专利名称：发酵黄瓜籽多肽的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵黄瓜籽多肽的制备方法及其用途。
背景技术：
多肽是一种与生 物体内各种细胞功能都相关的生物活性物质，是由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成的化合物，包括植物多肽和动物多肽。研究认为，天然生物活性肽具有以下特点1.天然性和安全可靠性；2.具有多种营养成分和生物活性；
3.无毒副作用。微生物具有强大的富集钙的能力，能产生一些能和钙络合的蛋白，通过与钙络合以有机态存在。在食用菌中矿质元素90%以上以有机态存在，具有良好的稳定性，便于储存、运输及更好地与其他成分相配伍，其中大部分与蛋白、糖和脂肪类物质结合，有利于矿质元素的吸收和利用。骨质疏松是中老年人的一种常见病和多发病。人体钙在漫长的过程中丢失，将导致或引起骨质疏松、骨质增生及各类骨折，以及高血压、冠心病、结石、老年痴呆，并可能增加恶性肿瘤的发病率。调查发现，我国65岁以上的老年人中，约有21%的男性和60%的女性患有骨质疏松，80岁以上的老年人则100 %都有骨质疏松，可见优良的补钙制剂市场需求人群相当多。目前市场上常用的钙剂有无机钙类及其制剂、有机钙类及其制剂、中药钙类及其它。其中无机钙类(如碳酸钙)是所有药用钙盐中含钙量最高的一种，且价格低廉，是目前应用最广的补钙剂，胃酸缺乏者会影响其吸收；有机钙类(葡萄糖酸钙)的水溶性好，但吸收率低；中药类钙剂的原料大多采用动物骨骼、海洋生物的脊椎、贝壳等，碱性较强，对胃肠刺激大，如果这些生物受到污染，体内可蓄积大量重金属，易造成二次中毒。另外，雌激素替代疗法可预防绝经后妇女骨量减少并降低骨质疏松性骨折的发生，但长期应用对生殖系统存在潜在的致癌风险。因此，开发具有自主知识产权、可用于预防和治疗骨质疏松症、安全、高效、低毒的新型药物和保健食品具有重大的经济效益和社会效益。多肽可以来源于动物和植物。骨肽是从动物的骨骼中提取出来的小分子多肽类物质，已被证实其能够改善骨的代谢、促进骨折愈合，能够预防和治疗骨质疏松，并具有良好的镇痛和消炎作用。许多植物中也含有多肽类物质，具有较好的生物活性，有些植物多肽已被应用于生产和科研工作当中，如大豆多肽等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵黄瓜籽多肽的制备方法及其用途。发酵黄瓜籽多肽的制备方法如下一、按照质量与体积比为Ig : 2 IOmL的比例将发酵黄瓜籽粉加入到有机溶剂中，在室温超声提取20 60min或者在0 20°C浸泡18 24h，过滤，弃去滤液，将滤渣干燥，得到脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉；二、按照质量与体积比为Ig : 4 20mL的比例将脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉加入到PH值为4. 0 9. 0的醋酸-醋酸钠缓冲液或pH值为4. 0 9. 0的磷酸盐缓冲液中，在4°C搅拌2 4h或者在4°C浸泡24 36h，然后以3000 6000转/分的速度离心，取上清液，将上清液经过分子量50000道尔顿的超滤膜超滤，再经过10000道尔顿的超滤膜超滤，浓缩滤液，冷冻干燥或喷雾干燥，即得发酵黄瓜籽多肽；步骤一中所述的有机溶剂为石油醚、正己烷或乙醚。发酵黄瓜籽多肽的制备方法如下
一、按照质量与体积比为Ig : 2 IOmL的比例将发酵黄瓜籽粉加入到有机溶剂中，在室温超声提取20 60min或者在0 20°C浸泡18 24h，过滤，弃去滤液，将滤渣在40°C以下干燥，得到脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉；二、按照质量与体积比为Ig 2 5mL的比例将脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉加入水中，再加入复合酶，复合酶用量为脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉质量的I % 4%，在pH值为6 8、温度为40 60°C的条件下,定向酶解4 IOh,然后在80 90°C保温5 20min,在3000 5000转/分钟的转速下离心，收集上清液，得到小肽液；三、将小肽液经10000道尔顿的超滤膜超滤，浓缩滤液，冷冻干燥或喷雾干燥，即得发酵黄瓜籽多肽；步骤一中所述的复合酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及中性蛋白酶中的两种或三种按任意比例组成；步骤一中所述的有机溶剂为石油醚、正己烷或乙醚。