专利名称：一种奈西利肽粗品的固相制备方法
技术领域：
本发明涉及医药多肽类原料药的化学合成，尤其涉及一种奈西利肽粗品的固相制备方法。
背景技术：
奈西利肽((nesiritide/Natrecor)是一类新的血管扩张剂，由32个氨基酸组成的环肽，10-26位置通过S-S键相连。在急性心力衰竭的治疗中一种重组人脑钠肽或B型利钠肽(BNP)，与内生荷尔蒙完全相同，主要用于急性失代偿性充血性心力衰竭时呼吸困难的治疗。奈西利肽有静脉、动脉和冠状血管舒张作用以减轻前后负荷并在无直接正性肌力作用的情况下增加心输出量。在慢性心力衰竭的患者中静注奈西利肽可通过促进钠外排和抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统和交感神经系统而产生有益的血液动力学作用。奈西利 肽与静脉注射硝酸甘油比较可更有效地改善血液动力学并具有较少不良反应。目前奈西利肽的合成方法有固相法、基因重组等方法，如申请号200910104860所述的制备方法以HMPB-AM树脂为起始原料，在缩合剂、接肽试剂的作用下，通过固相合成法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，得到侧链全保护线性奈西利肽HMPB-AM树脂。CN200410083873. X报道了一种固相制备奈西利肽的方法。然而现有技术中提供的这些方法HMPB-AM树脂不是常规树脂，较难在市场上获得。HMPB-AM树脂在连接Fmoc-His (Trt) -OH时容易引起消旋，杂质较多。因此，本领域迫切需要提供一种有效、简便的固相合成奈西利肽粗品的制备方法。
发明内容
本发明旨在提供一种固相合成奈西利肽粗品的制备方法。本发明提供了一种奈西利肽粗品的固相制备方法，所述方法包括步骤以固相合成树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得保护的三十二肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用TBTU/HOBt(即TBTU和 HOBt，)、HBTU/H0Bt (即 HBTU 和 H0Bt)、B0P/H0Bt (即 BOP 和 H0Bt)、TBTU/H0At (即 TBTU和 HOAt)、HBTU/HOAt (即 HBTU 和 HOAt)、DIC/HOBt (即 DIC 和 HOBt)或 B0P/H0At (即 BOP和HOAt)中的任何一对为缩合剂，进行接肽反应，得保护的三十二肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得奈西利肽粗品，所述步骤有下述特点—是所述固相合成树脂是溴化王树脂；及一是采用DMF/DCM混合溶剂为活化溶剂，预先溶解具有Fmoc保护基团的氨基酸和缩合剂，反应体系外进行活化，再加入到反应体系中。本发明提供的奈西利肽粗品的固相制备方法中，依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸包括如下步骤 (a)将王树脂、PBr3, Fmoc-His (Trt) -OH和DIPEA混合，反应得到溴化王树脂；(b)在溴化王树脂中，加入脱保护剂进行处理，然后树脂用DMF洗漆，加入用DMF/DCM混合溶剂溶解的具有Fmoc保护基团的氨基酸、缩合剂的混合物，接肽反应后再加入脱保护剂处理，再加入用DMF/DCM混合溶剂溶解的具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此重复，获得 Fmoc-Serl-Pro2-Lys3-Met4-Val5-Gln6-Gly7-Ser8-Gly9-Cysli3-Phell-Gly12-Arg13-Lysi4-Met15-Asp16-Arg17-I Iel8-Seri9-Ser2o-Ser2i-Ser22-Gly23-Leu24-Gly25-Cys26-Lys27-Val28-Leu29-Arg3Q-Arg31-HiS32-树脂；所说的具有Fmoc保护基团的氨基酸，依次为(I) Fmoc-His (Trt) -OH 或 Fmoc-His-OH、 (2) Fmoc-Arg (Pbf ) -OH 或 Fmoc-Arg (HCl) -0H、(3) Fmoc-Arg (Pbf ) -OH 或 Fmoc-Arg (HCl) -0H、(4) Fmoc-Leu-OH、(5) Fmoc-Val—OH、(6) Fmoc-Lys (Boc) —OH、(7) Fmoc-Cys (Trt) -OH 或 Fmoc-Cys (Acm) -OH、(8) Fmoc-Gly-OH、(9) Fmoc-Leu-OH、(10) Fmoc-Gly-OH、(11) Fmoc-Ser(tBu)-OH 或 Fmoc-Ser-OH、(12)Fmoc-Ser(tBu)-OH 或 Fmoc-Ser-OH、、(13)Fmoc-Ser(tBu)-OH 或 Fmoc-Ser-OH、、(14)Fmoc-Ser(tBu)-OH 或 Fmoc-Ser-OH、、(15) Fmoc-I I e_0H、(16) Fmoc-Arg (Pbf) -OH 或 Fmoc-Arg (HCl) -OH、、(17) Fmoc-Asp (OtBu) -OH、(18) Fmoc-Met-OH、(19) Fmoc-Lys (Boc) -OH、(20) Fmoc-Arg (Pbf) -OH 或 Fmoc-Arg (HCl) -OH、(21) Fmoc-Gly-OH、(22) Fmoc-Phe-OH、(23) Fmoc-Cys (Trt) -OH 或 Fmoc-Cys (Acm) -OH、(24) Fmoc-Gly-OH、(25) Fmoc-Ser(tBu)-OH 或 Fmoc-Ser-OH、(26) Fmoc-Gly-OH、(27) Fmoc-Gln (Trt) -OH、(28) Fmoc-Val-OH^(29) Fmoc-Met-OH、(30) Fmoc-Lys (Boc) -OH、(31) Fmoc-Pro-OH、(32) Fmoc-Ser(tBu)-OH 或 Fmoc-Ser-OH。在上述方法中，依次连接22至18位残基的Fmoc-氨基酸时，所述缩合剂为DIC/HOBt、或DIC/Cl-HOBt和选自下述的一种或一种以上的混合TBTU/H0Bt、HBTU/HOBt和HATU/HOAto在上述方法中，依次连接22至18位残基的Fmoc-氨基酸时，缩合反应温度为0-5。。。在上述方法中，依次连接22至18位残基的Fmoc-氨基酸时，I. 0-3. O倍量的HOBt或Cl-HOBt，I. 0-3. O倍量的DIC试剂，溶解在5ml_10ml/g树脂的DMF和DCM溶剂中的混合溶液，反应30-60分钟后加入I. 0-3. O倍量的DIC试剂。在另一优选例中，以DMF和DCM的混合溶液的总体积计，其中DMF的百分含量为40-60%ο在上述方法中，依次连接17、13、8位残基的Fmoc-Arg (Pbf)-OH时，将五氟苯酚作为活化试剂。在上述方法中，依次连接12、9、7、5位残基的Fmoc氨基酸时，2. 0-5. O倍量的Fmoc保护氨基酸，2. 0-5. O倍量的H0Bt/Cl-H0Bt，2. 0-5. O倍量的DIPEA试剂，溶解在5ml_10ml/g固相合成树脂的DMF和DCM溶剂中的混合溶液，在0-5°C加入2. 0-5. O倍量的HBTU/HATU或 TBTU。在上述方法中，依次连接10、6、4至I位残基的Fmoc氨基酸时，I. 0-3. O倍量的Fmoc保护氨基酸，2. 0-6. O倍量的H0Bt/Cl_H0Bt，I. 0-3. O倍量的DIC试剂，溶解在5ml-10ml/g固相合成树脂的DMF和DCM溶剂中的混合溶液，反应30-60分钟后继续加入1.0-3. O倍量的DIC试剂。据此，本发明提供了一种有效、简便的固相合成奈西利肽粗品的制备方法。
图I是实施例I所获得的奈西利肽粗品I的GC-MS谱图和HPLC检测图谱；其中A是LC-MS谱图，B是HPLC检测图谱。图2是实施例2所获得的奈西利肽粗品2的GC-MS谱图和HPLC检测图谱；其中A是LC-MS谱图，B是HPLC检测图谱。图3是实施例3所获得的奈西利肽粗品3的GC-MS谱图和HPLC检测图谱；其中A是LC-MS谱图，B是HPLC检测图谱。
