专利名称：壬基酚人工抗原的制备方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，更具体涉及一种壬基酚人工抗原的合成方法，本发明利用琥珀酸酐法，将壬基酚上面的羟基进行衍生化，以引进能够与蛋白反应的功能团。利用改进的碳二亚胺法将衍生物NP-HS与蛋白载体反应，合成相应的人工抗原，为壬基酚抗体制备提供技术支持。
背景技术：
壬基酚(Nonylophenol，NP)，是一种重要的精细化工原料和中间体，主要用于生产表面活性剂、也用于抗氧化剂、纺织印染助剂、润滑油添加剂、农药乳化剂等领域，由于NP高度疏水性及化学性质稳定，因此容易在环境中富集而广泛分布，同时通过食物链对水生生物、动物及人类造成危害。有专家表明，NP具有雌激素效应，可导致动物生殖系统的损害，同时对雄性动物的生殖功能也有影响，并对其血清中睾丸酮水平和某些生化指标产生影响。为了确保人类安全与健康，建立快速、准确监测壬基酚等有害物质的残留是十分必要的。传统的残留分析方法包括气相色谱法、液相色谱法、质谱、薄层层析等，这些方法往往需要很复杂昂贵的仪器，而且需要经过繁琐的前处理，很难达到快速、简便的现场检测要求。而免疫检测分析方法由于具有特异性强、灵敏度高、简便、快速等优点，近年来备受人们的关注。因此，建立起NP的免疫快速检测方法，对于实践中批量化测定样品中NP残留意义重大。本试验制备成功的人工抗原以及由此制备的高效价抗体，可为建立快速检测NP残留的免疫试剂盒提供可靠保证。壬基酚是小分子化合物，本身不具备免疫原性，不能直接刺激机体产生抗体，必须与连接到大分子载体上以形成较为理想的免疫原。在本实验中，用改进的碳二亚胺法合成壬基酚人工抗原NP-BSA，并对其进行鉴定。然后以此人工抗原免疫balb/c小鼠，制备单克隆抗体，对NP的ELISA检测方法进行研究。为下一步研制壬基酚残留检测试剂盒建立很好的技术平台。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种壬基酚人工抗原的制备方法，该方法合成步骤简单易操作，副反应少，目标物纯度高。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施—种壬基酚人工抗原的制备方法，其步骤是(I)按摩尔比1:1. 3称取壬基酚和琥珀酸酐置于500ml反应瓶中，加入DMSO作为溶剂，90°C反应Ih后冷却至室温(20-25°C，以下相同)。将冷却的反应液缓慢的加入到超纯水中，边滴加边搅拌，溶液瞬间变成乳白色，上面浮着一层淡黄色的油状物，将上述物质进行抽滤沉淀，用冰超纯水洗涤后抽干，50°C烘干后重结晶3次，干燥得到的淡黄色油状物即为NP-HS。
(2)按摩尔比30 :30 :1称取N-羟基琥珀酰亚胺水溶性碳二亚胺牛血清白蛋白共溶于O. Olmol/IPBS中，4°C下搅拌反应过夜。将上述溶液离心(5000r/min, IOmin),所得上清液为A液；按摩尔比30:6. 5的比例称取NP-HS溶解于N，N- 二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，用移液枪取1/2体积的上清液A，以边滴加边搅拌的方式加入到NP-HS溶液中，避光反应3-5h。将反应后的溶液离心(5000r/min，IOmin),上清液为B，取上清液B，以PBS(pH=7. 4)溶液做透析液，置4°C透析3天，每7-9h换一次透析液，除去未反应的DMF、⑶C、NHS、NP等小分子物质。将透析好的反应液用棕色玻璃小瓶分装后置于_40°C冰箱中冷冻过夜，然后转移到冷冻干燥机中进行干燥，获得一种壬基酚人工抗原，于_20°C冰箱保存。