专利名称：重组人血管内皮细胞生长因子-165蛋白及其生产方法
技术领域：
本发明涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物技术，具体来说涉及一种重组人血管内皮细胞生长因子-165蛋白及其生产方法。
背景技术：
血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)是一种以二硫键连接成同源二聚体的、分泌性的、糖基化的多肽因子，早期亦称作血管通透因子(vascular permeability factor, VPF),是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子(heparin-binding growth factor),可在体内诱导血管新生。人的VEGF蛋白(humanvascular endothelial growth factor, hVEGF)是于1989年由美国的两间生物科技公司的科学家分别成功纯化与鉴定，并克隆与测定了其基因序列，证明VPF与VEGF是同一基因编码的同一蛋白。VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白，以二硫键组成二聚体。VEGF分解的单体无活性，去除N2糖基对生物效应无影响，但可能在细胞分泌中起作用。由于mRNA不同的剪切方式，产生出分别 VEGF121、VEGF145, VEGF165, VEGF185, VEGF189, VEGF206 等至少 6 种蛋白形式，其中VEGFm、VEGF145, VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。VEGF165是VEGF变异体中的一种，由165个氨基酸组成，是一种糖基化的蛋白。VEGF165是血管内皮生长因子家族中促血管生成活性最强的功能性蛋白，它通过与特异性受体VEGFR-1和VEGFR-2结合，发挥生理功能。人体血管内皮细胞表面分布着一定数量的VEGF受体，称为VEGFR。血液中的VEGF与受体结合，从而激活胞内酪氨酸激酶，启动下游细胞信号级联，进而促使新脉管生长。VEGF通路的作用主要为在保存现有血管的同时促进新血管生成，但在内皮细胞生长因子数量远多于抗血管内皮细胞生长因子的情形下，会导致血管异常。肿瘤细胞的分裂生长需要大量养分，因而肿瘤部位会有大量不规则新血管生成。正常人体内促血管内皮细胞生长因子和抗血管内皮细胞生长因 子数量相对平衡，在有肿瘤生长的情况下，多种致癌因素触发致使促血管内皮细胞生长因子的数量激增，远远超过抗血管内皮细胞生长因子的作用，以血管为主的脉管大量生长，为肿瘤提供了优越的生长环境。当前的研究表明，VEGF165在伤口愈合及冠心病的治疗上显示了广阔的前景。随着对血管内皮生长因子作用机制的不断深入，人hVEGF165作为药物，其需求量将大大增加。目前，虽然该蛋白已利用大肠杆菌和酵母进行了表达，但它们的方法都存在诸多不足之处。例如利用大肠杆菌为表达宿主菌，目标蛋白的表达量很低或表达产物通常以包涵体单体蛋白的形式存在，要通过变性复性得复杂操作才能得到活性形式的hVEGF165 二聚体蛋白，从而减少了活性蛋白的产率；其次以融合蛋白的形式进行了表达，但融合的片段分子量很大且影响到了表达的重组蛋白的生物活性和二聚体的形成，所以必须要切除融合的片段，而要将蛋白、融合、未经切割的融合蛋白及加入的将融合片段与目标蛋白切除的相应蛋白酶分离开来需要很多的蛋白质纯化步骤，纯化的步骤多，蛋白质的得率就明显降低，且更可能导致目标产物的失活。最后，虽然hVEGF165已经实现了在酵母表达系统中的分泌表达，然而以毕赤酵母为表达菌，但由于糖基化的修饰，使得表达的VEGF具有极强的抗原性， 极易被人体降解。因此，开发出一种可以大量、快速、低成本的制备具有生物活性的蛋白是十分必要的。发明内容
基于此，本发明提供一种可溶性重组人血管内皮细胞生长因子-165蛋白及其生产方法，根据该方法可获得大量稳定、可溶且具有生物活性的Trx-hVEGF165融合蛋白和 hVEGF165重组蛋白。
解决上述问题的技术方案如下
一种可溶性Trx-hVEGF165融合蛋白的生产方法，主要包括以下步骤
(I)克隆hVEGF165基因用hVEGF165特异引物扩增出完整的基因片段，所用hVEGF165 特异引物中引入BamH I酶切位点和Hind III酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20_T 载体，得质粒hVEGF165/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列；
(2)构建原核表达载体将表达载体PET32和步骤(I)所得的质粒hVEGF165/ PMD20-T经过Hind III及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体 pET32/hVEGF165 ；