具体实施例方式发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现如果就不同的氨基酸残基采用特定的合成方法，减少单一合成方法的不良影响，采用经典固相合成方法也可以简便、有效地获得奈西利肽的粗品，纯化后得到的产品纯度高(> 98%)。本发明利用固相合成技术将肽链的羧末端保护氨基酸His(Dnp)的羧基同一个不溶的高分子树脂Pam Resin相连，再以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分同过量的活化羧基组分反应接长肽链逐步向氨基端延伸，提供了一种新的肽合成方法。具体地采用溴化王树脂合成第一个氨基酸His，有效防止His消旋，减少消旋杂质。采用DMF/DCM混合溶剂，预先溶解氨基酸和活化试剂,反应体系外进行活化,再加入到反应体系中。有效控制长链肽的溶胀和反应过程中空间位阻影响。对不同残基米用不同合成方法如22-18#残基，采用DIC/HOBt为缩合试剂，控制反应0_5C，中控监测不完全时，则继续采用HBTU/H ATU/TBTU活化方法继续反应。对于17#，13#, 8# Arg残基，则采用五氟苯酚为活化试剂。而对于12#，9#，7#和5#分子较小的氨基酸，采用增大投料量的办法，快速完成反应，减小因时间延长而引起的副反应。对于10#，6#,4#-1#氨基酸,采用增加活化试剂的量,促使反应快速完成。本发明中所使用的缩写或英文全称的含义列于下表
权利要求
1.一种奈西利肽粗品的固相制备方法，所述方法包括步骤 以固相合成树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得保护的三十二肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用TBTU/HOBt (即TBTU和HOBt，)、HBTU/H0Bt (即 HBTU 和 H0Bt)、B0P/H0Bt (即 BOP 和 H0Bt)、TBTU/H0At (即 TBTU 和HOAt)、HBTU/HOAt (即 HBTU 和 HOAt)、DIC/HOBt (即 DIC 和 HOBt)或 BOP/HOAt (即 BOP 和HOAt)中的任何一对为缩合剂，进行接肽反应，得保护的三十二肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得奈西利肽粗品，其特征在于，所述步骤有下述特点 一是所述固相合成树脂是溴化王树脂；及 一是采用DMF/DCM混合溶剂为活化溶剂，预先溶解具有Fmoc保护基团的氨基酸和缩合齐U，反应体系外进行活化，再加入到反应体系中。
2.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸包括如下步骤 (a)将王树脂、PBr3>Fmoc-His (Trt) -OH和DIPEA混合，反应得到溴化王树脂； (b)在溴化王树脂中，加入脱保护剂进行处理，然后树脂用DMF洗涤，加入用DMF/DCM混合溶剂溶解的具有Fmoc保护基团的氨基酸、缩合剂的混合物，接肽反应后再加入脱保护剂处理，再加入用DMF/DCM混合溶剂溶解的具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此重复，获得FmoC-Serl-Pro2-Lys3-Met4-Val5-Gln6-Gly7-Ser8-Gly9-Cysi0-Phell-Glyi2-Arg13-Lysi4-Meti5-Asp16-Arg17-I Iel8-Seri9-Ser2o-Ser2i-Ser22-Gly23-Leu24-Gly25-Cys26-Lys27-Val28-Leu29-Arg3o-Arg31-His32-树脂； 所说的具有Fmoc保护基团的氨基酸，依次为(1)Fmoc-His(Trt)-OH 或 Fmoc-His-OH、 (2)Fmoc-Arg (Pbf ) -OH 或 Fmoc-Arg (HCl) -0H、 (3)Fmoc-Arg (Pbf ) -OH 或 Fmoc-Arg (HCl) -0H、(4)Fmoc-Leu-OH^(5)Fmoc-Val-OH.(6)Fmoc-Lys(Boc)-0H、(7)Fmoc-Cys(Trt)-OH或 Fmoc-Cys(Acm)-0H、(8)Fmoc-Gly-OH.(9)Fmoc-Leu-OH^(10)Fmoc-Gly-OH.