专利名称：制备再生丝素蛋白的方法及其产品和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，特别涉及制备再生丝素蛋白的方法，还涉及由该制备方法制得的再生丝素蛋白和应用。
背景技术：
蚕丝是天然大分子聚合物，天然桑蚕丝主要由蚕丝蛋白和丝胶组成。桑蚕丝核壳结构，夕卜层包覆丝胶蛋白(Sericin),内层为丝素蛋白(Silk Fibroin,简称SF),其中丝素蛋白含量约为70% 80%。丝素蛋白主要由3种蛋白质成分组成，分别为350kd的H链蛋白、25kd的L链蛋白及30kd的P25蛋白，其中H链蛋白L链蛋白P25蛋白的摩尔比为6 :6 :1。H链蛋白为疏水性蛋白质，主要为丝纤维提供类结晶结构，决定丝线强度山链蛋白为亲水性蛋白，弹性相对较强。丝素蛋白具有良好的亲和性，无毒、无污染、无刺激性、组织相容性好，应用于体内安全；具有良好的生物可降解性，可塑性强，可制成纤维、溶液、粉、膜以及凝胶等。所以它是用作药物载体的最佳原材料之一。但是蚕丝中的蛋白结构有的疏水片层结构(折叠片层)，也含有α-螺旋结构及无规则卷曲。研究表明丝蛋白的α-螺旋结构及无规则卷曲比折叠片层结构能加速酶的降解。所以对于药物载体研究而言，丝素蛋白二级结构应以改造为β_折叠片层才能显著提高固定酶的酶稳定性。而天然丝素蛋白不溶于水，可溶于强酸强碱和一些中性盐(如锂、锶、钡的氯化物、溴化物、碘化物，以及硫氰酸盐和氯化锌)溶液，在强酸和强碱中丝素蛋白的生物活性很难得以较好保存，中性盐如锂锶钡的氯化物、溴化物、碘化物，以及硫氰酸盐对人体有危害，因此也不适宜用于降解丝素蛋白。因此，急需一种制备再生丝素蛋白的方法，丝素蛋白溶解性好，制得的再生丝素蛋白β_折叠片层比例升高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供制备再生丝素蛋白的方法，其制备方法简单，丝素蛋白溶解性好，固定酶后有利于提高酶的稳定性。为实现上述发明目的，技术方案为
制备再生丝素蛋白的方法，将脱胶蚕丝加入钙醇溶液，水浴溶解，离心去除悬浮杂质，透析，干燥，得再生丝素蛋白。所述钙醇溶液为钙盐、醇与水的混合液或含水钙盐与醇的混合液。本发明中钙醇溶液为所述钙醇溶液为CaCl2、醇与水摩尔比为1:2:8的混合液或Ca(NO3)2 4Η20与醇摩尔比为1:2的混合液，所述醇为甲醇或乙醇。优选的，所述钙醇溶液为CaCl2、乙醇与水的摩尔比为1:2:8的混合液。优选的，加入所述钙醇溶液的量为钙醇溶液与脱胶蚕丝的重量比为100 :2_10。
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本发明中，将脱胶蚕丝完全溶解即可，然后除去杂质，优选的，所述水浴溶解是在温度为50-70°C的水浴中溶解1-2小时；所述离心是5000rpm、离心10分钟；所述透析是将所述上清夜装入截留分子量为6000的透析袋，透析2-3天；所述干燥为真空干燥。
本发明中脱胶蚕丝可以按照现有技术进行脱胶处理进行脱胶处理，优选为，取蚕丝，先用质量分数为0.1%-10%的十二烷基硫酸钠溶液，煮沸I小时，然后用去离子水冲洗，再用质量分数为O. 1%-10% Na2CO3溶液，再煮沸I小时，然后用去离子水冲洗，干燥，得脱胶蚕丝。本发明的目的之二在于提供利用上述制备方法制得的再生丝素蛋白，技术方案为
利用所述方法制备的再生丝素蛋白。本发明的目的之三在于提供再生丝素蛋白的应用，生物降解性好，能够提高酶的稳定性，技术方案为