(3)大肠杆菌表达菌株转化子的筛选将步骤(2)所得的重组载体pET32/hVEGF165 转化到大肠杆菌T0P10菌株中，再从T0P10中提取重组载体pET32/hVEGF165 ;用热激法将重组载体pET32/hVEGF165转到表达菌株中，利用LB Amp抗性平板筛选得到包含有重组载体 pET32/hVEGF165的大肠杆菌表达菌株转化子；
(4) Trx-hVEGF165融合蛋白的表达将步骤(3)所得的pET32/hVEGF165大肠杆菌表达菌株转化子在37°C培养至OD6tltl为O. 4-0. 8时，加入浓度为O. 05-1. OmM的IPTG， 于16-20°C诱导8-12小时，超声破碎，离心取上清液，得到大量可溶性的重组融合蛋白 Trx-hVEGF165 ；
(5)Trx-hVEGF165融合蛋白的纯化利用镍亲合层析法对Trx-hVEGF165融合蛋白进行纯化，后再采用PBS透析和超滤浓缩。
一种可溶性hVEGF165 重组蛋白的生产方法，主要包括以下步骤
(I)克隆hVEGF165基因用hVEGF165特异引物扩增出完整的基因片段，所用hVEGF165 特异引物中引入BamH I酶切位点和Hind III酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20_T 载体，得质粒hVEGF165/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列；
(2)构建原核表达载体将表达载体PET28和步骤(I)所得的质粒hVEGF165/ PMD20-T经过Hind III及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体 pET28/hVEGF165 ；
(3)大肠杆菌表达菌株转化子的筛选将步骤(2)所得的重组载体pET28/hVEGF165 转化到大肠杆菌T0P10菌株中，再从T0P10中提取重组载体pET28/hVEGF165 ;用热激法将重组载体pET28/hVEGF165转入到表达菌株中，利用LB Kan抗性平板筛选得到包含有重组载体 pET28/hVEGF165的大肠杆菌表达菌株转化子；
(4) hVEGF165重组蛋白的表达将步骤(3)所述的pET28/hVEGF165大肠杆菌表达菌株转化子在37°C培养至OD6tltl为O. 4-0. 8时，加入浓度为O. 05-1. OmM的IPTG，于16_20°C诱导8-12小时，超声破碎，离心取上清液，得到大量可溶性的重组蛋白hVEGF165 ；(5) hVEGF165重组蛋白的纯化利用镍亲合层析法对hVEGF165重组蛋白进行纯化，后再米用PBS透析和超滤浓缩。在其中一些实施例中，步骤(I)所述hVEGF165特异引物为上游引物5，-GCGGATCCGCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3，；下游引物5’-GCTTAGTCTAGACGCCTCGGCTTGTCACATC-3’。在其中一些实施例中，步骤(3)所述的表达菌株为大肠杆菌BL21。在其中一些实施例中，步骤(5)所述的镍亲合层析方法中所用的洗脱液为含有200-300mM 咪唑的 pH 8. OTris-HCl 溶液。上述生产方法制得可溶性Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白。本发明所述的一种可溶性重组人血管内皮细胞生长因子-165蛋白及其生产方法具有以下优点 一是利用表达载体pET32和pET28，表达菌株BL21，经优化诱导表达条件，实现了Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白的大量可溶形式表达；二是利用本发明所述的表达系统，Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白能按适当的方式折叠，形成二聚体蛋白，并保持天然构象；三是摸索出一条有效的纯化活性Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白的方法;四是测定了大肠杆菌表达的Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白的生物活性，测定结果表明细胞增殖试验和信号通路激活实验都证明表达的Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白具有很好的生物活性，且在相同浓度下hVEGF165重组蛋白的活性较Trx-hVEGF165 强。