(11)Fmoc-Ser(tBu)-OH或 Fmoc-Ser-OH、(12)Fmoc-Ser(tBu)-OH或 Fmoc-Ser-OH、、(13)Fmoc-Ser(tBu)-OH或 Fmoc-Ser-OH、、(14)Fmoc-Ser(tBu)-OH或 Fmoc-Ser-OH、、(15)Fmoc-Ile-0H、(16)Fmoc-Arg(Pbf)-OH或 Fmoc-Arg(HCl) -OH、、(17)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、(18)Fmoc-Met-OH、(19)Fmoc-Lys(Boc)-OH、(20)Fmoc-Arg(Pbf)-OH或 Fmoc-Arg(HCl)-OH、(21)Fmoc-Gly-0H、(22)Fmoc-Phe-OH、(23)Fmoc-Cys(Trt)-OH 或 Fmoc-Cys(Acm)-OH、(24)Fmoc-Gly-0H、(25)Fmoc-Ser(tBu)-OH或 Fmoc-Ser-OH、(26)Fmoc-Gly-0H、(27)Fmoc-Gln(Trt)-OH、(28)Fmoc-Val-0H、(29)Fmoc-Met-OH、(30)Fmoc-Lys(Boc)-OH、(31)Fmoc-Pro-OH、(32)Fmoc-Ser(tBu)-OH或 Fmoc-Ser-OH。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，依次连接22至18位残基的Fmoc-氨基酸时，所述缩合剂为DIC/HOBt、或DIC/Cl-HOBt和选自下述的一种或一种以上的混合TBTU/HOBt、HBTU/HOBt 和 HATU/HOAt。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，依次连接22至18位残基的Fmoc-氨基酸时，缩合反应温度为0-5°C。
5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，依次连接22至18位残基的Fmoc-氨基酸时，I. 0-3. 0倍量的HOBt或Cl-HOBt, I. 0-3. 0倍量的DIC试剂，溶解在5ml-10ml/g树脂的DMF和DCM溶剂中的混合溶液，反应30-60分钟后加入I. 0-3. 0倍量的DIC试剂。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，以DMF和DCM的混合溶液的总体积计，其中DMF的百分含量为40-60%。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，依次连接17、13、8位残基的Fmoc-Arg(Pbf)-OH时，将五氟苯酚作为活化试剂。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，依次连接12、9、7、5位残基的Fmoc氨基酸时，2. 0-5. 0倍量的Fmoc保护氨基酸，2. 0-5. 0倍量的H0Bt/Cl_H0Bt，2. 0-5. 0倍量的DIPEA试剂，溶解在5ml-10ml/g固相合成树脂的DMF和DCM溶剂中的混合溶液，在0_5°C加A 2. 0-5. 0 倍量的 HBTU/HATU 或 TBTU。
9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，依次连接10、6、4至I位残基的Fmoc氨基酸时，I. 0-3. 0倍量的Fmoc保护氨基酸，2. 0-6. 0倍量的H0Bt/Cl_H0Bt，I. 0-3. 0倍量的DIC试剂，溶解在5ml-10ml/g固相合成树脂的DMF和DCM溶剂中的混合溶液，反应30-60分钟后继续加入I. 0-3. 0倍量的DIC试剂。
全文摘要
本发明公开了一种奈西利肽粗品的固相制备方法。所述方法包括步骤以固相合成树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得保护的三十二肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用TBTU/HOBt、HBTU/HOBt、BOP/HOBt、TBTU/HOAt、HBTU/HOAt、DIC/HOBt或BOP/HOAt中的任何一种为缩合剂，进行接肽反应，得保护的三十二肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得奈西利肽粗品，所述步骤有下述特点一是所述固相合成树脂是溴化王树脂；及一是采用DMF/DCM混合溶剂为活化溶剂，预先溶解具有Fmoc保护基团的氨基酸和缩合剂，反应体系外进行活化，再加入到反应体系中。
文档编号C07K14/575GK102702342SQ20121023440
公开日2012年10月3日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者张国庆, 张若平, 方路, 白俊才 申请人:上海昂博生物技术有限公司