所述再生丝素蛋白在酶固定化的载体中的应用。本发明中可以用于各种酶的固定，如固定解除毒素的葡萄糖氧化酶，用于有机磷农药残留快速检测固定化的小麦酯酶，用于食品加工中的淀粉酶或脂肪酶等，优选为L-天冬酰胺酶。本发明有益效果在于本发明公开的再生丝素蛋白的制备方法，制备方法简单，未使用强酸或强碱，便于保存，蛋白质不易失活；也未使用对人体有危害的化学物质，用作载体对生物体无危害，本发明将脱胶蚕丝通过钙醇溶液处理，将丝素蛋白的溶解性由脱胶丝蛋白的疏水性变为亲水性，钙醇溶液处理后，蛋白结构完整性与脱胶类似，变化不大，二级结构主要为β_折叠片层，无规则卷曲结构减少，这个结构有利于丝蛋白形成类似于口袋似的结构，能更好地容纳酶，结合更多的酶，并能有效保护容纳的酶免受生物体内降解酶的降解，进而提高酶在生物体中的稳定性及半衰期。此外再生丝素蛋白与合成药物载体具有生物相容性、生物体可降解等优点，再生丝素蛋白素固定酶后能降低酶类物质的免疫原性，能显著降低酶的毒副作用，具有广泛的应用前景。本发明中，酶固定在载体上形成固定化酶，因此可以重复使用，提高酶的使用效率，降低成本，使用后便于分离、纯化，产品收率高，质量好，并且固定化酶对热、PH的稳定性提高，对抑制剂的敏感性降低，可较长时间的使用和储藏；催化过程更易控制。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中
图I是脱胶蚕丝扫描电镜观察图。图2是再生丝素蛋白扫描电镜观察图(A =Ca(NO3)2 4Η20_甲醇处理的再生丝素蛋白；B Ca (NO3)2 4H20-乙醇处理的再生丝素蛋白；C =CaCl2-甲醇-水处理的再生丝素蛋白；D =CaCl2-乙醇-水处理的再生丝素蛋白)。图3是再生丝素蛋白SDS-PAGE电泳(M为蛋白marker ;A SCa(NO3)2 4H20_甲醇处理的再生丝素蛋白；B为Ca(NO3)2 4H20-乙醇处理的再生丝素蛋白；C为CaCl2-甲醇-水处理的再生丝素蛋白；D为CaCl2-乙醇-水处理的再生丝素蛋白)。图4是脱胶蚕丝与再生丝素蛋白傅立叶红外光谱图谱(A为脱胶蚕丝检测结果；B为Ca(NO3)2 4H20-甲醇处理的再生丝素蛋白检测结果；C为Ca(NO3)2 4H20_乙醇处理的再生丝素蛋白检测结果；D为CaCl2-甲醇-水处理的再生丝素蛋白检测结果；E为CaCl2-乙醇-水处理的再生丝素蛋白检测结果)。图5是脱胶蚕丝与再生丝素蛋白X-射线衍射图谱(A为脱胶蚕丝检测结果；B为Ca (NO3) 2 4H20-甲醇处理的再生丝素蛋白检测结果；C为Ca(NO3)2 4H20_乙醇处理的再生丝素蛋白检测结果；D SCaCl2-甲醇-水处理的再生丝素蛋白检测结果；E SCaCl2-乙醇-水处理的再生丝素蛋白检测结果)。图6是脱胶蚕丝与再生丝素蛋白固相核磁共振图谱(A为脱胶蚕丝检测结果出为Ca (NO3) 2 4H20-甲醇处理的再生丝素蛋白检测结果；C为Ca(NO3)2 4H20_乙醇处理的再生丝素蛋白检测结果；D SCaCl2-甲醇-水处理的再生丝素蛋白检测结果；E SCaCl2-乙醇-水处理的再生丝素蛋白检测结果)。
图7是脱胶蚕丝与再生丝素蛋白固定L-天冬酰胺酶酶活性测定(A为脱胶蚕丝交联L-天冬酰胺酶酶活性测定结果；BSCa(N03)2 4H20-甲醇处理的再生丝素蛋白固定L-天冬酰胺酶酶活性测定结果；C为Ca(NO3)2 4H20-乙醇处理的再生丝素蛋白固定L-天冬酰胺酶酶活性测定结果；DSCaCl2-甲醇-水处理的再生丝素蛋白固定L-天冬酰胺酶酶活性测定结果；E为CaCl2-乙醇-水处理的再生丝素蛋白固定L-天冬酰胺酶酶活性测定结果)。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。氨基酸的缩写如下
甘氨酸Gly G ;丝氨酸Ser S ;丙氨酸Ala A ;苏氨酸Thr T ;缬氨酸Val V ;异亮氨酸Ile I ；亮氨酸Leu L ;酪氨酸Tyr Y ;苯丙氨酸Phe F ;组氨酸His H ；脯氨酸Pro P ；天冬氨酸Asp D ；甲硫氨酸Met M ;谷氨酸Glu E ;色氨酸Trp W ;赖氨酸Lys K ;半胱氨酸Cys C ;精氨酸Arg R。实施例I制备再生丝素蛋白