人工抗原的鉴定先根据SDS-PAGE结果测定BSA及NP-BSA的分子量，再采用紫外扫描仪测定得到的壬基酚一牛血清白蛋白的偶联比，分别在279 nm、278 n m波长处测定吸光度值，并计算偶联比。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果壬基酚的物理化学性质决定了在人工抗原的合成过程中可利用的活性基团仅有羟基，对此我们设计了对-氨基苯甲酸法、混合酸酐法、碳二亚胺法、活泼酯法、琥珀酸酐法五种不同的人工抗原合成方法和技术方案，经紫外扫描图分析对-氨基苯甲酸法、混合酸酐法、活泼酯法都没有合成目标物，仅碳二亚胺法和琥珀酸酐法合成了目标物，但是碳二亚胺法合成的目标物太少、得率较低。最后经比较分析后确定琥珀酸酐法最优，该方法合成步骤简单易操作，副反应少，目标物得率高、纯度高，所获得的抗血清效价高。
图1为一种SDS-PAGE实验结果示意图。电泳结果显示新合成的NP-BSA与BSA相比其相对迁移率发生了改变。图2为一种BSA(lg/L)紫外扫描示意图。BSA紫外扫描图显示BSA最大特征吸收波长为279nm。图3为一种NP-BSA (2g/L)紫外扫描示意图。NP-BSA紫外扫描图证实NP-BSA较之BSA其最大吸收波长发生了改变，由279变278，这是与NP-BSA物理化学性质较之BSA发生了改变相适应的。图4为一种NP-BSA透析液紫外扫描示意图。NP-BSA透析液紫外扫描图证实新合成的人工抗原已透析干净。图5为一种NP抗血清效价示意图。从图5可看出NP抗血清的效价较高，为1. 024X 106。
具体实施例方式一种壬基酚人工抗原的制备方法，其步骤是(I)按摩尔比1:1. 3称取壬基酚和琥珀酸酐置于500ml反应瓶中，加入DMSO作为溶剂，90°C反应Ih后冷却至室温(20-25°C，以下相同)。将冷却的反应液缓慢的加入到超纯水中，边滴加边搅拌，溶液瞬间变成乳白色，上面浮着一层淡黄色的油状物，将上述物质进行抽滤沉淀，用冰超纯水洗涤后抽干，50°C烘干后重结晶3次，干燥得到的淡黄色油状物即为壬基酚-琥珀酸半酯(NP-HS)。
(2)按摩尔比30 :30 :1称取N-羟基琥珀酰亚胺水溶性碳二亚胺牛血清白蛋白共溶于O. Olmol/IPBS中，4°C下搅拌反应过夜。将上述溶液离心(5000r/min, IOmin)上清液为A ;按摩尔比30:6. 5的比例称取NP-HS溶解于N，N- 二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，用移液枪取适量上清液A，以边滴加边搅拌的方式加入到NP-HS溶液中，避光反应4h。将反应后的溶液离心(5000r/min，lOmin)，上清液为B，取上清液B，以PBS (pH=7. 4)溶液做透析液，置4°C透析3天，每8h换一次透析液，除去未反应的DMF、⑶C、NHS、NP等小分子物质。将透析好的反应液用棕色玻璃小瓶分装后置于-400C冰箱中冷冻过夜,然后转移到冷冻干燥机中进行干燥，于_20°C冰箱保存。2、人工抗原的鉴定 (I)SDS-PAGE 实验分离胶12%(W/V)聚丙烯酰胺浓缩胶5%(W/V)丙烯酰胺a) 30%(ff/V)丙烯酰胺配方丙烯酰胺29gN-N’ -亚甲叉双丙烯酰胺Ig加水至100ml，密封保存，不宜过久，pH>7. O时不可用。b ) 10% (ff/V) SDS 溶液SDS IOg蒸懼水溶解后,定容至100mL。c)1. 5mol/L 分离胶 buffer (ρΗ8· 8):Tris 碱18. 17g溶于80ml蒸馏水中用10mol/LHCl 调 pH 至 8. 8，定容至 100ml。d)1. 0mol/L 浓缩胶 buffer (ρΗ6· 8):Tris 碱 12.1lg溶于80ml蒸馏水中用10mol/LHCl 调 pH 至 6. 