专利名称：：大豆开花基因ft2a-1及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明涉及大豆开花基因ft2a-l及其编码蛋白。
背景技术：
：大豆为人类提供重要的植物蛋白质和油份。在世界范围内，北至高纬度的北欧瑞典和北美加拿大，南至巴西及阿根廷等广泛区域内均有大豆栽培，但单个品种或种质资源一般适宜种植的纬度跨度较小，这种区域适应性与大豆光周期和生育期基因或者数量性状位点(QuantitativeTraitLocus,QTL)密切相关。选育生态适应性广的优良大豆品种是实现高产、优质、高效大豆产业的根本途径。但常规育种在广适应品种选育中进展缓慢，利用分子育种手段有望定向调节大豆光周期和生育期，加快广适应品种的选育。模式植物拟南芥和水稻的研究结果表明，开花素(Fl0rigen，FT蛋白)从叶片转运到茎尖诱导花的形成(Corbesier等，2007;Tamaki等，2007)。我们从大豆中克隆了10个FT基因，这10个基因成对的复制在大豆连锁群上。基因表达分析的结果显示，在开花诱导条件即短日照条件下，有两个FT基因(GmFT2a和GmFT5a)在花芽形成期(2530天左右)，在三出复叶中大量表达，而其他基因表达量极低或者不表达。并且这两个基因呈现生物钟规律的基因表达类型，在光照开始4个小时表达强度最高之后逐渐减弱。在非诱导的长日照条件下，只有一个FT基因(GmFT5a)相对表达，从而导致了在此条件下大豆开花期较晚，生育期延长。利用大豆光敏色素A基因的双突变体(Harosoy_e3e4)研究则发现,在长日照条件下，Harosoy_e3e4的开花期与其野生型植株在短日照条件下的开花期一致。而且，在双突变体中，在花芽形成期，GmFT2a和GmFT5a的表达被大量诱导而且呈现与短日照完全相同的生物钟规律的基因表达。这些研究结果从分子水平上初步揭示了大豆开花期和生育期的分子机理，即(I)在诱导的短日照条件下，有两个FT基因参与表达导致花期很短，然而在非诱导的长日照条件下，只有一个FT基因参与表达从而导致开花期变长；(2)大豆经过自身进化使光敏色素A基因失活来适应在高纬度区域生存，而这一进化过程又是最终通过调控两个大豆中主要的FT基因表达来实现的；(3)在长日照条件下，长日照植物拟南芥的光敏色素A基因诱导FT基因的表达，而短日照植物大豆的光敏色素A基因却抑制FT基因的表达，说明短日照植物含有与长日照植物不同的光周期反应调控机制(Kong等2010)。此外，通过大豆遗传转化技术，研究者进一步验证了GmFT2a具有大豆开花促进功能(Sun等2011)。但是，GmFT2a基因的突变如何影响着大豆生育期(开花期及成熟期)是一个非常重要的科学问题，目前还没有在分子水平上的相关研究报道。
发明内容本发明的目的是提供大豆开花基因ft2a_l及其编码蛋白。本发明的大开花基因ft2a-l的基因序列如序列表SeqIDNoI所不。本发明的大豆开花基因ft2a_l的编码蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo2所示。本发明的有益效果本发明是在克隆出大豆开花基因GmFT2a(Kong等2010)的基础上，进一步对GmFT2a基因序列进行深入系统的研究。我们已证实GmFT2a基因具有促进大豆开花的功能。本发明对不同品种中GmFT2a基因序列进行了研究，并确定了ft2a-l基因，其对大豆生育期关系密切。ft2a-l基因与大豆开花基因GmFT2a(Kong等2010)相比，两者的序列在DNA水平的仅有一个核苷酸(506号)差异，但导致氨基酸序列169位从甘氨酸到天冬氨酸的错义突变，从而改变了原来GmFT2a基因的功能。拟南芥的遗传转化实验表明，本发明的ft2a_l基因与大豆开花基因GmFT2a相比，其促进开花的功能明显减弱。图1是pMDC100IG_ft2a_l质粒表达载体结构示意图；图2是转入ft2a_l基因和转入GmFT2a基因拟南芥以及野生型拟南芥的开花时间图；其中，Col-O为野生型拟南芥，GmFT2a-0X为转入GmFT2a基因后的拟南芥，ft2a_l_0X为转入ft2a-l基因后的拟南芥。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式的大豆开花基因ft2a_l的基因序列如序列表SeqIDNo1所示。本实施方式对不同品种中GmFT2a基因序列进行了研究，并确定了ft2a_l基因，其对大豆生育期关系密切。本实施方式通过拟南芥遗传转化手段，将GmFT2a基因和ft2a_l基因在拟南芥中表达，验证了本发明的ft2a-l基因与大豆开花基因GmFT2a相比，其促进开花的功能明显减弱。具体实施方式二本实施方式的大豆开花基因ft2a_l的编码蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo2所示。