取蚕丝，加入质量分数为O. 1%-10%的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，煮沸I小时，然后用去离子水冲洗,再加入质量分数为O. l°/o-10% Na2CO3溶液，再煮沸I小时，用去离子水冲洗，然后在65°C条件下干燥过夜，获得脱胶蚕丝。通过脱胶使蚕丝中的丝胶溶解，此步骤中SDS溶液的质量分数为O. 25%和Na2CO3溶液的质量分数为O. 25%脱胶效果最佳，SDS溶液和Na2CO3溶液加入量相当于蚕丝重量的100-1000倍效果最佳，脱胶后将脱胶蚕丝用扫描电镜观察，结果如图I所示。配制钙醇溶液钙醇溶液包括CaCl2-乙醇-水、CaCl2-甲醇-水、Ca (NO3) 2 4H20_甲醇和Ca(NO3)2 4H20-乙醇共四种。CaCl2-乙醇-水为CaCl2、乙醇和水按照1:2:8的摩尔比混合，室温下溶解，即得； CaCl2-甲醇-水为CaCl2、甲醇和水按照1:2:8的摩尔比混合，室温下溶解，即得；
Ca (NO3) 2 4H20-甲醇为Ca (NO3) 2 4H20和甲醇按1:2的摩尔比混合后，室温下磁力搅拌直至完全溶解，即得；
Ca (NO3) 2 4H20-乙醇为Ca (NO3) 2 4H20和乙醇按照1:2的摩尔比混合后，室温下磁力搅拌直至完全溶解，即得。在四种溶液中分别加入脱胶蚕丝至溶液中脱胶蚕丝的质量分数约为2_10%，然后放入50-70°C水浴中至丝素蛋白纤维完全溶解，溶解后的溶液呈黄色黏性状，得再生丝素蛋白溶液，然后将所得再生丝素蛋白溶液以5000rpm的转速离心10分钟，收集上清，上清液分别装入透析袋中(截留分子量为6000)，自来水透析1-2天，换超纯水透析一天后，放入真空冷冻干燥机进行干燥，得再生丝素蛋白，保存于4°C，备用。溶解过程中也可以通过其他加热方式进行保温，如油浴、金属浴等，也可以用其他助溶方式进行溶解，如超声助溶，溶解过程中观察四种溶液的溶解速度，溶解相同质量的蚕丝，CaCl2-乙醇-水溶解速度最快，且溶解后的溶液呈黄色黏性透明状。
四种溶液处理结果表明，脱胶蚕丝在四种溶液中均能溶解，但是经过再生丝蛋白处理研究发现CaCl2-乙醇-水溶液对丝素蛋白纤维的溶解最好。实施例2再生丝素蛋白扫描电镜观察
为了进一步观察再生丝素纤维溶解情况，将脱胶蚕丝与四种溶液制得的再生丝素蛋白进行扫描电镜观察，脱胶蚕丝电镜观察如图I所示，四种溶液制得的再生丝素蛋白采用扫描电镜进行观察如图2所示。由图I可知，脱胶蚕丝结构保持完整，但从图2中A可以看出，Ca(NO3)2 4H20-甲醇处理后脱胶蚕丝发生了溶解，丝素蛋白有少量丝素纤维残余，溶解后的丝素蛋白呈比较均匀的颗粒状；从图2中B和C可以看出，Ca(NO3)2 4H20-乙醇和CaCl2-甲醇-H2O处理的脱胶蚕丝发生了溶解，但是与Ca(NO3)2 4H20-甲醇处理相比丝素蛋白溶解较差，部分丝素纤维未溶解；从图2中D可以看出，CaCl2-乙醇-水处理的脱胶蚕丝溶解效果好，其中丝素蛋白全部溶解，呈片状。另外，Ca(NO3)2 4H20-甲醇处理的丝素蛋白冻干后为颗粒状，而CaCl2-乙醇-水处理的丝素蛋白冻干后为片状。电镜扫描图片表明了四种溶液中CaCl2-乙醇-水对丝素蛋白的溶解性最好，其次是Ca(NO3)2 4H20_甲醇，Ca(NO3)2 4H20-乙醇和CaCl2-甲醇-H2O对丝素蛋白也能溶解，但溶解性较差。实施例3再生丝素蛋白SDS-PAGE电泳
