专利名称：抗盐酸克伦特罗抗体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及抗盐酸克伦特罗抗体、以盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白为免疫原制备抗盐酸克伦特罗抗体的方法和将抗盐酸克伦特罗抗体应用于盐酸克伦特罗快速检测试剂。
背景技术：
盐酸克伦特罗是一种P —受体激动剂，临床适应证用于哮喘、支气管哮喘、慢塞性肺病、肺炎等疾病。盐酸克伦特罗用于饲料添加剂，具有降低脂肪含量，提高瘦肉率的作用，它潜在的危害就逐渐被人们所认识。虽然盐酸克伦特罗L具有促进动物生长，提高饲料利用率，改善瘦肉率的作用。但该药排泄速率慢，易蓄积在动物组织中，引起消费者发生急性中毒。当人食入有盐酸克伦特罗残留的内脏组织如肝、肾、肺时可能会出现P —受体激动剂的毒副作用。人、畜中毒症状主要有骨骼肌收缩增加，肌肉震颤，四肢和面部肌肉最明显，轻者感觉不适，严重者还可危及生命，因此，盐酸克伦特罗快速检测试剂的开发对动物性食品检测以及人类健康具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种抗盐酸克伦特罗抗体。本发明的第二个目的是提供以盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白为免疫原制备得到抗盐酸克伦特罗抗体的过程。本发明的第三个目的是提供一种盐酸克伦特罗快速检测试剂，是抗盐酸克伦特罗抗体的有效应用。本发明所述的抗盐酸克伦特罗抗体的制备方法为用盐酸克伦特罗人工免疫抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由间接ELISA和间接竞争ELISA两种方法结合筛选出对盐酸克伦特罗有特异性的杂交瘤细胞，从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，分离获得所述抗盐酸克伦特罗抗体。所述盐酸克伦特罗人工免疫抗原为盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物(clen-BSA)，是按以下方法自制得到A.采用重氮偶合反应，盐酸克伦特罗分子上的氨基在亚硝酸钠与盐酸的作用下形成重氮盐，此重氮盐在碱性条件下与牛血清白蛋白(BSA)上的酚羟基反应，形成以偶氮键相联的结合物免疫原。B.将合成产物置入pH值为7. 4、浓度为IOmM(mM为“毫摩尔”，表示浓度)磷酸盐缓冲液4°C搅拌透析2天，每天换液2次，以去除未结合的盐酸克伦特罗或其它小分子物质，透析后_20°C密闭保存。筛选抗体用盐酸克伦特罗-卵清蛋白偶联物同上述方法一样合成。本发明提供的抗盐酸克伦特罗抗体可应用于检测盐酸克伦特罗残留。本发明还提供一种盐酸克伦特罗快速检测试剂。其制备方法为利用胶体金免疫层析的原理，在硝酸纤维素膜上的检测区包被clen-BSA，对照区包被羊抗鼠多克隆抗体。当待测物中有被测的抗原物质(即盐酸克伦特罗)时，待测物中的抗原物质就会与标记胶体金的抗克伦特罗抗体形成Ag-Ab-Au复合物，该复合物中抗体的活性位点将因被样品溶液中的药物占据而无法与T线上药物抗原结合；所以当样品中的盐酸克伦特罗含量达3 u g/L以上时，检测卡上的T线不显色，可以判定为阳性。反之，当样品中盐酸克伦特罗含量在g/L以下或无残留时，检测卡上的T线显色，判定为阴性。目前对盐酸克伦特罗残留检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气-质联用法(GC/MS)、放射免疫分析法(RIA)、气相色谱法(GC)、高效薄层色谱法(HPTLC)、液-质联用分析法(LC/MS)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)等。由于各种检测方法的不同(包括方法学原理，使用的生物制剂的质量，操作人员的素质及使用设备的好坏等)，所得结果并不能说明某种检测方法的优劣。这些方法准确，灵敏度较高，出现假阳性、假阴性的机率较低，其中RIA、ELISA、TLC等方法可以大批量检测，样品不需要经过处理，但需要特定的设备，操作人员需要技术培训；GC/MS、HPLC等方法的设备更加昂贵，操作人员技术要求更高，且检测量少。上述检测方法都要求在实验室中通过仪器完成，几个小时之后才能给出鉴定结果，不适 合现场初筛。盐酸克伦特罗快速检测试剂具有携带方便，不需要设备，操作人员无需技术培训，可现场操作，3 5分钟即可给出结果等优点，非常适合对大批量样本进行现场筛查的工作。