专利名称：莽草酸的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种从西藏八角(Illicium griffitii)的果实(种子和果皮)中提取高纯度的(3R，4S，5R)-(-)-3，4，5-三羟基-I-环己烯羧酸(L-莽草酸)的方法。本发明还涉及一种制备高纯度莽草酸的方法，所述莽草酸可用于生产禽流感药物达菲(奥塞米韦)。更具体地，本发明涉及通过使用溶剂再结合使用醇(例如甲醇、乙醇或丙醇)的结晶技术从西藏八角(Illicium griffithii)的果实中分离天然左旋L-莽草酸,所述西藏八角产自印度东北部阿鲁纳恰尔邦(Arunachal Pradesh),所述溶剂选自己烧、石油醚、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或两种或更多种溶剂的组合。任选地而不是必需地，有机酸例如乙酸也可用于重结晶目的。
背景技术：
·莽草酸可用作抗菌剂、抗真菌剂、除草剂的原料以及作为营养物质。最初，从日本大茴香(Japanese star anise)(植物名称-八角茴香(Illicium anise)八角茴香科)中分离痕量的莽草酸。后来，发现在许多植物中产生极痕量的莽草酸。然后，发现莽草酸是植物和微生物普通或莽草酸盐/酯途径中的中间代谢物。然而，发现世界上仅两种植物物种累积更多量的这种多羟基芳族酸，即大茴香(植物名称八角茴香，八角茴香科)和枫香树(植物名称-北美枫香(Liquidambar styracifIu))的种子中。尽管有42种八角属的物种是天然可获得的，但仅有一种物种(即八角茴香)可用于制备莽草酸，且产率最大为7% w/w。西藏八角(Hook. f. & Thoms.)属于八角茴香科,且是世界上最常见的八角属物种之一。在阿鲁纳恰尔邦，当地人将其称为‘Lissi’。其是一种小型到中型的树，生长于西卡门县(West Kameng)、达旺(Tawang)、洛西特县(Lohit)和下苏班西里县(Lower Subansiri)地区的亚热带和温带阔叶林，在西卡门县(West Kameng)地区的邦迪拉(Bomdila)分布广泛。西藏八角的果实在香料工业中使用。(参考文献R. Duchok, K. Kent, A. DeviKhumbongmayum, A. Paul和M. L. Khan;阿鲁纳恰尔邦温带阔叶林的与干扰梯度有关的人口结构和药用树西藏八角的再生状态(Population structure and regeneration statusof medicinal tree Illicium griffithii in relation to disturbance gradients intemperate broad-leaved forest of Arunachal Pradesh);《现代科学》，第 89 卷，第 4期，2005年8月25日，第673页)。参考美国专利3，546，072，其中Araki等公开了可通过在培养基(发酵液)中培养产生5-脱氢莽草酸的棒状杆菌属的微生物来制备5-脱氢莽草酸,所述培养基包含碳源、氮源、无机材料和营养素。将制得的并累积的5-脱氢莽草酸从培养基中分离，过滤后通过调节pH并加入活性碳，以除去微生物细胞。所述活性炭吸收所述5-脱氢莽草酸，并用98%的乙醇洗脱。该洗脱物在减压条件下浓缩，然后产物从乙醇中沉淀出来。该参考文献没有暗示或揭示使用有机酸例如乙酸来促进高纯度莽草酸晶体从水性发酵液中沉淀出来。参考美国专利4，769，061，其中Comai揭示了转基因植物，植物的基因组中包括了变异的草甘膦抗5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶的编码基因。该文献没有暗示如何从这种转基因植物的组织中分离莽草酸。参考美国专利5，214，165,其中Sutherland等涉及了具有抗菌活性、抗真菌活性和除草活性的6-氟莽草酸衍生物。该文献没有暗示使用转基因微生物或使用草甘膦加入发酵过程以增加莽草酸的产出。该文献也没有暗示使用有机酸以辅助从发酵液中分离莽草酸。然而，该文献揭示了一类可用于该发明方法的PCCA。参考美国专利5，605，818，其中Katsumata等揭示了一种通过使用培养在介质中的棒状杆菌属或短杆菌属的突变菌株来制备芳族氨基酸(例如色氨酸)的方法。这些突变菌株能够产生需要的芳族氨基酸，并且还具有比亲本菌株更高的转酮酶(transketolase)活性。所需的芳族氨基酸在培养过程中累积并由此回收。该文献没有暗示使用有机酸从肉汤中分离所需的PCCA。该文献揭示了多种可产生发酵液的微生物，所述发酵液可用于该发明。