蚕丝富含丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸氨基酸，由约300kDa的重链及26 kDa的轻链通过二硫键连接，分子量为30 kDa的P25糖蛋白通过疏水相互作用与轻链及重链的复合物结合共同构成蚕丝分子，分子量约400 kDa。蚕丝蛋白在热、化学试剂、pH条件下分子间的结构会被破坏。本发明的钙醇溶液处理之后，脱胶蚕丝的结构会改变，为测定不同处理后再生丝素蛋白分子量，选用质量分数为12%的分离胶和4%的浓缩胶质量分数，上样量为20 μ L进行再生丝素蛋白分子量检测。在垂直板电泳槽上电泳，电流为80mA，电泳约2小时。电泳结束后考马斯亮蓝G-250染色，脱色，电泳结果见图3。由图3可知，脱胶蚕丝不溶于或少溶于水，脱胶蚕丝SDS-PAGE观察不到明显的条带(a)。Ca (NO3) 24H20-甲醇、Ca (NO3) 2_4Η20_乙醇、CaCl2-甲醇-水及CaCl2-乙醇-水溶液均能溶解脱胶蚕丝的丝素蛋白，破坏其蛋白间的二硫键及疏水相互作用结构。Ca(NO3)24Η20-甲醇处理的丝蛋白分子量范围为95 KDa 170kDa, Ca (NO3) 24H20 -乙醇处理的分子量范围为100 KDa 170 kDa。CaCl2-甲醇-水处理的分子量范围为140 170 kDa，而CaCl2-乙醇-水处理的分子量为100 300 kDa。处理后的再生丝素蛋白均观察到两个小分子量的蛋白 17和 26 kDa，但是CaCl2-乙醇-水处理的再生丝蛋白只有很弱的条带，表明CaCl2-乙醇-水处理的丝蛋白小分子量残基最少，大分子量残基较其余3种溶液处理大，说明CaCl2-乙醇-水处理对于丝蛋白间二硫键及疏水相互作用的破坏较其余溶液处理温和。实施例4再生丝素蛋白衰减全反射傅立叶变换红外光谱
丝素蛋白主要由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等18种氨基酸组成。其特征氨基酸带有氨基(-NH)和羧基(-C00H)，具有两性电解质性质。衰减全反射傅立叶变换红外光谱检测丝蛋白的结果表明3435. 7 cm^U620cm^处为酰氨I峰的特征峰(C=O键)，1513 cnT1左右为酰氨II峰(N-H弯曲)，1240 cm 1270cm-1处为酰氨III峰的特征峰(C-N键)，625 cnT1 695cm 1 为酸氛 V 的吸收峰，1372. 6 cm \ 1016. 6 cm \2894. 3 cm \3435. 7 cm \894. 2 cm 1处吸收峰主要是纤维素的特征峰。此外，吸收峰在660 cnT1处主要为无规则卷曲；吸收峰在1655 cm \ 1546 cm \ 1270 cm \625 cm1 主要为 ct -螺旋结构;吸收峰在 1630 cm \ 1520cm'1240 cm'695 cnT1主要为β-折叠片层。不同钙醇溶液制备的再生丝素蛋白的衰减全反射傅立叶转换红外光谱分析均用 采用Bruker TENSOR 27 FT-IR光谱仪。衰减全反射附件用于获得各处理的丝素蛋白在溶剂中的波谱。所有扫描均用平均32次重复扫描从190(T800 cnT1进行，结果见图4。由图4可知,再生丝素蛋白β -折叠片层特征吸收峰在1630 cm > 1530 cm > 1240 cm—1左右，随机卷曲结构的吸收峰在1650 cm > 1645 cm > 1550 cm 1230 cm-1左右，α-螺旋结构特征吸收峰在1655 cnT1左右。由此可知，CaCl2-乙醇-水处理的再生丝素蛋白在1630 cm'1530cm ―1等处有明显的吸收峰，为β_折叠片层结构。实施例5再生丝素蛋白X-射线衍射