图1为hVEGF165基因PCR结果示意图；图2为原核表达载体pET32/hVEGF165构建示意图；图3A为不同浓度IPTG于37 V诱导8h，Trx_hVEGF165融合蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳分析图；图3B为不同浓度IPTG于25 °C诱导12h，Trx_hVEGF165融合蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳分析图；图3C为不同浓度IPTG于16_20°C诱导12h，Trx_hVEGF165融合蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳分析图；图4A为不同浓度咪唑洗脱镍亲和层析柱，得到的Trx-hVEGF165融合蛋白结果分析图；图4B经镍亲和层析所得Trx-hVEGF165融合蛋白的WB验证结果分析图；图4C加入DTT的Trx-hVEGF165融合蛋白SDS-PAGE电泳分析图；图4D不加DTT的Trx_hVEGF165融合蛋白SDS-PAGE电泳分析图；图5A为不同浓度IPTG于37°C诱导8h，hVEGF165重组蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳分析图5B为不同浓度IPTG于25°C诱导8h，hVEGF165重组蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳分析图5C为不同浓度IPTG于16-20°C诱导8h，hVEGF165重组蛋白表达产物的SDS-PAGE 电泳分析图6A为不同浓度咪唑洗脱镍亲和层析柱，得到的hVEGF165重组蛋白结果分析图6B经镍亲和层析所得hVEGF165重组蛋白的WB验证结果分析图6C加入DTT的hVEGF165重组蛋白SDS-PAGE电泳分析图6D不加DTT的hVEGF165重组蛋白SDS-PAGE电泳分析图7为Trx-hVEGF165融合蛋白及hVEGF165重组蛋白表达产物的活性测定结果；
图8为显微镜下观察到的Trx-hVEGF165融合蛋白及hVEGF165重组蛋白活性比较图。
具体实施方式
本发明选用大肠杆菌表达菌株BL21、载体扩增菌株T0P10和表达载体pET32及 pET28购自美国Invritrogen公司。
所用培养基配方如下
I)LB液体培养基NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；
2) LB/Amp平板=NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70°C以下,加入ImL浓度为100mg/ml的氨节青霉素(Ampicillin),充分混均后倒板，4°C避光保存；
3)LB/Amp培养基NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌后， 冷却至70°C以下,加入ImLAmpicillin (100mg/ml),充分混均,4°C保存；LB液体培养基 NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存。
4) LB/Kan平板NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70°C以下,加入ImL浓度为70mg/ml的卡那霉素(Kanamycin),充分混均后倒板，4°C避光保存；
5)LB/Kan培养基NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌后， 冷却至70°C以下,加入70mg/ml的卡那霉素(Kanamycin),充分混均,4°C保存；LB液体培养基NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存。
6) 50XTAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液Tris 碱 121g，冰乙酸 28. 6mL,0. 5mol/LEDTA (pH 8. 0)50mL,加蒸懼水定容至500mL,室温保存；
7 )50mg/mL氨节青霉素保存液氨节青霉素0. 5g,加蒸懼水溶解并定容至IOmL,分装后于-20°C保存；
8) 5X SDS-PAGE 上样`缓冲液1M Tris-HCl (pH 6. 8)1. 25mL, SDS 0. 5g, BPB25mg, 甘油2. 5mL，加去离子水溶解后定容至5mL，分装(约500 μ L每份)后于室温保存，使用每份加入25 μ L β -巯基乙醇混匀；
9) 5 X SDS-PAGE 电泳缓冲液=Tris 15. lg，甘氨酸 94g，SDS 5. 0g，加入约 800mL 去离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，室温保存；
10)考马斯亮蓝R-250染色液考马斯亮蓝R-2500. 25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；11)考马斯亮蓝脱色液冰乙酸50mL，甲醇150mL，去离子水300mL，充分混合后，室
