ；洗脱液260mM醋酸盐缓冲液， pH 6. 0士0. 2 ；样品 pH 为 5. 2士0. 2，电导 2. 0-3. OmS/cm。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于所述阴离子交换层析的条件为流速 180-360cm/h ；柱高20士2cm ；预平衡缓冲液50mM Tris-HCl 力卩 IM NaCl, pH 8. 0士0. 4 ；平衡缓冲液50mM Tris-HCl加IOmM NaCl,pH 8. 0士0. 2 ；样品阴离子交换层析洗脱蛋白，调整 pH 到 8. 0 士0. 2，电导 3. 0-5. OmS/cm。
全文摘要
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种抗HER2或/和抗HER3抗体蛋白的纯化方法。本发明公开了一种抗HER2或/和抗HER3抗体蛋白的纯化方法，包括下列步骤澄清发酵液；亲和层析；酸性pH值病毒灭活；阳离子交换层析；阴离子交换层析；病毒过滤；其中所述酸性pH值病毒灭活步骤和病毒过滤步骤可随意穿插在亲和层析步骤后任一步骤位置。本发明所述方法具有如下优点1)层析步骤减少为三步，提高了生产效率，减少了生产成本。2)增加了病毒过滤过程，提高了安全性。
文档编号C07K16/28GK102492040SQ20111045283
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者徐志豪, 王威, 陈霖杰 申请人:嘉和生物药业有限公司