将四种钙醇溶液制备的再生丝素蛋白进行X-射线衍射，采用北京普析通用仪器有限公司生产的XD-3多晶X射线衍射仪(铜靶，λ = O. 15418 nm),电压36 Kv,电流20 mA。扫描范围为5°- 40 °(2Θ)，以每分钟I °的速度进行扫描。通过X射线衍射仪测得的2 Θ，计算分子间空间距离公式为D=X/(2Xsin(0))，&D=O.O752/(sin Θ ) nm，如，扫描获得
2Θ =20。，那么空间距离即为D=O. 0752/(sin 10。)nm，即D-space为O. 43 nm。研究表明silk I 分子空间距离(D-spacings)主要为 O. 74 nm、0. 56 nm、0. 44 nm、0. 41 nm、0. 36 nm、
0.32 nm及0.28 nm。而silk II的分子空间距离主要为0. 98 nm、0. 48 nm及O. 43 nm。如图5所示，Ca(NO3)24H20-乙醇、Ca(NO3)24H20 -甲醇及CaCl2-甲醇-水制备的再生丝素蛋白空间距离为O. 47nm (2 Θ =18. 4 °)，对应为silkll结构。Silk I结构主要以无规则卷曲为主，包括少量β -转角(type II β-turn)和α -螺旋结构；Silk II结构主要为反平行β -折叠片层(anti-parallel β -pleated sheet)。Silk I 和 Silk II 构象可通过改变温度、溶剂极性、pH值、应力等条件进行转变。CaCl2-乙醇-水处理的再生丝素蛋白X-射线衍射
2Θ 扫描结果为 19. 4。、20· 3。、24· 6。及 29. 3。，空间距离为 O. 44 nm、0. 41 nm、0. 35 nm 及
O.30 nm，主要对应于silk I结构。此外，CaCl2-乙醇-水制备的丝素蛋白较Ca(NO3)24H20-乙醇、Ca (NO3) 24H20 -甲醇及CaCl2-甲醇-水制备的丝素蛋白在2 Θ =20. 3。处有明显吸收峰，并且CaCl2-乙醇-水处理蚕丝增加了丝蛋白的晶体度。实施例6再生丝素蛋白固相核磁共振
所有样品均由 13C CP/MAS NMR (AVANCE III 400, Bruker, Germany)固态核磁共振仪进行二级结构的鉴定，结果见图6。其中16 18ppm为Ala Ca, α代表松散螺旋、无规线圈结构。20 22ppm为Ala C β，β为反平行β -折叠片层结构。Ala C0吸收峰在15. 2ppm、Ala Ca吸收峰在52. 4ppm为有规律的螺旋结构。从检测结果可以看出，Ca(NO3)24H20_乙醇、Ca(NO3)24H20 -甲醇及CaCl2-甲醇-水处理蚕丝增加了 Ala C0的吸收峰，降低了 GlyC=O (169. I ppm)的吸收峰，表明 Ca(NO3)24H20_ 乙醇、Ca(NO3)24H20 -甲醇及 CaCl2-甲醇处理蚕丝，使其发生了化学键的位移。而CaCl2-乙醇-水处理蚕丝在这些位点的吸收峰与脱胶蚕丝相似，表明CaCl2-乙醇处理能有效保护丝素蛋白分子内部结构。实施例7再生丝素蛋白固定L-天冬酰胺酶酶活性测定
各称取Ca (NO3) 24H20-甲醇、Ca (NO3) 24H20 -乙醇、CaCl2-甲醇-水及CaCl2-乙醇-水处理的再生丝素蛋白50mg，分别加入2 mL PBS溶解的L-天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶的浓度为2mg/mL)、lmL保护剂天冬酰胺(5mg/L)、加入PBS (pH7. 4)及戊二醛溶液(其终浓度为