温保存；实施例1本实施例所述的一种可溶性Trx-hVEGF165融合蛋白及其生产方法，主要包括以下步骤(I)克隆hVEGF165基因根据已经报道的hVEGF165基因，用hVEGF165特异引物从人血管内皮细胞的cDNA中扩增出完整人重组hVEGF165基因片段，所用hVEGF165特异引物中引ABamH I酶切位点和Hind III酶切位点，RT-PCR条件为95°C预变性，4min，一个热循环；94°C热变性30s，55°C褪火30s，72°C延伸45s，32个热循环；72°C复性lOmin。所获得的扩增片断连接到PMD20-T载体(购自于广州TAKARA公司)，得质粒hVEGF165/pMD20_T，用PCR、酶切和核酸测序鉴定，测定序列与人工合成的HVEGF165的DNA序列一致。PCR扩增引物为SEQ ID NO:1 上游引物5’ -GCGGATCCGCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3 ’(下划线代表HindIII位点)；SEQ ID NO:2 下游引物5’ - GCTTAGTCTAGACGCCTCGGCTTGTCACATC-3 ’(下划线代表BamHI位点)。PCR结果示意图如图1所示。(2)构建原核表达载体①用Hind III和BamH I双酶切重组质粒hVEGF165/pMD20_T，获得目的片断hVEGF165,反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)
质粒 hVEGF165/pMD20-T15 μ
IOxK缓冲液5 μ
Hind III5 U
BamH I5 U
无菌水至50 pL②用Hind III和BamH I分别双酶切pET32，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)质粒 pET3215 μ
IOxK缓冲液5μ
Hiiuiii!5 U
BamM I5 U
无菌水至50 μ ③由①及②步后所得目的片断和载体片断，DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行；原核表达载体pET32/hVEGF165构建示意图见图2所示。④回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接
反应，反应体系如下
质粒 pET32/pET28 片段I μ
圈的片段落3μ
IOx缓冲液I μ
Τ4 DNA 綠.0.5 pL
无菌水至IOjiL 得重组载体pET32/hVEGF165。(3)大肠杆菌表达菌株转化子的筛选①转化重组载体至大肠杆菌T0P10pET32/hVEGF165的连接产物转化到E. coli T0P10感受态细胞中，涂布LBAmp平板，37°C恒温培养箱中培养12小时；挑取培养板上长出的转化子，接入5mL Amp+/LB液体培养基中，37°C摇床培养过夜，提取重组质粒；对来自不同单克隆菌落的重组质粒进行酶切，15 μ L酶切体系
12 μ pET32/hVEGF165 重组质粒 1.5 μ , BufferK
0.75 μ , BamHI
0.75 μ HindIII酶切条件37°C水浴，3h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定克隆结果。②转化重组载体至大肠杆菌表达菌BL21
将阳性克隆的重组载体pET32/hVEGF165热激转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，涂板，37°C恒温培养箱中培养12小时，即LB Amp抗性平板筛选得到包含有重组载体pET32/ hVEGF165 的 BL21 转化子。
(4)Trx-hVEGF165融合蛋白的可溶性表达将得到的pET32/hVEGF165大肠杆菌BL21 转化子在37°C培养至OD6tltl为O. 4 — O. 8时加入浓度为O. 05mM-l. OmM的IPTG，16_20°C诱导8小时以上(根据成本，可为8-10小时)，诱导表达重组蛋白体。
可溶表达诱导条件的具体优化过程如下
得到的大肠杆菌BL21转化子在37°C培养至( 6(|(|为O. 5时，分别加入0mM、0. 05mM、 O. lmM、0. 2mM、0. 5mM和1. OmM的IPTG，16_37°C诱导8小时，超声破碎后，离心取上清液，加入SDS-PAGE样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析，结果见图3A-图3C，从该3个图中可知 温度在37°C (图3A)及25°C (图3B)，IPTG的浓度为O. 05mM-l. OmM时诱导表达时，几乎见不到可溶性的Trx-hVEGF165融合蛋白，即可得出温度在25°C及其以上进行诱导表达时，几乎见不到可溶性的Trx-hVEGF165 ;在较低温度条件下(16-20°C )，IPTG的浓度为O. 05mM_l. OmM 时(图3C所示，箭头代表可溶性目标蛋白)，可以得到可溶性Trx-hVEGF165融合蛋白的较高水平表达；为节约成本，缩短生产周期，我们采用低浓度的IPTG (O. 05mM)于20°C左右进行诱导表达，菌体最佳收获期为诱导8-12小时左右。
