专利名称：利用寡核苷酸拆分手性药物的方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体的是涉及一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法。
背景技术：
随着现代分析测试技术的发展，人们发现越来越多的医药化合物具有手性结构特征，即具有相互呈镜像但彼此不能重合的对映异构体；手性药物的对映异构体通常表现出不同的生理行为，具有不同甚至截然相反的药效[J. Chromat. A，2001，906，3-33]。因此，研究开发具有光学纯度的手性药物已成为医药技术领域研究的重点和难点之一。制备具有光学纯度的手性药物需要依托不对称合成和手性拆分技术，而关键在于设计和研制具 有高立体选择性的手性拆分剂。目前，优先结晶法、手性膜拆分法、色谱拆分法、酶拆分法等手性拆分技术已经广泛应用于手性药物对映体的研究和制备中[Anal. Chem. 2010,82,4712-4722]。然而现有的这些方法都难以实现单一对映体的高效制备，通常得到的都是不同对映体的混合物。因此，如何调控手性拆分剂以实现对手性药物不同对映异构体的高效分子识别成为当今科学家们亟待研究的一个课题[Nature Materials，2003，2，272-278]。DNA作为生物体内储存遗传信息的重要物质，因其独特的手性结构特征和分子识别特性，已成为材料和信息科学领域研究的热点[Chirality，2007，19 :658-682 ；Science,2008，321，1795-1799]，特别是利用DNA分子组装体为模板引导蛋白质、量子点、过渡金属等构筑单元的准确定位，以形成多尺度结构特征的、功能化超分子组装体[NatureNanotechnol. ,2006,1,190-194]。另一方面,从化学和生物学的角度,利用分子纳米技术可以调控和设计具有特定组成和特定功能的DNA序列[Nature Reviews Genetics, 2006, 7,565-576 ；Angew. Chem. Int. Ed.，2007，46，6226-6236]，使其在手性药物的选择性合成与特异性识别方面显露出诱人的应用前景。基于DNA 二级结构的多样性和可调控性，以及碱基之间相互作用力弱等特点，利用小分子物质，特别是某些金属离子，可以诱导DNA构型发生改变。这种诱导作用与金属离子的类型和浓度、DNA序列的组成和长度以及溶液离子强度都有关系[Nucleic AcidsResearch, 2000，28，2439-2445]。例如，特定碱基组成的核酸序列在Ni2+或精氨的诱导下，其双螺旋结构可以由B型向Z型转变，这种手性结构以及表现出来的光谱特征的改变，为小分子药物特异性识别提供了依据[J. Phys. Chem. B，2011，115，10182-10188 ;J. Am. Chem.Soc.，2009，131，2046-2047]。另外，金属离子的加入，可以改变DNA序列与小分子药物之间的结合作用，增大或减少DNA对药物的结合能力[J. Fluoresc, 2011, 21,113-118]。到目前为止，利用特定的双链寡核苷酸序列，通过金属离子的诱导调控作用，对手性药物对映体进行拆分还未曾报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法。
本发明的技术方案概述如下—种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(I)在pH为5-9条件下，向50-4000体积份数的摩尔浓度为0. 025-lmmol/L的双链寡核苷酸溶液中加入I体积份数的摩尔浓度为0. 001-0. 5mol/L的二价或三价金属离子无机盐的水溶液，在10-40°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液；(2)在pH为5-9条件下，将1-100体积份数的所述双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液与I体积份数的摩尔浓度为0. 15-2mmol/L的手性药物外消旋体溶液混合，吸附15-60分钟；用截留分子量为1000-10000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物为富集的手性药物的另一种对映异构体；、所述双链寡核苷酸序列含有d[GxTyAJ/d[CxAyTJ ,其中x = 2-6, y = 1-3, z = 1-2 ;或者含有 d[GxCy]/d[CxGy]，其中 X = 2-6，y = 1-3。所述双链寡核苷酸溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液。上述方法还可以包括(3)将所述双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物加入溶剂配成以双链寡核苷酸摩尔计的摩尔浓度为0. 025-lmmol/L的双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物溶液；(4)在pH为5-9条件下，将1-100体积份数步骤(3)配制的溶液与I体积份数的摩尔浓度为0. 001-0. 