本发明的发酵黄瓜籽多肽用于预防和治疗骨质疏松。本发明的发酵黄瓜籽多肽安全可靠，无毒副作用，能够促进成骨细胞的增殖，并能降低碱性磷酸酶活性，改善骨质疏松症状，可起到预防和治疗骨质疏松、促进骨骼发育的作用。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式发酵黄瓜籽多肽的制备方法如下一、按照质量与体积比为Ig : 2 IOmL的比例将发酵黄瓜籽粉加入到有机溶剂中，在室温超声提取20 60min或者在0 20°C浸泡18 24h，过滤，弃去滤液，将滤渣干燥，得到脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉；二、按照质量与体积比为Ig : 4 20mL的比例将脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉加入到PH值为4. 0 9. 0的醋酸-醋酸钠缓冲液或pH值为4. 0 9. 0的磷酸盐缓冲液中，在4°C搅拌2 4h或者在4°C浸泡24 36h，然后以3000 6000转/分的速度离心，取上清液，将上清液经过分子量50000道尔顿的超滤膜超滤，再经过10000道尔顿的超滤膜超滤，浓缩滤液，冷冻干燥或喷雾干燥，即得发酵黄瓜籽多肽。本实施方式中发酵黄瓜籽粉的制备方法如下黄瓜籽完全浸泡于水中10 20小时，过滤，向浸泡后的黄瓜籽中加入占浸泡后的黄瓜籽总重量5% 10%的碳酸钙得到混合物，装袋，每个袋里的混合物为200 300g，在温度为121 °C条件下灭菌40分钟，冷却至室温，然后向每个袋中接入3mL浓度为I X IO5 IX IO8CfuAiL的侧耳菌菌液，在25°C 30°C下发酵25-35天，真空干燥，粉碎，即得到发酵黄瓜籽粉。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中所述的有机溶剂为石油醚、正己烷或乙醚。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中按照质量与体积比为Ig SmL的比例将发酵黄瓜籽粉加入到有机溶剂中。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中在10°C浸泡18 24h。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五本实施方式发酵黄瓜籽多肽的制备方法如下
一、按照质量与体积比为Ig : 2 IOmL的比例将发酵黄瓜籽粉加入到有机溶剂中，在室温超声提取20 60min或者在0 20°C浸泡18 24h，过滤，弃去滤液，将滤渣在40°C以下干燥，得到脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉；二、按照质量与体积比为Ig 2 5mL的比例将脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉加入水中，再加入复合酶，复合酶用量为脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉质量的I % 4%，在pH值为6 8、温度为40 60°C的条件下，定向酶解4 IOh,然后在80 90°C保温5 20min,在3000 5000转/分钟的转速下离心，收集上清液，得到小肽液；三、将小肽液经10000道尔顿的超滤膜超滤，浓缩滤液，冷冻干燥或喷雾干燥，即得发酵黄瓜籽多肽。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
五不同的是步骤一中所述的复合酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及中性蛋白酶中的两种或三种按任意比例组成。其它与具体实施方式
五相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