8,定容至 100ml。e)电极 buffer I&存液(5X , pH8. 3)Tris 喊 15.1g甘氨酸 94g10%SDS 50ml溶于900ml蒸馏水中，调pH至8· 3，定容至1000ml。f) 10% (ff/V)过硫酸铵(AP,临用前配制)称取AP Ig,蒸懼水溶解后定容至IOml。g) 1%(W/V) TEMED :取 TEMED0. 1ml，加蒸馏水定容至 10ml。h) 2 X SDS 凝胶上样 buffer lOOmmol/L TrisHCI(pH6.H)
200mmol/L :::硫苏糖醇(DTT)
4%(W/V)SDS (电泳级)
0.2%(W/V)溴酚蓝
20%(W/V)甘油i)脱色液取甲醇400ml,蒸懼水500ml,冰醋酸100ml。j)染色液称取考马斯亮蓝R-250 O. 25g，用脱色液溶解后定容至100ml。k)标准蛋白质。
I) 12%(ff/V)分离胶配制(15ml)
蒸馏水4 3 ml
30%(W/V)丙烯酰胺溶液6.0 ml
1.5M Tris (pH8.8)3.8 ml
10%(W/V) SDS150 μ
10%(W/V)过硫酸铵150 μ
l%(W/V)TEMED600 μ 室温混匀后，倒入垂直玻板之间，之后缓慢加入蒸馏水约Icm高即封闭，待凝。5%(ff/V)浓缩胶(成层胶)配方(5ml)待分离胶凝固后，将蒸馏水倒出，并用滤纸将余下的蒸馏水吸干净，然后按一下操作配制浓缩胶
蒸馏水2.94 ml
30%(W/V)W烯酰胺溶液0.83 ml1.OM Tris (pH6.8)UCH ml
10% (WZV)SOS50 μ!
10%(W/V) AP50 μ
1%(W/V)TEMED500 μ 室温混匀后，倒于分离胶之上，迅速插入点样梳，待凝。操作步骤I)槽的准备使用前装好垂直板型电泳槽。2 )封胶用O. 8% w 1. 0% (W/V)琼脂糖凝胶将玻片与橡胶、橡胶与电泳槽的接缝封好，以防聚丙烯酰胺凝胶及缓冲液的渗漏。3)灌胶灌得不宜过快，以免产生气泡影响聚合，室温放置干燥。4)预电泳凝胶完全凝固后，小心取出点样梳，加入电极缓冲液，然后接通电源，上槽负极，下槽正极，80ν预电泳3 w 5min。5)上样蛋白样品1(^1^加上样131^€61'1(^1^后沸水(100°0煮3^51^11。在低电压下，用微量上样器上样，上样量为2 μ g。(凝胶从左至右依次为Marker、BSA、BSA-NP)6)电泳样品在浓缩胶中电泳约lh，待样品进入分离胶后，160v电泳4h左右。
附各泳道依次加入=Marker(分子量依次为 97. 4KD、66. 2KD、43. 0KD、31. OKD、20. 1KD)、BSA、BSA-BSA。7)染色、脱色电泳结束后，小心剥出凝胶，置染色缸中，用染色液浸泡过夜；次日将凝胶置于脱色液中，每隔2h换一次脱色液，直到背景清晰为止。8)分子量的测定a)标准曲线的绘制以凝胶的前沿或迁移距离最大的标准蛋白质为参考点，计算每种标准蛋白质的相对迁移率(Mr)Me=蛋白质从原点迁移的距离/从原点到参考点的距离
以Mr值为横坐标、标准蛋白质分子量为纵坐标做标准曲线图。b)待测样品分子量的测定计算出待测蛋白质的相对迁移率，查标准曲便可知其分子量。(2)紫外扫描图谱分析采用紫外扫描仪测定得到的壬基酚-牛血清白蛋白的偶联比，分别在279 nm、278 n m波长处测定吸光度值，并然后按照式(1广(3)计算出NP-BSA的结合比。