02mol/L的EDTA盐水溶液混合，脱附15-60分钟，用截留分子量为1000-10000的超滤膜进行超滤，滤液中含有脱附的手性药物的另一种对映异构体，滤膜上截留物为双链寡核苷酸；(5)将步骤(4)获得的双链寡核苷酸加入溶剂配成摩尔浓度为0. 025-lmmol/L的双链寡核苷酸溶液；(6)在pH为5-9条件下，向50-4000体积份数步骤(5)配制的双链寡核苷酸溶液中加入I体积份数的摩尔浓度为0. 001-0. 5mol/L的二价或三价金属离子无机盐的水溶液，在10-40°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液；(7)在pH为5-9条件下，将1-100体积份数的步骤(6)获得的溶液与I体积份数的步骤(2)获得的滤液混合，吸附15-60分钟；用截留分子量为1000-10000的超滤膜进行超滤，滤液为手性药物的一种对映异构体溶液；所述双链寡核苷酸溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液；所述双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液。步骤⑴优选为在pH为5-9条件下，向100-1000体积份数的摩尔浓度为0. 05-0. 5mmol/L的双链寡核苷酸溶液中加入I体积份数的摩尔浓度为0. 01-0. lmol/L的二价或三价金属离子无机盐的水溶液，在20-30°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液。步骤(2)优选为在pH为5-9条件下，将4-40体积份数的所述双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液与I体积份数的摩尔浓度为0. 25-lmmol/L的手性药物外消旋体溶液混合，吸附20-40分钟；用截留分子量为3000-8000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物为富集的手性药物的另一种对映异构体。手性药物优选为氧氟沙星、布洛芬、华法林、萘普生、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普兰或普萘洛尔；手性药物溶液的溶剂优选为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液。步骤(4)优选为在pH为5-9条件下，将4_40体积份数步骤(3)配制的溶液与I体积份数的摩尔浓度为0. 005-0. 01mol/L的EDTA盐溶液混合，脱附20-40分钟，用截留分子量为3000-8000的超滤膜进行超滤，滤液中含有脱附的手性药物的另一种对映异构体， 滤膜上截留物为双链寡核苷酸。步骤(5)优选为将步骤⑷获得的双链寡核苷酸加入溶剂配成摩尔浓度为0. 05-0. Smmol /I,的溶液。步骤(6)优选为在pH为5-9条件下，向100-1000体积份数步骤(5)配制的双链寡核苷酸溶液中加入I体积份数的摩尔浓度为0. 01-0. lmol/L的二价或三价金属离子无机盐的水溶液，在20-30°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液。二价金属离子优选为铜离子、镍离子、锰离子、镁离子、钙离子、锌离子、钡离子，钴离子；三价金属离子优选为铁离子；无机盐优选为盐酸盐、硝酸盐或硫酸盐。步骤(7)优选为在pH为5-9条件下，将4_40体积份数的步骤(6)获得的溶液与I体积份数的步骤(2)获得的滤液混合，吸附20-40分钟；用截留分子量为3000-8000的超滤膜进行超滤，滤液为手性药物的一种对映异构体溶液。EDTA 盐优选 EDTA 二钠或 EDTA 二钾。本发明的优点本方法利用生物相容性好的双链寡核苷酸实现简便、安全的手性药物拆分，是一种绿色、清洁的手性药物对映异构体拆分新方法。拆分出的手性药物纯度提高。
具体实施例方式下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明作任何限制。实施例I一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(I)在pH为7. 2条件下，向IOOOii L摩尔浓度为0. 05mmol/L的双链寡核苷酸(本实施例的双链寡核苷酸的序列为d[AG3T2AG3T2AG3T2AG3] /d[TC3A2TC3A2TC3A2TC3])溶液中WAlyL的摩尔浓度为0. 01mol/L的氯化铜水溶液，在20°C混合均匀，得到双链寡核苷酸-铜离子复合物溶液；双链寡核苷酸溶液的溶剂为磷酸钠缓冲液；(2)在pH为7. 2条件下，将400 ii L步骤⑴制备的溶液与40 ii L摩尔浓度为0. 2mmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附20分钟,外消旋氧氟沙星溶液的溶剂为磷酸钠缓冲液；然后将混合溶液装入到截留分子量为3000的超滤离心管中，在SOOOrpm下离心20分钟，滤液为富集的手性药物氧氟沙星的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-铜离子复合物上的吸附物为富集的手性药物氧氟沙星的另一种对映异构体。滤液中氧氟沙星的对映体过量值为42. 60%。