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例I抗盐酸克伦特罗抗体的制备方法为以下顺序步骤I 免疫动物选择6周龄，雌性，BALB/C小鼠，将clen-BSA重氮偶联抗原与福氏完全佐剂等量混合、乳化，经腹部皮下多点注射，进行基础免疫。免疫前断尾取血，分离血清，保存在_20°C，作为正常对照小鼠的血清。隔4周，进行第二次免疫，抗原剂量同基础免疫，抗原与福氏不完全佐剂混合、乳化，对小鼠进行加强免疫。隔4周，进行第三次免疫，免疫条件同第二次。第三次免疫后第7 10天，断尾取血，分离血清，用ELISA方法检测血清效价。用生理盐水稀释免疫原对高效价小鼠进行连续加强免疫。经过多次免疫剂量的调试试验得出，免疫剂量在50 U g/0. 2ml/只时为最佳免疫剂量。2.饲养细胞的制备融合前一天，引颈处死小鼠，浸泡于75%酒精lmin。将小鼠仰卧在解剖板上，剪开胸部皮肤，纵向拉开皮肤，暴露腹部用注射器抽取5ml无血清培养液注入腹腔，轻揉腹部I 2min,吸出细胞悬液,移入离心管。用无血清培养液离心洗漆I次(lOOOrpm, 5min)。弃去上清液，加入HAT培养液，均匀悬液，接种于96孔培养板，0. Iml/孔。置37°C、5% C02及饱和湿度条件下培养备用。3.细胞融合和杂交瘤的筛选将50% PEG4000、无血清培养液、HAT筛选培养液置37 °C C02培养箱中预热。收获对数生长期的Sp2/0细胞，用无血清培 养液洗涤3次(1000r/min离心IOmin)，作活细胞计数。无菌条件下分离脾细胞，作活细胞计数。将I X 108脾细胞与I X 107Sp2/0细胞在50ml尖底离心管中混匀，以1000r/min离心lOmin，弃去上清液，用食指轻弹管底，使细胞沉淀松散。将含有脾细胞和Sp2/0瘤细胞的50ml尖底离心管放于38°C融合水杯中，用Iml吸管吸取0. 7mlPEG4000缓慢加入到细胞混悬液中(在Imin内完成)，边加边轻轻地转动试管，使PEG与细胞充分混匀。静置90秒，在2min内加完15ml 37°C预热的无血清培养液，以IOOOr/min离心lOmin，弃去上清液，加入37°C预温HAT培养液充分混匀。接种于前一天含有BALB/C饲养细胞的96孔培养板中，0. Iml/孔。置37°C、5% CO2及饱和湿度条件下培养。融合5天观察有小集落后，用HAT筛选培养液换液，10天后换HT培养液，镜检96孔细胞培养板，融合率达到60%。待培养孔中的杂交瘤细胞生长到约占1/3孔时，在无菌条件下吸取0. Iml培养液，用间接ELISA法检测阳性孔，0D450值大于I时，判定为阳性孔。将阳性孔细胞转至24孔含有巨噬细胞的培养板，待集落长至1/3 1/2孔时，取培养上清液，用间接ELISA法检测特异性。检出无交叉阳性株，进行克隆化培养，同时转入培养瓶。4.腹水制备将6-C8细胞株的生产细胞经复苏后，培养于含15%胎牛血清的DMEM培养液中进行扩增。于两周前给小鼠腹腔注射降植烷(O.Sml/只)。然后将扩增的杂交瘤细胞接种于用降植烷处理过的BALB/C小鼠腹腔内，每只小鼠腹腔内注射0. 5 X 107细胞/ml。7天后小鼠开始产生腹水。我们采用单次处死采集的方法收集腹水，保证腹水的均一性。最多从一只小鼠中可以获得6ml左右的腹水。5.抗体的分离纯化取小鼠腹水置于离心管中，于高速低温离心机中，12000rpm离心lOmin，吸弃上层浑浊液，取中间层上清，保存在EP管中，利用饱和硫酸胺分段盐析法对腹水进行粗纯。粗纯的抗体经透析除盐后过Protein G柱子纯化。先用结合缓冲液平衡Protein G层析柱然后加入混合有结合缓冲液的粗纯抗体溶液，经结合、洗涤和洗脱收集洗脱样品中和后，将样品放在0. 02PB, pH7. 4的缓冲液透析过夜，透析液再离心12000rpm，20min。取上清即为纯化抗体。结果表明制备鼠源抗体,经Protein G柱纯化,抗体纯度达到95%以上；抗体亲和力分别为(3. 29±0. 29) X 108和(4. 96±0. 045) X 108，特异性方面用ELISA检测抗体不识别SM2、SIZ、SMZ、SMM, SD等系列结构类似小分子药物，完全可以满足用于制备检测试纸。实施例2盐酸克伦特罗快速检测试剂的制备方法为以下顺序步骤6.抗体的金标记量取金液50ml，加0. 5mol/L K2CO3 75 yl，调pH值至8. 5，充分搅拌。取克伦特罗抗体(将抗体用0. OlM PBS稀释为lmg/ml) 200 U I加入到金液中搅拌30min。加入25ml10% BSA，搅拌30min。将平衡好的金溶液，装离心管，10000r/min离心30min。