专利名称：防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及禽类用生物制品技术领域，尤其是一种防治I型和III型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法。
背景技术：
鸭病毒性肝炎(Duck virus h印atitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起的一种雏鸭高度致死性、急性传染病。鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus, DHV)包含嗜肝病毒科、 星状病毒科和小核糖核酸病毒科3个病毒科的4种病毒。嗜肝病毒科的鸭肝炎病毒引起鸭乙型肝炎，其对鸭没有显著的致病性；星状病毒科引起II型鸭肝炎，目前为止仅英国有发病报道；小核糖核酸病毒科主要引起I型和III型鸭肝炎。
I型和III型鸭肝炎在临床症状和病理变化上类似，但中和试验和荧光抗体试验证实二者无共同抗原成分，且III型鸭肝炎病毒的致病力不如I型鸭肝炎病毒。
I型鸭肝炎病毒致死性最强，该病毒呈球形或类球形，直径在20-40nm，无囊膜，无血凝性，可在鸭、鸡、鹅胚尿囊腔增殖。病毒抵抗力强，在自然环境中可较长时间存活。由 DHV-1引起的鸭病毒性肝炎主要侵害1-3周龄雏鸭，发病严重，传播迅速，病程短，临床表现为发病急、死亡快，剖解病变特征主要为肝脏有明显的出血点、出血斑，雏鸭通常在出现症状后Ih内死亡，10日龄内的雏鸭感染后死亡率可达90%以上。该病呈世界性分布，首次报道于1945年美国长岛，1954年在英国病鸭中分离到该病毒，德国、意大利、印度、法国、苏联等相继有本病的发生。我国1963年最早报道了该病在上海地区出现，20世纪80年代初期起本病在我国再次流行，之后北京、福建、浙江等多个地区爆发本病，流行区域广，给我国养鸭业造成了严重损失。
DHV-1II属于小RNA病毒，直径约30nm,但与I型鸭肝炎病毒无关，由中和抗体试验和荧光抗体实验证实它们没有共同抗原成分。Toth于1969年在美国长岛首次报道了 DHV-1II引起的鸭病毒性肝炎，我国在1998年由刘兆宇等报道了III型DHV感染的发生。该疾病不如I型鸭肝炎病毒感染严重，雏鸭的死亡率很少超过30%，但大体病变与I型鸭肝炎病毒引起的相似。
近年来我国不断从病鸭中同时分离到DHV-1和DHV-1II，证明相当多地区的鸭病毒性肝炎为DHV-1和DHV-1II的混合感染，且混合感染的病死率高于任何一种的单一感染，而治愈率低于任何一种的单一感染；而现有的鸭病毒性肝炎疫苗、高免血清或高免卵黄抗体绝大多数是针对I型鸭肝炎病毒研制的，因此对于DHV-1II单一感染及DHV-1和 DHV-1II混合感染的治疗效果均不理想，给鸭病毒性肝炎的防治带来了新的挑战。发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种稳定性好、治疗效果明显、特异性强、制备安全方便的防治I型和III型鸭病毒性 肝炎单一感染及混合感染的二价蛋黄抗体的制备方法。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是一种防治I型和III型鸭病毒性肝炎的 二价蛋黄抗体的制备方法，包括以下步骤I.制备I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋(I)选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防 细菌感染；(2)制备I型和III型鸭肝炎病毒二价灭活苗A.制水相用冷冻保存的I型和III型鸭病毒性肝炎毒种稀释后分别接种10日龄鸭胚， 24-72h后分别无菌采集死亡鸭胚胚体及胚液，匀浆，冻融后离心，取上清液，等体积混合制 成病毒液并对其进行灭活处理，取灭活后的病毒液与无菌吐温-80进行混合后制成水相；B.制油相取白油、司本-80和硬脂酸铝，并将三种混合，搅拌均匀后，高压灭菌后制成油相；C.制备油乳剂灭活苗将上述步骤I- (2) -A所制得的水相和步骤I- (2) -B所制得的油相进行混匀即 得;(3)免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋将步骤I- (2)所制备的二价灭活苗免疫步骤I- (I)处理过的高产蛋鸡，进行免 疫程序，待效价检测均达到要求后收集鸡蛋，即为I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡 蛋;2.利用步骤I制备的I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋制备蛋黄抗体(I)分离高免鸡蛋蛋黄将步骤I制备的高免鸡蛋进行消毒程序，然后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分 离；(2)提取卵黄抗体将步骤2- (I)所分离的蛋黄用TBS作为缓冲液，将蛋黄液稀释8倍后，加入0. 