(5) Trx-hVEGF165融合蛋白的纯化
于LB/Amp培养基中经扩大培养和诱导表达(20°C，0. 05mM IPTG诱导8小时)，收集经IPTG诱导后的表达菌的菌体，将菌体重悬液于50ml缓冲液A (50mM Tris-HCl，300mM NaCl,30mM咪唑和ImM蛋白酶抑制剂PMSF，pH 8. O)用超声破碎仪进行破碎，功率300W，破碎5s，间隙9s，90次；破碎后的菌液进行离心，4°C，30000g，15min ;离心所得到的上清液加入到经缓冲液A预平衡的镍亲合层析柱中；经IOOml缓冲液B(50mM Tris-HCl, 300mMNaCl, 20-40mM咪唑和O. 5-1. 0%Triton X-114，pH 8. 0，先于冰浴上预冷至0-4°C)漂洗蛋白纯化柱子后(以上操作均在41的环境中开展)，加入不同浓度咪唑的(301111、601111、1001111、2001111 和300mM)缓冲液C (50mM Tris-HCl, 300mM NaCl，pH 8. 0)将蛋白洗脱下来，结果见图4A， 从图中可知利用200-300mM的咪唑可以得到纯度达95%的重组蛋白，融合蛋白的分子量约为35-40kDa ;所得蛋白经WB分析，WB结果表明，该蛋白是Trx_hVEGF165融合蛋白，融合蛋白的分子量约在35-40kDa之间(图4B所示)；在不加入DTT还原剂的情况下，从SDS-PAGE结果中可以看出，有部分Trx-hVEGF165以二聚体形式存在，其分子量是单体的2倍，分子量在 70kDa左右(图4C为加DTT的SDS-PAGE电泳分析图，图4D为不加DTT的SDS-PAGE电泳分析图)。以上蛋白经PBS透析后，超滤浓缩7-10倍，经上述纯化步骤，IL诱导表 达的菌液可纯化得到约8mg的重组蛋白，纯度超过95%。
实施例2
本实施例所述的一种可溶性hVEGF165重组蛋白及其生产方法，主要包括以下步骤
(I)克隆hVEGF165基因根据已经报道的人hVEGF165基因，用hVEGF165特异引物从人血管内皮细胞的cDNA中扩增出完整人重组hVEGF165基因片段，所用hVEGF165特异引物中引入BamH I酶切位点和Hind III酶切位点，RT-PCR条件为95°C预变性，4min，一个热循环；941热变性308，551褪火308，721延伸458，32个热循环；72°C复性IOmin0所获得的扩增片断连接到PMD20-T载体(购自于广州TAKARA公司)，得质粒hVEGF165/pMD20_T，用PCR、酶切和核酸测序鉴定，测定序列与人工合成的HVEGF165的DNA序列一致。PCR扩增引物为SEQ ID NO:1 上游引物5’ -GCGGATCCGCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3 ’(下划线代表HindIII位点)；SEQ ID NO:2 下游引物5，-GCTTAGTCTAGACGCCTCGGCTTGTCACATC-3’(下划线代表BamHI位点)。PCR结果示意图如图1所示。(2)构建原核表达载体①用Hind III和BamH I双酶切重组质粒hVEGF165/pMD20_T，获得目的片断hVEGF165,反应体系如下 (所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)
质粒 hVFGFwpMi)20-T15 pL
IOxK缓冲液5 μΕ Hind III5 U BamH I5 U
无菌水至50 ML②用Hind III和BamH I分别双酶切ρΕΤ28，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)
质粒 pET2S15 pL
IOxK缓冲液5pL
HindiiI5 U
BamH I5 U
无菌水―豪.... 50 μ ③由①及②步后所得目的片断和载体片断，DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行；构建示意图见图2所示。④回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接
反应，反应体系如下质粒pET28片段lpL
目的片段落3pL
1 Ox缓冲液！ pL
T4 DNA 连接酶0.5 jiL
无菌水至10 nL得重组载体pET32/hVEGF165。(3)大肠杆菌表达菌株转化子的筛选①转化重组载体至大肠杆菌T0P10pET28/hVEGF165的连接产物分别转化E. coli T0P10感受态细胞，涂布LBKan平板， 37°C恒温培养箱中培养12小时；挑取培养板上长出的转化子，5mLKam+/LB液体培养基中， 37°C摇床培养过夜，提取重组质粒；对来自不同单克隆菌落的重组质粒进行酶切，15 y L酶 切体系
12 pL pET28/hVEGF165 重组质粒 1.5 nh Burra. K 0.75 pL Bam I! !
