一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明所述的一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其特征在于，利用鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中克隆出重链(VH)和轻链(VL)可变区基因，通过基因重组构建scFv及原核表达载体PET32a-AL，转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定。scFv基因序列全长747碱基对，编码249个氨基酸，符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有框架区(FRs)、抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的半胱氨酸残基。ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有与溶藻弧菌一样的免疫原性。
【专利说明】一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]溶藻弧菌(Vibrio, alginolyticus)是引起牙鲆、鳗鲡等许多名贵经济鱼类致病的病菌之一，严重威胁着我国水产养殖业的发展。可给渔业和养殖业带来巨大的经济损失。传统防治溶藻弧菌感染的方法主要采用抗生素和减毒、灭活疫苗。抗生素的长期使用可使鱼类产生耐药性，而且残留的抗生素可通过食物链对人类造成危害。减毒疫苗的安全性难以掌握；而用物理、化学方法制备的灭活疫苗，抗原活性可能遭到破坏，且残存的杂质还可能引起鱼的炎症反应而死亡。
[0003]针对引起细菌性鱼病的溶藻弧菌抗独特型抗体具有良好的免疫原性和安全性，而由基因工程构建的抗独特型抗体可变区的小分子单链抗体一不但具备有分子量小，穿透力强，易于大量生产和降低成本等优点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种抗体分子小，免疫原性低，组织穿透力强，使用方便，有效，可行，可大规模生产的鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗。
[0005]为实现上述 目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]本发明所述的一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其特征在于，利用鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中克隆出重链(Vh)和轻链(\)可变区基因，通过基因重组构建 scFv及原核表达载体PET32a-AL，转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。表达后的重组蛋白利用动物免疫试验进行免疫原性鉴定。scFv基因序列全长747碱基对，编码249个氨基酸，符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征，含有框架区(FRs)、抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的半胱氨酸残基。ELISA测定和动物免疫试验显示抗独特性抗体的scFv具有与溶藻弧菌一样的免疫原性。鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其基因序列和氨基酸序列如下:
【权利要求】
1.一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其特征在于，利用鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体的杂交瘤细胞株克隆出重链(Vh)和轻链可变区基因，用(Gly4Ser)3组成的连接肽(linker)连接Vh和Vlj,构建Va-1inker-Vlj形式的单链抗体scFv基因,在大肠杆菌中表达，获得鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗，基因序列全长747碱基对，编码249个氨基酸，其基因序列和氨基酸序列如下:
2.根据权利要求1所述的一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗，其特征在于，构建单链抗体scFv基因引物序列为: Lback 5' -TCGACAGGTGGAGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCC-3， LFor 5' -CATCTGGATGTCAGAACCACCACCACCGGATCCACCACCACCGGAGCCGCCGCCGCC-3'。
3.实现权利要求1所述的一种鱼类溶藻弧菌抗独特型抗体基因工程疫苗的制备方法，其特征在于，具体的步骤如下: 1)用重组PCR的方法，将已获得的\和Vh基因以连接肽linker(Gly4Ser) 3连接，设计连接肽I inker的引物，斜体的为BamHI酶切位点，在反应体系中分别以回收的\和Vh基因为模板，加入 LBari^P VHFot、LFot和 Vlfeek 引物，参数为:94°C 3min，94°C 30s, 52°C 60s, 72°C 60s,30次循环，进行PCR扩增，10g/L琼脂糖凝胶电泳并回收后的PCR产物用BamH I酶切后用T4连接酶连接，连接产物与PMD18-T vector连接，转化感受态细菌E.col1.DH_5a，筛选阳性克隆提取质粒，筛选后的质粒命名为PET32a-AL，对PET32a_AL进行PCR鉴定，通用引物T7进行测序； 2)将PET32a-AL转化BL21，挑取阳性克隆IPTG诱导表达，表达产物在破壁缓冲液中冰浴Ih和超声破碎菌体4次，变性液:20mmol Tris-HCL, ρΗ7.5，IOmmol EDTA, 10g/LTritonX-100，复性液:2.5mmol Tris-HCL，pH7.5,0.0lmol NaCL, lOg/L 甘油，0.lmol/L 脲，离心收集上清液透析后纯化。
【文档编号】C07K16/12GK103463645SQ201210183806
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年6月6日 优先权日:2012年6月6日
【发明者】付建芳, 黄威权, 涂艳阳, 付菊芳 申请人:付建芳, 涂艳阳, 付菊芳, 黄威权