2% 的辛酸，沉淀脂类，蛋黄抗体保留在上清液中；再将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛 的终浓度达到0. 1% (V/V)，对其进行过滤操作后，取滤液4°C保存备用；(3)配制、保存将步骤2- (2)所得滤液进行I型和III型鸭肝炎病毒抗体效价测定，用0. 01M、 PH7. 2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1:320 ;然后加入终浓度为0. 01%(V/V)的吐温-80 作为稳定剂，搅拌均匀后进行无菌定量分装。上述步骤I- (2)-A中的灭活处理是对病毒液用0. 1%的甲醛37°C密封灭活48h。上述步骤I- (2) -A中病毒液与无菌吐温-80的混合比例为96:4 (V/V)。上述步骤I- (2)-B中白油、司本和硬脂酸铝的混合比例为94:6:2 (V/V/W)。上述步骤I- (2) -C中水相和油相的混合比例为1:2 (V/V)0上述步骤I- (3)中的免疫程序是对免疫产蛋鸡进行肌肉注射，免疫次数为3次， 剂量分别为0. 5ml/只，I. Oml/只，I. 5ml/只，第I次与第2次间隔10天，第2次与第3次 间隔14天，3次免疫后正常饲喂10天，此后每3天取样进行效价检测至I型和III型鸭肝炎 病毒抗体效价均达到要求。
上述步骤2- (I)中的消毒程序是对高免鸡蛋用自来水冲洗干净，再用O. 05%的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干。
上述步骤2- (2)中的过滤操作是先充分搅拌均匀后密封60min，再用O. 22 μ m的微孔滤膜过滤。
与现有技术相比，本发明的有益效果是
(I)本发明制备的I型和III型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体能针对I型和III型鸭病毒性肝炎单一感染及混合感染进行有效的防治，解决现有疫苗及血清抗体、卵黄抗体对混合感染治疗无效的困境。
(2)同时本发明采用辛酸沉淀法提取I型和III型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，该法安全、价格低廉，适于大规模生产，且制备的蛋黄抗体纯度高、效价高、性质稳定、易于保存。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
本发明所涉防治I型和III型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其步骤为
1.制备I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋
(I)选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防细菌感染；
(2)制备I型和III型鸭肝炎病毒二价灭活苗
A.制水相
用冷冻保存的I型和III型鸭病毒性肝炎毒种稀释后分别接种10日龄鸭胚， 24-72h后分别无菌采集死亡鸭胚胚体及胚液，匀浆，冻融后离心，取上清液，等体积混合制成病毒液并对其进行灭活处理，取灭活后的病毒液与无菌吐温-80进行混合后制成水相， 病毒液与无菌吐温-80的混合比例为96:4 (V/V)；
所述灭活处理是对病毒液用O. 1%的甲醛37°C密封灭活48h。
B.制油相
取白油、司本-80和硬脂酸铝，并将三种混合，三者的混合比例为94:6:2(V/V/W)， 搅拌均匀后，高压灭菌后制成油相；
C.制备油乳剂灭活苗
将上述步骤1- (2) -A所制得的水相和步骤1- (2) -B所制得的油相进行混匀即得，水相和油相的混合比例为1:2 (V/V)；
(3)免疫产蛋鸡 ，制备高免鸡蛋
将步骤1- (2)所制备的二价灭活苗免疫步骤1- (I)处理过的高产蛋鸡，对免疫产蛋鸡进行肌肉注射，免疫次数为3次，剂量分别为O. 5ml/只，1. Oml/只，1. 5ml/只，第I 次与第2次间隔10天，第2次与第3次间隔14天，3次免疫后正常饲喂10天，此后每3天取样进行效价检测至I型和III型鸭肝炎病毒抗体效价均达到要求，收集鸡蛋，即为I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋；
2.利用步骤I制备的I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋制备蛋黄抗体
( I)分离高免鸡蛋蛋黄
将步骤I制备的高免鸡蛋进行消毒程序，消毒程序是对高免鸡蛋用自来水冲洗干净，再用O. 05%的百毒杀浸泡3-5min,然后用纱布擦干,用75%乙醇擦一遍晾干；然后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；