0.75 jiL Hind III酶切条件37°C水浴，3h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定克隆结果。②转化重组载体至大肠杆菌表达菌BL21将阳性克隆的重组载体pET28/hVEGF165分别热激转化到大肠杆菌BL21感受态 细胞，涂板，37°C恒温培养箱中培养12小时，即LB Kam抗性平板筛选得到包含重要载体 pET28/hVEGF165 的 BL21 转化子。(4)hVEGF165重组蛋白的可溶性表达将得到的pET28/hVEGF165大肠杆菌BL21转 化子在37°C培养至0D_为0. 4 — 0. 8时加入浓度为0. 05mM-l. OmM的IPTG，16_20°C诱导8 小时以上(根据成本，可为8-10小时)，诱导表达重组蛋白体。可溶表达诱导条件的具体优化过程如下得到的大肠杆菌BL21转化子在37°C培养至0D600为0. 4-0. 8左右时，分别加入 0mM、0. 05mM、0. lmM、0. 2mM、0. 5mM 和 1. OmM 的 IPTG，于 16_37°C诱导 8 小时左右，超声破碎 后，离心取上清液，加入SDS-PAGE样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析，结果见图5A-图5C， 从该3个图中可知温度在37°C (图5A)及25°C (图5B)，IPTG的浓度为0. 05mM-l. OmM时诱 导表达时，无法从SDS-PAGE结果中看到可溶性的重组hVEGF165蛋白的表达，即可说明在较 高的诱导温度下，我们无法从SDS-PAGE结果中看到可溶性的重组hVEGF165蛋白的表达；而 在较低温度条件(16-20°C)下，IPTG的浓度为0. 05mM-l. OmM时，都可以得到可溶性hVEGF165融合蛋白的较高水平表达(图5C所示，箭头代表可溶性目标蛋白);为节约成本，缩短生产周期，我们采用低浓度的IPTG (O. 05mM)和较低的温度(20°C左右)进行诱导表达，菌体最佳收获期为诱导8-12小时左右。(5) hVEGF165重组蛋白的纯化于LB/Kan培养基中经扩大培养和诱导表达(20°C，0. 05mM IPTG诱导8小时)，收集经IPTG诱导后的表达菌的菌体，将菌体重悬液于50ml缓冲液A (50mM Tris-HCl，300mMNaCl,20mM咪唑和ImM蛋白酶抑制剂PMSF，pH 8. O)用超声破碎仪进行破碎，功率300W，破碎5s，间隙9s，90次；破碎后的菌液进行离心，4°C，30000g，15min ;离心所得到的上清液加入到经缓冲液A预平衡的镍亲合层析柱中；经IOOml缓冲液B(50mM Tris-HCl, 300mMNaCl,20-40mM咪唑和O. 5-1. 0%Triton X-114，pH 8. 0，先于冰浴上预冷至0-4°C)漂洗蛋白纯化柱子后(以上操作均在4 °C的环境中开展)，加入不同浓度咪唑的(20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、200mM 和 300mM)缓冲液 C (50mM Tris-HCl, 300mM NaCl，pH 8.0)将蛋白洗脱下来，利用200-300mM的咪唑可以得到纯度达95%的重组蛋白，融合蛋白的分子量约为35-40kDa，表达产物的纯化过程的优化如图6A所示；所得蛋白经WB分析，WB结果表明，该蛋白是hVEGF165重组蛋白，融合蛋白的分子量约在20kDa左右(图6B所示)；在不加入DTT还原剂的情况下，从SDS-PAGE结果中可以看出，有部分hVEGF165 (约1/3)以二聚体形式存在，其分子量是单体的2倍，分子量在40kDa左右(不加入DTT的hVEGF165重组蛋白SDS-PAGE电泳分析图，如图6C所示；加入DTT的hVEGF165重组蛋白SDS-PAGE电泳分析图，如图6D所示)。以上蛋白经PBS透析后，超滤浓缩7-10倍，经上述纯化步骤，IL诱导表达的菌液可纯化得到约12mg的重组蛋白，纯度超过95%。分析上述实施例1和实施例2所制得的Trx-hVEGF165融合蛋白与hVEGF165重组蛋白的生物学活性将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)于IOcm细胞培养板中，在含20%FBS的M199培养基中培养至细胞密度达90%以上(培养基中加入了 L-Glutamine 2mM, ECGS 100yg/ml，肝素40U/ml)。