实验证明，用本实施例的方法也可用于拆分萘普生、酮洛芬、西酞普兰或普萘洛尔。滤液中萘普生、酮洛芬、西酞普兰或普萘洛尔的对映体过量值依次为30. 23%,35. 43%,31. 42%,33. 90%,o实施例2—种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(1)-(2)同实施例 I;(3)将实施例I的双链寡核苷酸-铜离子复合物上的吸附物加入磷酸钠缓冲液配成以双链寡核苷酸摩尔计的摩尔浓度为0. 05mmol/L的双链寡核苷酸-金属离子复合物上 的吸附物溶液；(4)在pH为7. 2条件下，将400 ii L步骤(3)配制的溶液与IOii L摩尔浓度为0. 001mol/L的EDTA 二钠水溶液混合，脱附20分钟，用截留分子量为3000的超滤膜进行超滤离心20分钟，滤液中含有脱附的手性药物氧氟沙星的另一种对映异构体，滤膜上截留物为双链寡核苷酸；(5)将步骤⑷获得的双链寡核苷酸加入磷酸钠缓冲液配成摩尔浓度为0. 05mmol/L的双链寡核苷酸溶液；(6)在pH为7. 2条件下，向1000 y L步骤(5)配制的双链寡核苷酸溶液中加入I u L摩尔浓度为0. 01mol/L的氯化铜水溶液,在20°C下混合均匀,得到双链寡核苷酸-铜离子复合物溶液；(7)在pH为7. 2条件下，将400 U L的步骤(6)获得的溶液与40 y L的实施例I步骤(2)获得的滤液混合，吸附20分钟；然后将混合溶液装入到截留分子量为3000的超滤离心管中，在8000rpm下离心20分钟，滤液为手性药物氧氟沙星的一种对映异构体溶液。滤液中氧氟沙星的对映体过量值为80. 04%。实验证明，本实施例的方法也可用于拆分萘普生、酮洛芬、西酞普兰或普萘洛尔。滤液中萘普生、酮洛芬、西酞普兰或普萘洛尔的对映体过量值依次为57. 21%、64. 89%,52. 43%,59. 85%。实施例3—种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(I)在pH为8. 5条件下，向IOOOii L摩尔浓度为0. 05mmol/L的双链寡核苷酸(本实施例的双链寡核苷酸的序列为d[AG6TA2G6TA2G6TA2Vd[TC6AT2C6AT2C6AT2])溶液中加A IOuL的摩尔浓度为0. 001mol/L的硫酸锌水溶液，在20°C混合均匀，得到双链寡核苷酸-锌离子复合物溶液；双链寡核苷酸溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；(2)在pH为8. 5条件下，将400 U L的双链寡核苷酸-锌离子复合物溶液与10 y L的摩尔浓度为2mmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附40分钟,外消旋氧氟沙星溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；用截留分子量为1000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物氧氟沙星的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-锌离子复合物上的吸附物为富集的手性药物氧氟沙星的另一种对映异构体。滤液中氧氟沙星的对映体过量值为43. 50%。实施例4
一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(I)-(2)同实施例 3;(3)将实施例3的双链寡核苷酸-锌离子复合物上的吸附物加入Tris-盐酸缓冲液配成以双链寡核苷酸摩尔计的摩尔浓度为0. 05mmol/L的双链寡核苷酸-锌离子复合物上的吸附物溶液；(4)在pH为8. 5条件下，将400 ii L步骤(3)配制的溶液与IOii L摩尔浓度为0. 001mol/L的EDTA 二钾水溶液混合，脱附40分钟，用截留分子量为1000的超滤膜进行超滤离心20分钟，滤液中含有脱附的手性药物氧氟沙星的另一种对映异构体，滤膜上截留物为双链寡核苷酸；(5)将步骤(4)获得的双链寡核苷酸加入Tris-盐酸缓冲液配成摩尔浓度为0. 05mmol/L的双链寡核苷酸溶液；(6)在pH为8. 5条件下，向IOOOy L步骤(5)配制的双链寡核苷酸溶液中加A IOii L摩尔浓度为0. 001mol/L的硫酸锌水溶液，在20°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-锌离子复合物溶液；(7)在pH为8. 5条件下，将400 U L的步骤(6)获得的溶液与10 y L的实施例3步骤(2)获得的滤液混合，吸附40分钟；然后将混合溶液装入到截留分子量为1000的超滤离心管中，在8000rpm下离心20分钟，滤液为手性药物氧氟沙星的一种对映异构体溶液。滤液中氧氟沙星的对映体过量值为85. 35%。实施例5一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(I)在pH为8. 5条件下，向1000 u L摩尔浓度为0. 025mmol/L的双链寡核苷酸(本实施例的双链寡核苷酸的序列为d [G2T3AG2T3AG2T3AG3] /d [C2A3TC2A3TC2A3TC3])溶液中加入20 u L的摩尔浓度为0. lmol/L的硝酸镁水溶液，在30°C混合均匀，得到双链寡核苷酸-镁离子复合物溶液；双链寡核苷酸溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；(2)在pH为8. 