V一式中，ε偶联物、ε载体蛋白、ε半抗原分别为偶联物、载体蛋白、半抗原在某一波长下的摩尔吸光系数，N为每摩尔载体蛋白上所偶联的半抗原的摩尔数。蛋白质质量浓度(mg/mL)=l.45Α280-0· 74A260 ( 2)式中，A28tl、A26tl分别为该蛋白质溶液在280、260nm下的吸光度值。A= ε克分子消光系数Cl(3)式中，A是该物质在最大波长处的吸光度值，c是该物质的浓度(mol/L)，I是比色杯的直径(cm)，ε克分子消光系数是该物质的克分子消光系数[I/(mol/cm)]。3、结果分析3.1SDS-PAGE 实验结果(见图1):从SDS-PAGE实验结果同样可以看出NP-BSA较之原来的BSA其分子量大小都发生了变化，NP和BSA发生化学反应生成了新的物质NP-BSA。计算得到NP-BSA的偶联比为5:1。3. 2紫外扫描图谱分析从以上紫外扫描图可以看出NP-BSA合成成功，且最大吸收峰为278nm，这与BSA的最大吸收峰279nm不同,而且较之BSA的溶解度(本试验中BSA已经达到了其最大溶解度lg/L)偶联的NP-BSA的溶解度有了较大的变化，在本实验中可以达到2g/L以上。而且较之原来的BSA新合成的人工抗原其最大紫外吸收峰都发生了变化，且紫外峰形也发生了明显的改变。3. 3小鼠阳性血清抗体效价测定评判标准为P/N 彡 2. 1，Ρ/Ν>0. 2。结果效价测定结果显示效价为1. 024X 106。
权利要求
1.一种壬基酚人工抗原的制备方法，其步骤是(I)按摩尔比1:1. 3称取壬基酚和琥珀酸酐置于500ml反应瓶中，加入DMSO作为溶剂，90°C反应Ih后冷却至室温，将冷却的反应液加入到超纯水中，边滴加边搅拌，溶液变成乳白色，上面浮着一层淡黄色的油状物，将上述物质进行抽滤沉淀，用冰超纯水洗涤后抽干，50°C烘干后重结晶3次，干燥得到的淡黄色油状物为NP-HS;(2)按摩尔比30 30 1称取N-羟基琥珀酰亚胺水溶性碳二亚胺牛血清白蛋白共溶于O. Olmol/IPBS中，4°C下搅拌反应过夜,将上述溶液离心5000r/min, IOmin,所得上清液为A液；按摩尔比30:6. 5的比例称取NP-HS溶解于N，N- 二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，用移液枪取1/2体积的上清液A，以边滴加边搅拌的方式加入到NP-HS溶液中，避光反应3-5h，将反应后的溶液离心5000r/min，IOmin,上清液为B，取上清液B，以PBS溶液做透析液，置4°C透析3天，每7-9h换一次透析液，除去未反应的DMF、CDC、NHS、NP小分子物质，将透析的反应液用棕色玻璃小瓶分装后置于_40°C冰箱中冷冻过夜，然后转移到冷冻干燥机中进行干燥，获得一种壬基酚人工抗原，于_20°C冰箱保存。
全文摘要
本发明公开了一种壬基酚人工抗原的制备方法，其步骤(1)按摩尔比称取壬基酚和琥珀酸酐置于反应瓶中，加入DMSO作为溶剂，反应后冷却至室温，将冷却的反应液加入到超纯水中，边滴加边搅拌，溶液变成乳白色，将物质进行抽滤沉淀，用冰超纯水洗涤后抽干，烘干后重结晶，干燥得到的淡黄色油状物;(2)按摩尔比称取N-羟基琥珀酰亚胺水溶性碳二亚胺牛血清白蛋白共溶于lPBS中，反应过夜，离心；按摩尔比比例称取NP-HS溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，溶解后，取上清液，边滴加边搅拌的方式加入到NP-HS溶液中，将反应后的溶液离心，取上清液，将透析的反应液置于冰箱中冷冻过夜，干燥，得壬基酚人工抗原。该方法合成步骤简单易操作，副反应少，目标物纯度高。
文档编号C07K14/765GK103012582SQ201210533788
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者甘金华 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所