五不同的是步骤一中所述的有机溶剂为石油醚、正己烷或乙醚。其它与具体实施方式
五相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
五不同的是步骤一中按照质量与体积比为Ig SmL的比例将发酵黄瓜籽粉加入到有机溶剂中。其它与具体实施方式
五相同。采用下述实验验证本发明效果实验一发酵黄瓜籽多肽的制备方法如下一、取发酵黄瓜籽进行粉碎过筛，粉碎细度为40目；二、按照质量与体积比为Ig 6mL的比例将发酵黄瓜籽粉加入到正己烷中，在20°C浸泡24h，过滤，弃去滤液，将滤渣干燥，得到脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉；三、按照质量与体积比为Ig SmL的比例将脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉加入到pH值为6. 8的磷酸盐缓冲液中，在4°C搅拌2h，然后以5000转/分的速度离心，取上清液，将上清液经过分子量50000道尔顿的超滤膜超滤，再经过10000道尔顿的超滤膜超滤，浓缩滤液，冷冻干燥或喷雾干燥，即得发酵黄瓜籽多肽。实验二 发酵黄瓜籽多肽的制备方法如下一、取发酵黄瓜籽进行粉碎过筛，粉碎细度为100目；二、按照质量与体积比为Ig SmL的比例将发酵黄瓜籽粉加入到乙醚中，室温超声提取20min，过滤，弃去滤液，将滤渣在40°C以下干燥，得到脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉；三、按照质量与体积比为Ig 4mL的比例将脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉加入水中，再加入复合酶，复合酶用量为脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉质量的2%，在pH值为6. 8、温度为450C的条件下，定向酶解10h，然后在85°C保温lOmin，在4000转/分钟的转速下离心，收集上清液，得到小肽液，其中复合酶为胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按I : I的质量比混合而成；
四、将小肽液经10000道尔顿的超滤膜超滤，浓缩滤液，冷冻干燥或喷雾干燥，即得发酵黄瓜籽多肽。将实验一与实验二制备的发酵黄瓜籽多肽进行如下试验I、发酵黄瓜籽多肽急性毒性试验取昆明种小鼠20只，观察实验一与实验二制备的发酵黄瓜籽多肽(发酵黄瓜籽多肽浓度均为280mg/mL)腹腔注射给药0. 4mL/20g所产生的毒性反应和死亡情况，7日内均无异常反应、无死亡。小鼠急性毒性试验结果是人用量的3000倍，证明该测定样品安全可靠，无毒副作用。2、发酵黄瓜籽多肽对大鼠成骨细胞的增殖作用在无菌的条件下，取新生I日龄Wistar大鼠颅盖骨，剔除附着的结缔组织，PBS液清洗3次，将其置入含有DMEM培养基的培养皿中，剪成0. 5mmX0. 5mm大小碎块，加入质量浓度为0. 25g/100mL胰蛋白酶5mL，置入孵箱中消化30min，弃去胰酶液，加入I. Og/L II型胶原酶5mL，置于孵箱中消化lh，弃去消化液，1000r/min离心lOmin，使细胞沉淀，用PBS冲洗细胞2次，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，24h后换液，以后隔日换液I次。培养至第4 7天，细胞长成致密单层，铺满培养瓶底，进行传代。弃去原培养液，用PBS液冲洗2次，加入0. 25g/100mL胰蛋白酶消化，1000r/min离心lOmin，弃去消化液，再用PBS液冲洗I次，加入培养液，制成细胞悬液。将成骨细胞悬液按I X IO5细胞/mL密度接种于96孔板，待细胞贴壁后，将培养液换成质量浓度lg/100mL胎牛血清的DMEM维持液，同时加入不同浓度的发酵黄瓜籽多肽溶液，使终浓度为含原液的40mg/L、20mg/L、10mg/L、5mg/L、2. 5mg/L、l. 25mg/L,对照组加入等量的维持液，培养24h，48h，72h后，加入MTT 20 y L，于37°C，5 % CO2培养箱中培养4小时，加入二甲基亚砜(DMSO) 150 iiL，用酶标仪于570nm处测定吸光度值。结果见表I和表2。表I发酵黄瓜籽多肽(实验一制备)对大鼠成骨细胞的增殖检测结果(X±S，n=8)