5条件下，将400 ii L的双链寡核苷酸-镁离子复合物溶液与400 ii L的摩尔浓度为0. 15mmol/L的外消旋布洛芬溶液混合，吸附15分钟，外消旋布洛芬溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；用截留分子量为10000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物布洛芬的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-镁离子复合物上的吸附物为富集的手性药物布洛芬的另一种对映异构体。滤液中布洛芬的对映体过量值为26. 54%。实施例6一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(I)-(2)同实施例 5;(3)将实施例5的双链寡核苷酸-镁离子复合物上的吸附物加入Tris-盐酸缓冲液配成以双链寡核苷酸摩尔计的摩尔浓度为0. 025mmol/L的双链寡核苷酸-镁离子复合物上的吸附物溶液；(4)在pH为8. 5条件下，将400 ii L步骤(3)配制的溶液与IOOii L摩尔浓度为0. 01mol/L的EDTA 二钠水溶液混合，脱附15分钟，用截留分子量为10000的超滤膜进行超滤离心20分钟，滤液中含有脱附的手性药物布洛芬的另一种对映异构体，滤膜上截留物为双链寡核苷酸；(5)将步骤(4)获得的双链寡核苷酸加入Tris-盐酸缓冲液配成摩尔浓度为0. 025mmol/L的双链寡核苷酸溶液；(6)在pH为8. 5条件下，向1000 ii L步骤(5)配制的双链寡核苷酸溶液中加入20uL摩尔浓度为0. lmol/L的硝酸镁水溶液，在30°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-镁离子复合物溶液；(7)在pH为8. 5条件下，将400 U L的步骤(6)获得的溶液与400 U L的实施例5步骤(2)获得的滤液混合，吸附15分钟；然后将混合溶液装入到截留分子量为10000的超滤离心管中，在8000rpm下离心20分钟，滤液为手性药物布洛芬的一种对映异构体溶液。滤液中布洛芬的对映体过量值为50. 67%。 实施例7—种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(I)在pH为5. 0条件下，向4000 U L摩尔浓度为0. 5mmol/L的双链寡核苷酸(本实施例的双链寡核苷酸的序列为d[AG4CG4CG4CG5CVd[TC4GC4GC4GC5G])溶液中加入I y L的摩尔浓度为0. 5mol/L的硝酸镍水溶液，在15°C混合均匀，得到双链寡核苷酸-镍离子复合物溶液；双链寡核苷酸溶液的溶剂为MES缓冲液；(2)在pH为5. 0条件下，将1000 U L的双链寡核苷酸_镍离子复合物溶液与100 u L的摩尔浓度为lmmol/L的外消旋华法林溶液混合，吸附30分钟，外消旋华法林溶液的溶剂为MES缓冲液；用截留分子量为3000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物华 法林的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-镍离子复合物上的吸附物为富集的手性药物华法林的另一种对映异构体；滤液中华法林的对映体过量值为36. 19%。实施例8一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(I)-(2)同实施例 7;(3)将实施例7的双链寡核苷酸-镍离子复合物上的吸附物加入MES缓冲液配成以双链寡核苷酸摩尔计的摩尔浓度为0. 5mmol/L的双链寡核苷酸-镍离子复合物上的吸附物溶液；(4)在pH为5.0条件下，将IOOOii L步骤(3)配制的溶液与IOii L摩尔浓度为0. 02mol/L的EDTA 二钠水溶液混合，脱附30分钟，用截留分子量为3000的超滤膜进行超滤离心20分钟，滤液中含有脱附的手性药物华法林的另一种对映异构体，滤膜上截留物为双链寡核苷酸；(5)将步骤(4)获得的双链寡核苷酸加入MES缓冲液配成摩尔浓度为0. 5mmol/L的双链寡核苷酸溶液； (6)在pH为5. 0条件下，向4000ii L步骤(5)配制的双链寡核苷酸溶液中加入I U L摩尔浓度为0. 5mol/L的硝酸镍水溶液，在15°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-镍离子复合物溶液；(7)在pH为5. 0条件下，将1000 U L的步骤(6)获得的溶液与100 U L的实施例7步骤(2)获得的滤液混合，吸附30分钟；然后将混合溶液装入到截留分子量为3000的超滤离心管中，在8000rpm下离心20分钟，滤液为手性药物华法林的一种对映异构体溶液。滤液中华法林的对映体过量值为62. 12%。实施例9一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(I)在pH为5. 