参考题为“使用温度浮动变化复合化提取和转移反提取回收莽草酸”("Recoveryof shikimic acid using temperature-swing complexation extraction anddisplacement back extraction”)的文章，该文章发表于《分离与纯化》(Isolation &Purification), 1994年,第2卷,第75-82页,其中Miles等揭示了一种从水溶液中除去莽草酸的方法。该Miles等人的方法的完成是通过使用溶解于正庚醇或正丁醇的三月桂胺进行溶剂提取并使用油酸反提取至水中，以从有机相中将莽草酸转移出来。该文献着重于开发一种通用的从发酵液中回收代谢酸的方法。然而，其没有揭示使用乙酸(其被添加至浓缩的发酵液)以促进莽草酸从发酵液中沉淀出来。1993年2月的《合成》(Synthesis)第179-193页Campbell等的题为“莽草酸、分支酸及相关化合物的生物合成与合成”(〃The Biosynthesis and Synthesis of ShikimicAcid, Chorismic Acid and Related Compounds")的文章揭不了不同于草甘勝的化合物可干扰莽草酸途径。该文章还良好地描述了葡萄糖衍生的莽草酸途径和各种困难的化学合成莽草酸的方法。该文章没有暗示关于通过使用浓缩的乙酸、乳酸和/或丙酸从反应混合物中分离高纯度的PCCA。参考杂志题为“化学合成莽草酸及其类似物”("Chemical Synthesis of ShikimicAcid and Its Analogues"),发表于四面体报导(Tetrahedron Report),第 54 卷第 449 期(1998年)，第4697-4753页，其中，Jiang等揭示了该复合物及合成莽草酸及其类似物的艰难任务。Jiang等人与Campbell等人一样,没有揭示本发明。参考美国专利6，794，164，其中Malmberg等公开了一个发明，其涉及利用在酸(例如乙酸、乳酸和丙酸)中结晶，以从低纯度水溶液中获得高纯度多羟基环状羧酸(PCCA)。优选的PCCA是莽草酸，优选的结晶酸是乙酸。本发明方法特别适合于从发酵液中分离莽草酸。可参考美国专利申请20030138920，其中Malmberg等公开了一个题为“多羟基环状羧酸的分离方法”的发明。该发明涉及使用结晶酸(例如乙酸、乳酸和丙酸)以从低纯度水溶液中获得高纯度多羟基环状羧酸(PCCA)。优选的PCCA是莽草酸，优选的结晶酸是乙酸。本发明方法特别适合于从发酵液中分离莽草酸。在网上的百科全书www. en. wikipedia. com中公开的一份报告中，从中国大茴香中提取莽草酸通常的产率为3-7%。在同一份报告中还发现，莽草酸的另一个来源是在北美大量发现的枫香树果实的种子，从该来源得到的莽草酸的产率仅为I. 5%。还可参考公开的报告〔Shende Jiang和Gurdial Singh,莽草酸及其类似物的化学合成，四边形报告(Tetrahedron report)第449期，四边形(Tetrahedron)54 (1998) 4697-4753〕，其中描述了化学合成莽草酸及其类似物的各种方法。然而，这些方法因为低产率和高生产成本而不适合。在制药工业中，从中国大茴香中获得的莽草酸几乎是仅有的用于生产达菲(奥塞米韦)的基底材料。达菲是可用于治疗禽流感病毒H5N1弓I起的禽流感疾病的唯一廉价的药物。目前达菲是根据瑞士的罗氏公司的技术以莽草酸为开始原料生产的。目前，由于近来禽流感的爆发，达菲在全球65个国家都有需求。据估计，每年所需的达菲将价值11亿至12亿瑞士法郎。(David Bradley,控制流感大流行中细菌的明星角色？ (Star role forbacteria in controlling flu pandemic )自然综述药物发现(Nature Reviews Drug Discovery) , 2005, 4 (12), 945-946.)。据报道，三酰基莽草酸衍生物可通过影响花生四烯酸的代谢而抑制血小板聚集和血栓(F. Huang;Q. Xiu; J. G Sun;H. Enrique;在大鼠中三乙酰基莽草酸的抗血小板和抗血栓形成作用(Anti-platelet and anti-thrombotic effects of triacetyl shikimic acidin rats);心血管药理学学报(Journal of cardiovascular pharmacology) , 2002,第 39卷，第2期，第262-270页)。根据http://en.wikipedia. org/wiki/Shikimic acid中的一份报告，在制药工业中，从中国大茴香中获得的莽草酸是用作生产达菲(奥塞米韦)的原料。尽管莽草酸存在于大部分自养生物中，但它是一个生物合成中间体，并通常以极低的浓度发现。从中国大茴香中获得莽草酸的低分离产率是2005年奥塞米韦短缺的原因。还可从枫香树果实(北美枫香)的种子中提取莽草酸，所述枫香树在北美丰富，产率约为1.5%，因此仅4kg的枫香树种子就足以获得14包达菲。相比之下，已报道大茴香产出3-7%莽草酸。近来大肠杆菌的生物合成途径已得到增强，使得生物体可以积累足够的材料用于商业(David Bradley,控制流感大流行中细菌的明星角色(Star role for bacteria in controlling flu pandemic)自然综述药物发现(Nature Reviews Drug Discovery) , 2005, 4 (12), 945-946.)根据www. livemint. com网站上公开的一份报告，中国政府目前已实施限制出口莽草酸。