弃上清液，加入PH值为8. 2的Tris-HCl缓冲液稀释至25ml，搅拌充分溶解。转移至棕色瓶中4°C保存。7.点金取金标抗体稀释液25ml,上样到喷金机上,设定参数选取喷量为lul/cm。打开气泵，待气压稳定后，将金标抗体均匀喷到30cm*6. 5cm的结合垫上，每张喷好后，及时放入37°C恒温箱至少干燥8小时。切成5mm宽的条状，后封入铝箔带，内装干燥剂，室温存放备用。8.膜的处理用pH 值为 8. 2、浓度为 IOmM 的 PBS 缓冲液对 clen-BSA 进行 2mg/ml、I. 5mg/ml、lmg/ml>0. 5mg/ml系列梯度稀释，分别包被于NC膜。与固定于结合垫的金标抗体(5mmX3mm)进行免疫层析，通过检测不同浓度的标准品，比较不同的显色水平，选择了显色差异性比较大且灵敏度比较高的lmg/mlCL-BSA为NC膜检测线的最佳包被浓度。用pH值为8. 2、浓度为IOmM的PBS缓冲液配制lmg/ml羊抗鼠多克隆抗体溶液10ml，制膜备用。确认要喷膜的检测线、对照线，两者线间距为5mm，且使膜在两控制轴间松紧适度，调整Clongene喷膜仪的脉冲、流量，分别装入足够量已配制好的CL-BSA，羊抗鼠IgG多克隆抗体，开始喷膜。将喷后的硝酸纤维素膜移入37°C恒温干燥箱、IOh后完全干燥取出，装入铝钼袋，内置干燥剂，密封室温存放备用。9.盐酸克伦特罗快速检测试剂的组装首先将包被好的膜贴在PVC背板中间部位，在质控线一段贴上吸水垫，在检测线一端贴上胶体金结合垫，在胶体金结合垫下端贴上样品垫即可。裁切试纸条大板粘贴好后进行裁切，宽度为4. Omm,即为盐酸克伦特罗快速检测试剂。结果表明制备的盐酸克伦特罗快速检测试剂适用于盐酸克伦特罗的快速检测。实施例3用不同的检测方法对盐酸克伦特罗进行检测，对比各方法的检测速度、灵敏度和特异性，如表I所示表I
权利要求
1.抗盐酸克伦特罗抗体，其特征在于以盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白为免疫原制备得到。
2.权利要求I所述的抗盐酸克伦特罗抗体的制备方法，其特征在于用盐酸克伦特罗人工免疫抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由间接ELISA和间接竞争ELISA两种方法结合筛选出对盐酸克伦特罗有特异性的杂交瘤细胞，从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，分离获得所述抗盐酸克伦特罗抗体。
3.根据权利要求2所述的抗盐酸克伦特罗抗体的制备方法，其特征在干所述盐酸克伦特罗人工免疫抗原为盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物，是按以下顺序的步骤自制得到 A.采用重氮偶合反应，盐酸克伦特罗分子上的氨基在亚硝酸钠与盐酸的作用下形成重氮盐，此重氮盐在碱性条件下与牛血清白蛋白上的酚羟基反应，形成以偶氮键相联的结合物免疫原； B.将合成产物置入pH值为7.4、浓度为IOmM磷酸盐缓冲液4°C搅拌透析2天，每天换液2次，以去除未结合的盐酸克伦特罗或其它小分子物质，透析后_20°C密闭保存。
4.权利要求I所述的抗盐酸克伦特罗抗体在盐酸克伦特罗快速检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及抗盐酸克伦特罗抗体、以盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白为免疫原制备抗盐酸克伦特罗抗体的方法，用盐酸克伦特罗人工免疫抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由间接ELISA和间接竞争ELISA两种方法结合筛选出对盐酸克伦特罗有特异性的杂交瘤细胞，从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，分离获得所述抗盐酸克伦特罗抗体，和将抗盐酸克伦特罗抗体应用于盐酸克伦特罗快速检测试剂。对动物性食品检测以及人类健康具有重要意义，可现场操作，3～5分钟即可给出结果等优点，非常适合对大批量样本进行现场筛查的工作。
文档编号C07K16/44GK102659949SQ201210122529
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月24日 优先权日2012年4月24日
发明者殷秀飞, 郑曙剑, 陈国琴 申请人:杭州隆基生物技术有限公司