8条件下，向1000 U L摩尔浓度为lmmol/L的双链寡核苷酸(本实施例的双链寡核苷酸的序列为d[CG4CG3CCG5CG4TVd[GC4GC3GGC5GC4A])溶液中加入I y L的摩尔浓度为0. 005mol/L的氯化锰水溶液，在10°C混合均匀，得到双链寡核苷酸-锰离子复合物溶液；双链寡核苷酸溶液的溶剂 为二甲胂酸钠缓冲液；(2)在pH为5. 8条件下，将500 ii L的双链寡核苷酸-锰离子复合物溶液与500 ii L的摩尔浓度为lmmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附30分钟,外消旋氧氟沙星溶液的溶剂为二甲胂酸钠缓冲液；用截留分子量为8000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物氧氟沙星的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-锰离子复合物上的吸附物为富集的手性药物氧氟沙星的另一种对映异构体；滤液中氧氟沙星的对映体过量值为39. 91 %。实施例10一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(1)-(2)同实施例 9;(3)将实施例9的双链寡核苷酸-锰离子复合物上的吸附物加入二甲胂酸钠缓冲液配成以双链寡核苷酸摩尔计的摩尔浓度为lmmol/L的双链寡核苷酸-锰离子复合物上的吸附物溶液；(4)在pH为5. 8条件下，将500 ii L步骤(3)配制的溶液与IOii L摩尔浓度为0. 001mol/L的EDTA 二钾水溶液混合，脱附30分钟，用截留分子量为8000的超滤膜进行超滤离心20分钟，滤液中含有脱附的手性药物氧氟沙星的另一种对映异构体，滤膜上截留物为双链寡核苷酸；(5)将步骤⑷获得的双链寡核苷酸加入二甲胂酸钠缓冲液配成摩尔浓度为lmmol/L的双链寡核苷酸溶液；(6)在pH为5. 8条件下，向1000 ii L步骤(5)配制的双链寡核苷酸溶液中加入
IU L摩尔浓度为0. 005mol/L的氯化锰水溶液，在10°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-锰离子复合物溶液；(7)在pH为5. 8条件下，将500 U L的步骤(6)获得的溶液与500 U L的实施例9步骤(2)获得的滤液混合，吸附30分钟；然后将混合溶液装入到截留分子量为8000的超滤离心管中，在8000rpm下离心20分钟，滤液为手性药物氧氟沙星的一种对映异构体溶液。滤液中氧氟沙星的对映体过量值为79. 23%。实施例11一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(I)在pH为8. 0条件下，向1000 U L摩尔浓度为0. lmmol/L的双链寡核苷酸(本实施例的双链寡核苷酸的序列为d[C4TC3TCGCGC3GC3G] /d[G4AG3AGCGCG3CG3C])溶液中加入IOuL的摩尔浓度为0. 3mol/L的硝酸钡水溶液，在40°C混合均匀，得到双链寡核苷酸-钡离子复合物溶液；双链寡核苷酸溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；
(2)在pH为8.0条件下，将400 i! L的双链寡核苷酸-钡离子复合物溶液与IOOiI L的摩尔浓度为lmmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附30分钟,外消旋氧氟沙星溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；用截留分子量为10000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物氧氟沙星的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-钡离子复合物上的吸附物为富集的手性药物氧氟沙星的另一种对映异构体；滤液中氧氟沙星的对映体过量值为42. 87%。实施例12一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(1)-(2)同实施例 11 ;(3)将实施例11的双链寡核苷酸-钡离子复合物上的吸附物加入Tris-盐酸缓冲液配成以双链寡核苷酸摩尔计的摩尔浓度为0. lmmol/L的双链寡核苷酸-钡离子复合物上的吸附物溶液；(4)在pH为8.0条件下，将500 ii L步骤(3)配制的溶液与500 y L摩尔浓度为0. 005mol/L的EDTA 二钾水溶液混合，脱附30分钟，用截留分子量为10000的超滤膜进行超滤离心20分钟，滤液中含有脱附的手性药物氧氟沙星的另一种对映异构体，滤膜上截留物为双链寡核苷酸；(5)将步骤⑷获得的双链寡核苷酸加入Tris-盐酸缓冲液配成摩尔浓度为0. lmmol/L的双链寡核苷酸溶液；(6)在pH为8.0条件下，向IOOOii L步骤(5)配制的双链寡核苷酸溶液中加入IOuL摩尔浓度为0. 3mol/L的硝酸钡水溶液，在40°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-钡离子复合物溶液；(7)在pH为8. 