权利要求
1.发酵黄瓜籽多肽的制备方法，其特征在于发酵黄瓜籽多肽的制备方法如下 一、按照质量与体积比为Ig 2 IOmL的比例将发酵黄瓜籽粉加入到有机溶剂中，在室温超声提取20 60min或者在0 20°C浸泡18 24h，过滤，弃去滤液，将滤渣干燥，得到脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉； 二、按照质量与体积比为Ig 4 20mL的比例将脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉加入到pH值为4. 0 9. 0的醋酸-醋酸钠缓冲液或pH值为4. 0 9. 0的磷酸盐缓冲液中，在4°C搅拌2 4h或者在4°C浸泡24 36h，然后以3000 6000转/分的速度离心，取上清液，将上清液经过分子量50000道尔顿的超滤膜超滤，再经过10000道尔顿的超滤膜超滤，浓缩滤液，冷冻干燥或喷雾干燥，即得发酵黄瓜籽多肽。
2.根据权利要求I所述发酵黄瓜籽多肽的制备方法，其特征在于步骤一中所述的有机溶剂为石油醚、正己烷或乙醚。
3.根据权利要求I所述发酵黄瓜籽多肽的制备方法，其特征在于步骤一中按照质量与体积比为Ig SmL的比例将发酵黄瓜籽粉加入到有机溶剂中。
4.根据权利要求I所述发酵黄瓜籽多肽的制备方法，其特征在于步骤二中在10°C浸泡18 24h。
5.发酵黄瓜籽多肽的制备方法，其特征在于发酵黄瓜籽多肽的制备方法如下 一、按照质量与体积比为Ig 2 IOmL的比例将发酵黄瓜籽粉加入到有机溶剂中，在室温超声提取20 60min或者在0 20°C浸泡18 24h，过滤，弃去滤液，将滤渣在40°C以下干燥，得到脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉； 二、按照质量与体积比为Ig 2 5mL的比例将脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉加入水中，再加入复合酶，复合酶用量为脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉质量的1% 4%，在pH值为6 8、温度为40 60°C的条件下，定向酶解4 10h，然后在80 90°C保温5 20min，在3000 5000转/分钟的转速下离心，收集上清液，得到小肽液； 三、将小肽液经10000道尔顿的超滤膜超滤，浓缩滤液，冷冻干燥或喷雾干燥，即得发酵黄瓜籽多肽。
6.根据权利要求5所述发酵黄瓜籽多肽的制备方法，其特征在于步骤一中所述的复合酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及中性蛋白酶中的两种或三种按任意比例组成。
7.根据权利要求5所述发酵黄瓜籽多肽的制备方法，其特征在于步骤一中所述的有机溶剂为石油醚、正己烷或乙醚。
8.根据权利要求5所述发酵黄瓜籽多肽的制备方法，其特征在于步骤一中按照质量与体积比为Ig SmL的比例将发酵黄瓜籽粉加入到有机溶剂中。
9.权利要求I所述发酵黄瓜籽多肽，其特征在于所述发酵黄瓜籽多肽用于预防和治疗骨质疏松。
10.权利要求5所述发酵黄瓜籽多肽，其特征在于所述发酵黄瓜籽多肽用于预防和治疗骨质疏松。
全文摘要
发酵黄瓜籽多肽的制备方法及其用途，它涉及一种发酵黄瓜籽多肽的制备方法及其用途。本发明的目的在于提供一种发酵黄瓜籽多肽的制备方法及其用途。本方法如下一、制备脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉；二、将脱脂干燥的发酵黄瓜籽粉加入到缓冲液中，搅拌或浸泡，离心，超滤，浓缩滤液，干燥，即得。本发明的发酵黄瓜籽多肽用于预防和治疗骨质疏松。本发明的发酵黄瓜籽多肽安全可靠，无毒副作用，能够促进成骨细胞的增殖，并能降低碱性磷酸酶活性，改善骨质疏松症状，可起到预防和治疗骨质疏松、促进骨骼发育的作用。
文档编号C07K1/14GK102643327SQ20121012246
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月24日 优先权日2012年4月24日
发明者方自若, 曹思思, 王伟明, 王昶, 陈丽艳 申请人:黑龙江省中医研究院