PBS洗涤细胞2次 后，加入胰酶消化I分钟，终止消化并加入含20%FBS的M199培养基，并将细胞制成细胞悬液；800rpm离心5min后收集细胞，向收集的细胞中加入含20%FBS(经CM阳离子柱处理过的)的M199培养基(L-Glutamine 2mM，肝素40U/ml)，调节细胞密度至l-2X105cell/ml。将上述细胞悬液加至96孔板中，每孔加100 μ 1，并向每孔中分别加入不同浓度的Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白。将细胞培养板于温箱中培养72h，向每个孔中加入10 μ I MTT,于温箱中培养4小时，吸去培养基，向每孔中加入100 μ I的DMS0，震荡10分钟后于570nm测定吸光值。细胞增殖实验表明(图7)，纯化得到的重组人Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白具有促进人脐静脉内皮细胞增殖的功能；表明该方法测得的重组人Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白具有生物活性。同时，在显微镜条件下观察细胞的生长情况，结果表明，相同蛋白浓度条件下hVEGF165重组蛋白的生物活性明显高于Trx-hVEGF165融合蛋白(10ng/ml pET32载体表达的Trx_hVEGF165的生物活性仅相当于2ng/ml的pET28载体表达的hVEGF165)(图7)。pET32载体表达的Trx_hVEGF165的生物活性明显低于PET28载体表达的hVEGF165的生物活性，这种活性差异在显微镜下观察下表现得更为明显利用2ng/ml的pET28载体表达的hVEGF165培养细胞的生长密度要明显高于以5ng/ml的pET32载体表达的Trx_hVEGF165培养细胞的生长密度(结果如图8所示)。生物活性的测定结果表明，利用PET32和PET28表达载体，其重组转化子在低温下诱导表达所产生的可溶性重组蛋白都具有生物活性，且PET28表达载体的表达产物较pET32 的表达产物具有更高的生物活性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出 的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表< 11ο> ψ W科学院广州'Ii物医药1U健康研究院<120> M组人Jiff I人J皮细IM 'I长因子-165蛋Cl及11； I ·:产方法<_> 2<170> PatenlIn vers ion 3, I<210> I <211> 30 <212> DKh <213>人1:序列 <柳> Igcggaiccgc iicccatggca gaaggaggag30<2!0> 2 <2!1> ； 1 <2i2> im<213>人1:印列 <彻)> 2gettagtcIn gacgcctcgg cltglc`acal C3权利要求
1.一种可溶性Trx-hVEGF165融合蛋白的生产方法，其特征在于，主要包括以下步骤 (1)克隆hVEGF165基因用hVEGF165特异引物扩增出完整的基因片段，所用hVEGF165特异引物中引入BamH I酶切位点和Hind III酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20_T载体，得质粒hVEGF165/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列； (2)构建原核表达载体将表达载体pET32和步骤(I)所得的质粒hVEGF165/pMD20-T经过Hind III及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32/hVEGF165 ； (3)大肠杆菌表达菌株转化子的筛选将步骤(2)所得的重组载体pET32/hVEGF165转化到大肠杆菌TOPlO菌株中，再从大肠杆菌T0P10菌株中提取重组载体pET32/hVEGF165 ;用热激法将重组载体pET32/hVEGF165转到大肠杆菌表达菌株BL21中，利用LB氨苄青霉素Amp抗性平板筛选得到包含有重组载体pET32/hVEGF165的大肠杆菌表达菌株转化子； (4)Trx-hVEGF165融合蛋白的表达将步骤(3)所得的pET32/hVEGF165大肠杆菌表达菌株转化子在35 °C _37°C培养至OD6tltl为O. 4-0. 8时，加入浓度为O. 05-1. OmM的IPTG，于16-20°C诱导8-12小时，超声破碎，离心取上清液，得到大量可溶性的重组融合蛋白Trx-hVEGF165 ； (5)Trx-hVEGF165融合蛋白的纯化利用镍亲合层析法对Trx_hVEGF165融合蛋白进行纯化，后再米用PBS透析和超滤浓缩。