0条件下，将400 U L的步骤(6)获得的溶液与100 U L的实施例11步骤(2)获得的滤液混合，吸附30分钟；然后将混合溶液装入到截留分子量为10000的超滤离心管中，在8000rpm下离心20分钟，滤液为手性药物氧氟沙星的一种对映异构体溶液。滤液中氧氟沙星的对映体过量值为83. 22%。实施例13一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(I)在pH为9.0条件下，向IOOOii L摩尔浓度为0.05mmol/L的双链寡核苷酸(本实施例的双链寡核苷酸的序列为d[AG2C3G2C3G2C3Vd[TC2G3C2G3C2G3])溶液中加入5 y L的摩尔浓度为0. 05mol/L的硝酸钙水溶液，在20°C混合均匀，得到双链寡核苷酸-钙离子复合物溶液；双链寡核苷酸溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；(2)在pH为9. 0条件下，将500 u L的双链寡核苷酸-钙离子复合物溶液与500 u L的摩尔浓度为0. 25mmol/L的外消旋布洛芬溶液混合，吸附60分钟，外消旋布洛芬溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；用截留分子量为1000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物布洛芬的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-钙离子复合物上的吸附物为富集的手性药物布洛芬的另一种对映异构体；滤液中布洛芬的对映体过量值为30. 63%。
实施例14一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤
(1)-(2)同实施例 13 ;(3)将实施例13的双链寡核苷酸-钙离子复合物上的吸附物加入Tris-盐酸缓冲液配成以双链寡核苷酸摩尔计 的摩尔浓度为0. 05mmol/L的双链寡核苷酸-钙离子复合物上的吸附物溶液；(4)在pH为9.0条件下，将500 ii L步骤(3)配制的溶液与50 y L摩尔浓度为0. 0025mol/L的EDTA 二钾水溶液混合，脱附60分钟，用截留分子量为1000的超滤膜进行超滤离心20分钟，滤液中含有脱附的手性药物布洛芬的另一种对映异构体，滤膜上截留物为双链寡核苷酸；(5)将步骤⑷获得的双链寡核苷酸加入Tris-盐酸缓冲液配成摩尔浓度为0. 05mmol/L的双链寡核苷酸溶液；(6)在pH为9.0条件下，向IOOOii L步骤(5)配制的双链寡核苷酸溶液中加入5 u L摩尔浓度为0. 05mol/L的硝酸钙水溶液，在20°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-钙离子复合物溶液；(7)在pH为9. 0条件下，将500 U L的步骤(6)获得的溶液与500 U L的实施例13步骤(2)获得的滤液混合，吸附60分钟；然后将混合溶液装入到截留分子量为1000的超滤离心管中，在8000rpm下离心20分钟，滤液为手性药物布洛芬的一种对映异构体溶液。滤液中布洛芬的对映体过量值为58. 26%。实施例15一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(I)在pH = 7. 2下，向10001^摩尔浓度为0.0511111101/1的双链寡核苷酸(本实施例的双链寡核苷酸的序列为d[G6CG6CG6CTVd[C6GC6GC6GA])溶液中加入4 y L的摩尔浓度为0. 08mol/L的氯化钴水溶液，在35°C混合均匀，得到双链寡核苷酸-钴离子复合物溶液；双链寡核苷酸溶液的溶剂为ffiRES缓冲液；(2)在pH为7. 2条件下，将1000 U L的双链寡核苷酸-钴离子复合物溶液与10 y L的摩尔浓度为2mmol/L的外消旋氟比洛芬溶液混合,吸附40分钟,外消旋氟比洛芬溶液的溶剂为HERES缓冲液；用截留分子量为8000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物氟比洛芬的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-钴离子复合物上的吸附物为富集的手性药物氟比洛芬的另一种对映异构体；滤液中氟比洛芬的对映体过量值为35. 14%。实施例16一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(1)-(2)同实施例 15 ;(3)将实施例15的双链寡核苷酸-钴离子复合物上的吸附物加入HERES缓冲液配成以双链寡核苷酸摩尔计的摩尔浓度为0. 05mmol/L的双链寡核苷酸-钴离子复合物上的吸附物溶液；(4)在pH为7. 2条件下，将IOOOii L步骤(3)配制的溶液与50 y L摩尔浓度为0. 01mol/L的EDTA 二钠水溶液混合，脱附40分钟，用截留分子量为8000的超滤膜进行超滤离心20分钟，滤液中含有脱附的手性药物氟比洛芬的另一种对映异构体，滤膜上截留物为双链寡核苷酸；