据报道，使用GC、GC/MS和13C-NMR谱图对从越南收获的一种类型的西藏八角(短花絮梗)的几个部分中得到的精油的化学组成进行研究。这些精油主要包含氧合苯丙素，主要为黄樟素(51.6-65.3%)和4-甲氧基黄樟素(19. 6%,根皮油)。来自地上部分的油和树根皮的油区别显著(精油研究学报JE0R(Journal of Essential Oil Research:JE0R),一月 / 月，2005,由 Tam, Nguyen Thi, An, Ha Lai, Bighelli, Ange, Muselli, Alain, Casanova, Joseph)。莽草酸(3，4，5-三羟基-I-环己烯-I-羧酸)有三个手性中心，这使得可能存在六种不同的光学异构体。根据本发明生产的一种优选的产物是如结构式I的天然左旋L-莽、草酸。
权利要求
1. 一种从西藏八角的果实中提取高纯度L-莽草酸的方法，所述方法包括以下步骤 1.使用风力研磨机将西藏八角的果实粉末化； 使用索式抽提器或索式抽提器类型的装置、用有机溶剂对步骤(i)中所得的粉末状果实进行提取，以获得脱脂的植物材料； iii.用溶剂对步骤(ii)中所得的脱脂植物材料再次进行提取，以获得脱脂的且经过溶剂提取的植物材料； iv.用极性溶剂对步骤(iii)中所得的脱脂的且经过溶剂提取的植物材料进行提取，以获得溶剂提取物； V.在压力为10-100毫巴、温度为30-100°C的条件下对步骤(iv)中所得的溶剂提取物进行蒸馏，以获得粗莽草酸； vi.将步骤(V)中所得的粗莽草酸溶解于醇中； vii.在温度范围为25°C至醇的沸点，或至90°C的条件下，加热并搅拌步骤(vi)中所得的浆液10-120分钟； viii.在温度范围为O至-10°C的条件下冷却步骤(vii)中所得的溶液，并保温2-6小时； ix.对步骤(viii)中所得的冷却的溶液进行过滤，然后用甲醇水溶液或乙酸水溶液进行重结晶，以获得纯的晶体莽草酸。
2.如权利要求I的步骤(ii)所述的方法，其特征在于，所述用于使果实脱脂的有机溶剂是己烷或石油醚。
3.如权利要求I的步骤(iii)所述的方法，其特征在于，所述用于从果实中除去半极性化合物的溶剂选自下组乙醚、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷或氯化烃溶剂，更优选为氯仿。
4.如权利要求I的步骤(iv)所述的方法，其特征在于，所用的极性溶剂选自下组乙酸甲酯、乙酸乙酯、类似的脂肪酸酯、甲醇、乙醇、丙醇或它们的组合。
5.如权利要求I的步骤(vi)所述的方法，其特征在于，所用的醇选自下组甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或它们的组合。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，高纯度的L-莽草酸的产率范围为12-18%w/wo
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，L-莽草酸可用于生产禽流感药物达菲(奥塞米韦)，并可作为抗菌剂、抗真菌剂、除草剂的原料以及作为营养物质。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，通过以下步骤将L-莽草酸从干燥的粉末状西藏八角的果实中分离使粉末状的果实脱脂，用甲醇、乙醇或丙醇进行提取，从提取溶液中除去所述溶剂，并用氯仿清洗粗固体，然后在真空条件下对粗固体莽草酸进行干燥。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，L-莽草酸通过以下步骤进行制备使用任意的超临界萃取仪、用超临界二氧化碳(CO2)对西藏八角的果实进行提取，从提取物中除去CO2，用己烷或石油醚和氯仿清洗固体提取物，再用氯仿清洗以除去脂肪和油类物质，然后在真空条件下使固体莽草酸干燥，并从甲醇水溶液或乙酸水溶液中重结晶，得到纯的莽草酸。
10.如权利要求I所述的方法，其特征在于，L-莽草酸通过以下步骤进行制备用沸水对西藏八角的果实进行提取，用己烷或石油醚清洗水提取物，再用氯仿清洗以除去脂肪和 油类物质，然后在减压、50-70°C的条件下通过蒸馏除去水，并从甲醇的水溶液中重结晶。
全文摘要
本发明涉及从西藏八角果实中获得的莽草酸的制备。本发明方法特别适合于从西藏八角果实(种子和果皮)中分离莽草酸。产率为12-18%w/w。莽草酸可用作生产治疗禽流感的奥塞米韦(达菲)的原料。据报道，其三酰基衍生物还可通过影响花生四烯酸的代谢而抑制血小板聚集和血栓。至今已知的从大茴香(八角茴香)和枫香树(北美枫香)的果实中制备莽草酸的商业方法，分别仅得到3-7％和1.5％的产率。国际市场上莽草酸的价格在45.00-1000.00美元每千克之间根据需求而变化。另外，根据www.livemint.com网站上公开的一份报告，中国政府目前已实施限制出口莽草酸。
文档编号C07C62/32GK102791671SQ201180013675
公开日2012年11月21日 申请日期2011年3月9日 优先权日2010年3月12日
发明者D·K·罗伊, J·博拉, M·博尔多罗伊, N·C·巴鲁阿, P·G·拉奥, S·C·杜塔 申请人:科学工业研究委员会