(2)提取卵黄抗体
将步骤2- (I)所分离的蛋黄用TBS作为缓冲液，将蛋黄液稀释8倍后，加入O. 2% 的辛酸，沉淀脂类，蛋黄抗体保留在上清液中；再将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到O. 1% (V/V)，对其进行过滤操作后，取滤液4°C保存备用；过滤操作是先充分搅拌均勻后密封60min,再用O. 22 μ m的微孔滤膜过滤。
(3)配制、保存
将步骤2- (2)所得滤液进行I型和III型鸭肝炎病毒抗体效价测定，用O. 01M、 PH7. 2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1:320;然后加入终浓度为O. 01% (V/V)的吐温-80作为稳定剂，搅拌均匀后进行无菌定量分装。
上述效价检测需同时满足以下两个条件
(I)中和抗体效价测定按现行《中国兽药典》2010版附录中和试验法固定病毒稀释血清法，使用检验用种毒与系列稀释的抗体中和后，分别尿囊腔接种12日龄鸭胚，连续观察5天，进行测定。中和抗体效价应不低于1:320。
(2)免疫攻毒法用3日龄易感雏鸭(鸭病毒性肝炎中和抗体效价不高于1:4) 30 只，随机分为3组。第I组为空白对照组，每只腿部肌肉注射生理盐水O. 5ml，隔离饲养；第 2组为预防组，每只腿部肌肉注射本品O. 5ml ;第3组为攻毒对照组，每只腿部肌肉注射生理盐水O. 5ml。24小时后，第I组每只腿部肌肉注射生理盐水O. 5ml ;第2组和第3组每只腿部肌肉注射检验用种毒O. 5ml (约200LD5(i)。连续观察10天后，第I组应全部健活；第2组应至少健活8只；第3组应至少死亡8只。
临床应用例
静海县某养殖户，购买一批雏鸭的2天内生长良好，饮水、采食等正常，3日龄 (2010年08月16日)开始发病，并出现死亡，4日龄发病及死亡增加。
现场可见发病雏鸭精神不振、缩颈垂翅、行动迟缓、流泪、腹泻、干脚，死前表现角弓反张。现场初诊为鸭病毒性肝炎，随后进行临床试验，并采集病料进行确诊。剖检可见主要表现肝脏肿大，表面散布大量出血点及出血斑，色黄、质脆，胆囊肿胀、质脆，脾肿大，其它器官无明显病变。
为确诊，取病死雏鸭数只，送实验室进一步检验。实验室无菌接种肝、脾、心于巧克力平板及麦康凯平板37°C培养24小时，均无细菌生长，继续培养至48小时，仍无细菌生长。 肝、脾组织处理后的样品液，接种12日龄鸭胚，连续观察10日，7/10死亡；样品液与DHV-1 高免血清中和后，接种12日龄鸭胚，连续观察10日，3/10死亡；样品液与DHV-1II高免血清中和后，接种12日龄鸭胚，连续观察10日，5/10死亡^fDHV-1和DHV-1II高免血清 1:1 (v/v)混合后，与样品液中和，接种12日龄鸭胚，连续观察10日，无死亡胚。以样品液在12日龄鸭胚盲传3代后的尿囊液为样品，进行RT-PCR检测，可见DHV-1和DHV-1II相应条带。因此，该病例确诊为DHV-1和DHV-1II的混合感染。
对该鸭群进行临床试验，将雏鸭分为两组
(1)试验组共1227只，以2倍量腿部肌肉注射，进行紧急预防；
(2)对照组共200只，不做处理。
连续观察I个月。
实验结果如下
(1)试验组注射后死亡下降，2天后停止死亡，未出现新的发病，恢复良好，无复发。试验期间死亡共78只，死亡率为6. 36%。
(2)对照组死亡继续增加，5天后停止死亡。雏鸭恢复缓慢，后期有少量复发死亡。试验期间死亡共107只,死亡率为53. 5%。
临床应用例证明，本产品紧急预防效果良好，能迅速控制疫病的传染，无复发现象。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种防治I型和III型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤.1)制备I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋；(1)选择健康高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂专用抗生素制剂以预防细菌感染；(2)制备I型和III型鸭肝炎病毒二价灭活苗；A.制水相；用冷冻保存的I型和III型鸭病毒性肝炎毒种稀释后分别接种10日龄鸭胚，24-72h后分别无菌采集死亡鸭胚胚体及胚液，匀浆，冻融后离心，取上清液，等体积混合制成病毒液并对其进行灭活处理，取灭活后的病毒液与无菌吐温-80进行混合后制成水相；B.制油相；取白油、司本-80和硬脂酸铝，并将三种混合，搅拌均匀后，高压灭菌后制成油相；C.