(5)将步骤⑷获得的双链寡核苷酸加入HERES缓冲液配成摩尔浓度为0. 05mmol/L的双链寡核苷酸溶液；(6)在pH为7.2条件下，向IOOOyL步骤(5)配制的双链寡核苷酸溶液中加入4UL摩尔浓度为0. 08mol/L的氯化钴水溶液，在35°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-钴离子复合物溶液；(7)在pH为7. 2条件下，将1000 U L的步骤(6)获得的溶液与10 y L的实施例15步骤(2)获得的滤液混合，吸附40分钟；然后将混合溶液装入到截留分子量为8000的超滤离心管中，在8000rpm下离心20分钟，滤液为手性药物氟比洛芬的一种对映异构体溶液。滤液中氟比洛芬的对映体过量值为60. 67%。实施例17一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(I)在pH为7. 2条件下，向IOOOii L摩尔浓度为0. 2mmol/L的双链寡核苷酸(本实施例的双链寡核苷酸的序列为d[AG6TA2G6TA2G6TA2Vd[TC6AT2C6AT2C6AT2])溶液中加入2 y L的摩尔浓度为0. 02mol/L的氯化铁水溶液，在25°C混合均匀，得到双链寡核苷酸-铁离子复合物溶液；双链寡核苷酸溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；(2)在pH为7. 2条件下，将1000 U L的双链寡核苷酸-铁离子复合物溶液与50 y L的摩尔浓度为lmmol/L的外消旋氧氟沙星溶液混合,吸附20分钟,外消旋氧氟沙星溶液的溶剂为Tris-盐酸缓冲液；用截留分子量为3000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物氧氟沙星的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-铁离子复合物上的吸附物为富集的手性药物氧氟沙星的另一种对映异构体；滤液中氧氟沙星的对映体过量值为40. 43%。实施例18一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤(1)-(2)同实施例 17 ;(3)将实施例17的双链寡核苷酸-铁离子复合物上的吸附物加入Tris-盐酸缓冲液配成以双链寡核苷酸摩尔计的摩尔浓度为0. 2mmol/L的双链寡核苷酸-铁离子复合物上的吸附物溶液；(4)在pH为7. 2条件下，将IOOOii L步骤(3)配制的溶液与IOy L摩尔浓度为0. 008mol/L的EDTA 二钠水溶液混合，脱附20分钟，用截留分子量为3000的超滤膜进行超滤离心20分钟，滤液中含有脱附的手性药物氧氟沙星的另一种对映异构体，滤膜上截留物为双链寡核苷酸；(5)将步骤⑷获得的双链寡核苷酸加入Tris-盐酸缓冲液配成摩尔浓度为0. 2mmol/L的双链寡核苷酸溶液；(6)在pH为7.2条件下，向IOOOyL步骤(5)配制的双链寡核苷酸溶液中加入 2u L摩尔浓度为0. 02mol/L的氯化铁水溶液，在25°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-铁离子复合物溶液；(7)在pH为7. 2条件下，将1000 U L的步骤(6)获得的溶液与50 y L的实施例17步骤(2)获得的滤液混合，吸附20分钟；然后将混合溶液装入到截留分子量为3000的超滤离心管中，在8000rpm下离心20分钟，滤液为手性药物氧氟沙星的一种对映异构体溶液。滤液中氧氟 沙星的对映体过量值为79. 54%。
权利要求
1.一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，其特征包括如下步骤 (1)在pH为5-9条件下，向50-4000体积份数的摩尔浓度为0.025-lmmol/L的双链寡核苷酸溶液中加入I体积份数的摩尔浓度为0. 001-0. 5mol/L的二价或三价金属离子无机盐的水溶液，在10_40°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液； (2)在pH为5-9条件下，将1-100体积份数的所述双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液与I体积份数的摩尔浓度为0. 15-2mmol/L的手性药物外消旋体溶液混合，吸附15-60分钟；用截留分子量为1000-10000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物为富集的手性药物的另一种对映异构体； 所述双链寡核苷酸序列含有d[GxTyAJ/d[CxAyTz],其中x = 2-6, y = 1-3, z = 1-2 ;或者含有 d[GxCy]/d[CxGy]，其中 X = 2-6，y = 1-3。