O.05%),至终体积为5mL。搅拌,放置于4°C交联固定12小时。然后加入IOOmg甘氨酸终止反应。然后分别用O. 05 M Tris-HCl缓冲液(pH 8. 6)和蒸馏水充分冲洗至少3次，每次在4°C、IOOOOrpm条件下，离心10分钟)，以洗去粘在丝胶上的游离L-天冬酰胺酶和未交联的戊二醛。然后用ImL的Tris-HCl缓冲液重悬再生丝素蛋白，37°C水浴10分钟，分别加入·2mLTris-HCl缓冲液溶解的L-天冬酰胺，37°C水浴10分钟，各加入IOOmg的三氯乙酸(TCA)终止反应。3000rpm离心5分钟,各取其中O. 5mL上清至预装ImL Nessler试剂的新离心管中(100毫升体积Nessler试剂含35g碘化钾、I. 3g氯化汞溶解于70毫升水中，然后加入30ml 4N氢氧化钾溶液)，混合后于室温下静置10 min,再各取50 μ L混合液至酶联板中，再分别加入150μ L TriS-HCl缓冲液，重复3次，用分光光度计在450nm处测定吸光度，以空白管为对照测定吸光度，取平均值计算固定化酶的活性或相对活性。活性测定检测实验重复3次，最后计算平均值。结果见图7，结果表明，CaCl2-乙醇-水与CaCl2-甲醇-水处理蚕丝天冬酰胺酶活性较Ca (NO3) 24H20-乙醇和Ca (NO3) 24H20 -甲醇处理酶活性高，其中CaCl2-乙醇-水处理丝蛋白天冬酰胺酶活性最高，表明CaCl2-乙醇-水处理优于其他处理。综上所述，采用CaCl2-乙醇-水处理丝蛋白制备药物靶向载体是一种较理想的制备方法。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明。
权利要求
1.制备再生丝素蛋白的方法，其特征在于将脱胶蚕丝加入钙醇溶液，水浴溶解，离心去除悬浮杂质，透析，干燥，得再生丝素蛋白； 所述钙醇溶液为钙盐、醇与水的混合液或含水钙盐与醇的混合液。
2.根据权利要求I所述制备再生丝素蛋白的方法，其特征在于所述钙醇溶液为CaCl2、醇与水摩尔比为1:2:8的混合液或Ca (NO3) 2 4H20与醇摩尔比为1:2的混合液，所述醇为甲醇或乙醇。
3.根据权利要求2所述制备再生丝素蛋白的方法，其特征在于所述钙醇溶液为CaCl2、乙醇与水的摩尔比为1:2:8的混合液。
4.根据权利要求3所述制备再生丝素蛋白的方法，其特征在于加入所述钙醇溶液的量为钙醇溶液与脱胶蚕丝的重量比为100 :2-10。
5.根据权利要求1-4任一项所述制备再生丝素蛋白的方法，其特征在于所述水浴溶解是在温度为50-70°C的水浴中溶解1-2小时；所述离心是5000rpm、离心10分钟；所述透析是将所述上清夜装入截留分子量为6000的透析袋，透析2-3天；所述干燥为真空干燥。
6.根据权利要求5所述制备再生丝素蛋白的方法，其特征在于所述脱胶蚕丝由以下方法制备取蚕丝，先用质量分数为0.1%-10%的十二烷基硫酸钠溶液，煮沸I小时，然后用去离子水冲洗，再用质量分数为O. l°/o-10% Na2CO3溶液，再煮沸I小时，然后用去离子水冲洗，干燥，得脱胶蚕丝。
7.利用权利要求1-6任一项所述的方法制备的再生丝素蛋白。
8.权利要求7所述再生丝素蛋白在酶固定化的载体中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述酶为L-天冬酰胺酶。
全文摘要
本发明公开了制备再生丝素蛋白的方法，具体为将脱胶蚕丝加入钙醇溶液，水浴溶解，离心去除悬浮杂质，透析，干燥，得再生丝素蛋白；制备方法简单，丝素蛋白质溶解性好，制得的再生丝素蛋白结构主要为β-折叠片层，无规则卷曲结构减少，能够用作酶固定化载体，将酶固定在该再生丝素蛋白上能有效保护酶被生物体内降解酶降解，进而提高酶的稳定性及半衰期。
文档编号C07K1/14GK102775465SQ20121027074
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月1日 优先权日2012年8月1日
发明者吴玉章, 杨霞 申请人:中国人民解放军第三军医大学