制备油乳剂灭活苗；将上述步骤1- (2)-A所制得的水相和步骤1- (2)-B所制得的油相进行混匀即得；(3)免疫产蛋鸡，制备高免鸡蛋；将步骤1- (2)所制备的二价灭活苗免疫步骤1- (1)处理过的高产蛋鸡，进行免疫程序，待效价检测均达到要求后收集鸡蛋，即为I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋；.2)利用步骤I制备的I型和III型鸭病毒性肝炎的二价高免鸡蛋制备蛋黄抗体；(1)分离高免鸡蛋蛋黄；将步骤I制备的高免鸡蛋进行消毒程序，然后送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；(2)提取卵黄抗体；将步骤2- (1)所分离的蛋黄用TBS作为缓冲液，将蛋黄液稀释8倍后，加入0. 2%的辛酸，沉淀脂类，蛋黄抗体保留在上清液中；再将40%甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0. 1% (V/V)，对其进行过滤操作后，取滤液4°C保存备用；(3)配制、保存;将步骤2- (2)所得滤液进行I型和III型鸭肝炎病毒抗体效价测定，用0. 01M、pH7. 2的无菌PBS稀释至中和抗体效价为1:320 ;然后加入终浓度为0.01% (V/V)的吐温-80作为稳定剂，搅拌均匀后进行无菌定量分装。
2.根据权利要求1所述的防治I型和III型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法， 其特征在于所述步骤1-(2)-Α中的灭活处理是对病毒液用0. 1%的甲醛37°C密封灭活48h。
3.根据权利要求1所述的防治I型和III型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法， 其特征在于所述步骤1- (2)-A中病毒液与无菌吐温-80的混合比例为96:4 (V/V)。
4.根据权利要求1所述的防治I型和III型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法， 其特征在于所述步骤1- (2)-B中白油、司本-80和硬脂酸铝的混合比例为94:6:2 (V/V/ W)。
5.根据权利要求1所述的防治I型和III型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法， 其特征在于所述步骤1- (2)-C中水相和油相的混合比例为1:2 (V/V)。
6.根据权利要求1所述的防治I型和III型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法， 其特征在于所述步骤1-(3)中的免疫程序是对免疫产蛋鸡进行肌肉注射，免疫次数为3次，剂量分别为O. 5ml/只，1. Oml/只，1. 5ml/只，第I次与第2次间隔10天，第2次与第3次间隔14天，3次免疫后正常饲喂10天，此后每3天取样进行效价检测至I型和III型鸭肝炎病毒抗体效价均达到要求。
7.根据权利要求1所述的防治I型和III型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法， 其特征在于所述步骤2- (I)中的消毒程序是对高免鸡蛋用自来水冲洗干净，再用O. 05%的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布擦干，用75%乙醇擦一遍晾干。
8.根据权利要求1所述的防治I型和III型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法， 其特征在于所述步骤2- (2)中的过滤操作是先充分搅拌均匀后密封60min，再用O. 22 μ m 的微孔滤膜过滤。
全文摘要
本发明公开了一种防治Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎的二价蛋黄抗体的制备方法，本发明制备的Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体能针对Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎单一感染及混合感染进行有效的防治，解决现有疫苗及血清抗体、卵黄抗体对混合感染治疗无效的困境；同时本发明采用辛酸沉淀法提取Ⅰ型和Ⅲ型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，该法安全、价格低廉，适于大规模生产，且制备的蛋黄抗体纯度高、效价高、性质稳定、易于保存。
文档编号C07K16/02GK103059131SQ201210494639
公开日2013年4月24日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者宋秀梅, 王建, 刘丽丽, 殷立伟, 葛兆宁, 王震 申请人:天津市中升挑战生物工程有限公司