所述双链寡核苷酸溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征是还包括 (3)将所述双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物加入溶剂配成以双链寡核苷酸摩尔计的摩尔浓度为0. 025-lmmol/L的双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物溶液； (4)在pH为5-9条件下，将1-100体积份数步骤(3)配制的溶液与I体积份数的摩尔浓度为0. 001-0. 02mol/L的EDTA盐水溶液混合，脱附15-60分钟，用截留分子量为1000-10000的超滤膜进行超滤，滤液中含有脱附的手性药物的另一种对映异构体，滤膜上截留物为双链寡核苷酸； (5)将步骤(4)获得的双链寡核苷酸加入溶剂配成摩尔浓度为0.025-lmmol/L的双链寡核苷酸溶液； (6)在pH为5-9条件下，向50-4000体积份数步骤(5)配制的双链寡核苷酸溶液中加A I体积份数的摩尔浓度为0. 001-0. 5mol/L的二价或三价金属离子无机盐的水溶液，在10-40°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液； (7)在pH为5-9条件下，将1-100体积份数的步骤(6)获得的溶液与I体积份数的步骤(2)获得的滤液混合，吸附15-60分钟；用截留分子量为1000-10000的超滤膜进行超滤，滤液为手性药物的一种对映异构体溶液； 所述双链寡核苷酸溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液；所述双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征是所述步骤(I)为在pH为5-9条件下，向100-1000体积份数的摩尔浓度为0. 05-0. 5mmol/L的双链寡核苷酸溶液中加入I体积份数的摩尔浓度为0. 01-0. lmol/L的二价或三价金属离子无机盐的水溶液，在20-30°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征是所述步骤(2)为在pH为5-9条件下，将4-40体积份数的所述双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液与I体积份数的摩尔浓度为0.25-lmmol/L的手性药物外消旋体溶液混合，吸附20-40分钟；用截留分子量为3000-8000的超滤膜进行超滤，滤液为富集的手性药物的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物为富集的手性药物的另一种对映异构体。
5.根据权利要求I或4所述的方法，其特征是所述手性药物为氧氟沙星、布洛芬、华法林、萘普生、酮洛芬、氟比洛芬、西酞普兰或普萘洛尔；所述手性药物溶液的溶剂为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液或二甲胂酸盐缓冲液。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤(4)为在pH为5-9条件下，将4-40体积份数步骤(3)配制的溶液与I体积份数的摩尔浓度为0. 005-0. 01mol/L的EDTA盐水溶液混合，脱附20-40分钟，用截留分子量为3000-8000的超滤膜进行超滤，滤液中含有脱附的手性药物的另一种对映异构体，滤膜上截留物为双链寡核苷酸。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤(5)为将步骤(4)获得的双链寡核苷酸加入溶剂配成摩尔浓度为0. 05-0. 5mmol/L的溶液。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤(6)为在pH为5-9条件下，向100-1000体积份数步骤(5)配制的双链寡核苷酸溶液中加入I体积份数的摩尔浓度为0.01-0. lmol/L的二价或三价金属离子无机盐的水溶液，在20-30°C下混合均匀，得到双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液。
9.根据权利要求I或2或3或8所述的方法，其特征是所述二价金属离子为铜离子、镍离子、锰离子、镁离子、钙离子、锌离子、钡离子，钴离子；所述三价金属离子为铁离子；所述无机盐为盐酸盐、硝酸盐或硫酸盐。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤(7)为在pH为5-9条件下，将4-40体积份数的步骤(6)获得的溶液与I体积份数的步骤(2)获得的滤液混合，吸附20-40分钟；用截留分子量为3000-8000的超滤膜进行超滤，滤液为手性药物的一种对映异构体溶液。
全文摘要
本发明公开了一种利用寡核苷酸拆分手性药物的方法，包括如下步骤向双链寡核苷酸溶液中加入二价或三价金属离子无机盐的水溶液，混合均匀，得到双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液；将所述双链寡核苷酸-金属离子复合物溶液与手性药物外消旋体溶液混合，吸附；超滤，滤液为富集的手性药物的一种对映异构体溶液，双链寡核苷酸-金属离子复合物上的吸附物为富集的手性药物的另一种对映异构体；所述双链寡核苷酸序列含有d[GxTyAz]/d[CxAyTz]，其中x＝2-6，y＝1-3，z＝1-2，本发明的方法利用生物相容性好的双链寡核苷酸实现简便、安全的手性药物拆分，是一种绿色、清洁的方法。拆分出的手性药物纯度提高。
文档编号C07D307/87GK102659495SQ20121012384
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月25日 优先权日2012年4月25日
发明者付雁, 张金利, 李韡, 段小丽, 陈雄飞 申请人:天津大学