通过以下试验验证本发明的效果(I)基因ft2a_l序列的获得—、以大豆品种K3的叶片为材料,用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取叶片总RNA;二、采用DNaseI处理步骤一提取的总RNA;三、取Iμg步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成,cDNA的合成操作按照购买自BDBiosciencesClontech公司的BDSMARTTMRACEcDNAAmplificationKit试剂盒的使用手册进行，获得cDNA;四、以获得的cDNA为模板通过Fl与Rl引物扩增ft2a-l基因，PCR反应条件如下94°C预变性5min,94°C变性30s,56°C退火30s,72°C延伸lmin,共35循环，再72°C延伸IOmin,将PCR产物在ABI3130测序仪(ABI公司)上进行测序；其中，引物Fl的序列为5‘-ccatgcctagtggaagtagg;引物Rl的序列为gagtgtgggagattgccaat-3，。测序结果表明大豆开花基因ft2a_l具有序列表中SeqIDNo:1的核苷酸序列，序列表中的SeqIDNo1由622个核苷酸组成，并编码具有序列表中SeqIDNo2的氨基酸序列的蛋白质。(2)大豆开花基因ft2a_l的功能验证—、以大豆品种K3的叶片为材料,用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取叶片总RNA;二、采用DNaseI处理步骤一提取的总RNA;三、取Iμg步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成,cDNA的合成操作按照购买自BDBiosciencesClontech公司的BDSMARTTMRACEcDNAAmplificationKit试剂盒的使用手册进行，获得cDNA;四、分别以ft2a-l基因F2与R2为引物，对步骤三获得的cDNA通过PCR进行5’与3’扩增，PCR反应条件94°C预变性10min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸5min，共35循环，再72°C延伸lOmin，获得含有Xba1-SacI双酶酶切位点的大豆开花基因ft2a_l;五、将获得的含有酶切位点的大豆开花基因ft2a-l克隆到pMDClOOIG质粒中，获得pMDC100IG-ft2a-l质粒，以拟南芥(Col-O)为材料，利用农杆菌介导法进行遗传转化，获得转ft2a-l基因拟南芥，将转ft2a-l基因拟南芥、转GmFT2a基因拟南芥和野生型拟南芥(Col-O)在16小时光照和8小时黑暗条件下种植，观察它们的开花状态；其中，pMDClOOIG质粒和转GmFT2a基因拟南芥，我们在2010年《PlantPhysiology》中刊登的名称为"TwoCoordinatelyRegulatedHomologsofFLOWERINGLOCUSTAreInvolvedintheControlofPhotoperiodicFloweringinSoybean”的文章中公开；大豆品种K3属泰国的一个栽培品种，在2006年《KasetsartJ》“Molecularmarkeranalysisofdaystofloweringinvegetablesoybean(Glycmemax)”中刊登，由北海道大学Abe教授惠赠。其中，引物F2的序列为5‘-gctctagaccatgcctagtggaagtagg;引物R2的序列为gcgagctcgagtgtgggagattgccaat-3’。步骤五获得的pMDC100IG_ft2a_l质粒过表达载体结构示意图如图1所示；转入ft2a_l基因和转入GmFT2a基因以及野生型拟南芥的开花时间图如图2所示，其中，Col-O为野生型拟南芥，GmFT2a-0X为转入GmFT2a基因后的拟南芥，ft2a_l_0X为转入ft2a-l基因后的拟南芥。从图2可以看出，Col-O的开花时间为31天，GmFT2a_0X的开花时间为24.8天，表明转入GmFT2a基因后的拟南芥开花时间比野生型拟南芥的开花时间早于6天，从而说明GmFT2a基因具有促进开花的功能；而ft2a_l_0X的开花时间与野生型拟南芥的开花时间基本相同，从而说明本发明的ft2a-l基因与大豆开花基因GmFT2a相t匕，其促进开花的功能明显减弱或功能丧失。权利要求1.大豆开花基因ft2a-l，其特征在于大豆开花基因ft2a_l的基因序列如序列表SeqIDNo1所示。2.如权利要求1所述的大豆开花基因ft2a-l的编码蛋白，其特征在于大豆开花基因ft2a-l的编码蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo2所示。全文摘要大豆开花基因ft2a-1及其编码蛋白，本发明涉及大豆开花基因ft2a-1及其编码蛋白。本发明的目的是提供大豆开花基因ft2a-1及其编码蛋白。本发明大豆开花基因ft2a-1的基因序列如序列表SeqIDNo1所示。本发明大豆开花基因ft2a-1的编码蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo2所示。本发明通过拟南芥遗传转化验证，表明ft2a-1基因与FT2a基因相比，其促进开花的功能明显减弱。本发明应用于大豆基因工程领域。文档编号C07K14/415GK102994516SQ20121053497公开日2013年3月27日申请日期2012年12月12日优先权日2012年12月12日发明者孔凡江,刘宝辉申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所