2.一种可溶性hVEGF165重组蛋白的生产方法，其特征在于，主要包括以下步骤 (1)克隆hVEGF165基因用hVEGF165特异引物扩增出完整的基因片段，所用hVEGF165特异引物中引入BamH I酶切位点和Hind III酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20_T载体，得质粒hVEGF165/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列； (2)构建原核表达载体将表达载体pET28和步骤(I)所得的质粒hVEGF165/pMD20-T经过Hind III及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET28/hVEGF165 ； (3)大肠杆菌表达菌株转化子的筛选将步骤(2)所得的重组载体pET28/hVEGF165转化到大肠杆菌T0P10菌株中，再从大肠杆菌T0P10菌株中提取重组载体pET28/hVEGF165 ;用热激法将重组载体pET28/hVEGF165转入到大肠杆菌表达菌株BL21中，利用LB卡那霉素(Kan)抗性平板筛选得到包含有重组载体pET28/hVEGF165的大肠杆菌表达菌株转化子； (4)hVEGF165重组蛋白的表达将步骤(3)所述的pET28/hVEGF165大肠杆菌表达菌株转化子在350C _37°C培养至OD600为O. 4-0. 8时，加入浓度为O. 05-1. OmM的IPTG，于16-20°C诱导8-12小时，超声破碎，离心取上清液，得到大量可溶性的重组蛋白hVEGF165 ； (5)hVEGF165重组蛋白的纯化利用镍亲合层析法对hVEGF165重组蛋白进行纯化，后再米用PBS透析和超滤浓缩。
3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，步骤(I)所述hVEGF165特异引物为 上游引物5 ’ -GCGGATCCGCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3，； 下游引物5’ -GCTTAGTCTAGACGCCTCGGCTTGTCACATC-3’。
4.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，步骤(5)所述的镍亲合层析方法中所用的洗脱液为含有200-300mM咪唑的pH 8. OTris-HCl溶液。
5.根据权利要求1所述的生产方法制得的可溶性Trx-hVEGF165融合蛋白。
6.根据权利要求2所述的生产方法制得的可溶性hVEGF165重组蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种可溶性重组人血管内皮细胞生长因子-165蛋白及其生产方法，包括以下步骤克隆hVEGF165基因，得质粒hVEGF165/pMD20-T；构建表达载体pET32及pET28，得重组载体pET32/hVEGF165和pET28/hVEGF165；将重组载体转到宿主中，得转化子；转化子经IPTG诱导得Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白，再经镍亲和层析、PBS透析和超滤浓缩纯化；本发明以pET32、pET28为载体、优化诱导表达条件，最终高效表达Trx-hVEGF165融合蛋白和hVEGF165重组蛋白，既保证了两种蛋白的生物学活性，也高效地获得大量稳定蛋白。
文档编号C07K19/00GK103045633SQ20121053595
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月11日 优先权日2012年12月11日
发明者吴东海, 李洪波, 徐爱民, 金守光, 李娜, 李侍武 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院