专利名称：一种生物活性多肽qepv及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种生物活性多肽QEPV及其制备和应用。
背景技术：
在牛乳经乳酸菌发酵的过程中，牛乳中的一部分蛋白质被乳酸菌代谢利用，并发生了一系列生理生化反应，使蛋白质变为多肽或者游离的氨基酸，被人体消化吸收或通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入人体的血液循环。在这些多肽中，有一部分具有特殊的生理功能，被称为“生物活性肽”。 免疫活性肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性肽。1981年，Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-1le-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨曬细胞对绵羊血红细胞的吞曬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗。李素萍等人用合成的乳源免疫调节肽(PGPIPN)饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的免疫调节功能有显著的增强。研究表明，免疫活性肽不仅能够增强机体免疫力，刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨噬细胞的吞噬功能，促进细胞因子的释放、提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应。免疫活性肽无论是作为功能食品还是药品，其最终都要摄入人体内被人体吸收，只有到达相应的靶器官才能发挥其生理功能。在人体胃肠道复杂的环境下，肽极容易受到胃蛋白酶、胰蛋白酶等一系列酶的影响而发生降解，从而在体内失去生理活性，无法达到预期目的。因此，研究免疫调节肽的抗胃肠道酶降解的能力对于其今后的应用具有重要意义。其次，有些生物活性多肽是在动物的胃肠道里经过各种生物酶降解后生成的新片段，被动物吸收后发挥其生活活性作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物活性多肽，其氨基酸序列为Gln-Glu-PiO-Val(QEPV) (SEQ ID NO :1)。较优的，所述生物活性多肽的来源为乳源性。本发明的生物活性多肽QEPV为乳源性，具体来源于酪蛋白，并且为酪蛋白(SEQ IDN0:3)第209 212位的氨基酸残基。较优的，所述生物活性多肽具有体外抗氧化活性和增强机体免疫力的功能。本发明的生物活性多肽可以通过基因工程的方法和化学方法人工合成，也可以从乳制品中通过分离纯化、酶降解的方法获得。本发明还公开了编码前述生物活性多肽的核苷酸片段。β -酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列为既有技术，编码β -酪蛋白第201Γ212位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性多肽QEPV。进一步的，编码前述生物活性多肽的核苷酸片段，其序列为5， -caggagcctgta-3， (SEQ IDNO:2)。本发明第二方面公开了前述生物活性多肽的制备方法，步骤如下I)发酵将瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)添加到脱脂乳中进行厌氧发酵，获得瑞士乳杆菌发酵乳；2)多肽的粗提对步骤I)的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离，取上清液；
3)多肽的纯化a.对步骤2)的上清液进行超滤处理，收集滤液；b.收集的滤液采用反向层析柱SOURSE 5 RPC ST (4. 6X 150mm)进行反相高效液相色谱分离，收集生物活性多肽QEPVL ；4)多肽的消化采用两步酶解法酶解步骤3)的生物活性多肽QEPVL，获得生物活性多肽QEPV ;第一步酶解所采用的酶为胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶为胰酶。本发明所述脱脂乳为经过脱脂处理的牛乳，通常脱脂乳中脂肪含量小于O. 1%。较优的，所述厌氧发酵的条件为发酵温度36 38°C，发酵培养15 20h ;优选发酵培养19h。较优的，步骤2)所述低温离心的条件为4°C,8000 IOOOOrpm,离心15 30min。较优的，步骤3) a所述超滤法所采用的滤膜的截留分子量分别为IOkDa和3kDa。本发明采用截留分子量分别为10kDa、3kDa的滤膜，使样品依次通过两张滤膜进行超滤。更优的，步骤3) a所述超滤过程中，压力范围为O. Γθ. 3MPa，滤液流速为O. 8 1.2mL/min。较优的，步骤3 ) b反相高效液相色谱分离法中，流动相A为含有2%乙腈和O. 05%TFA的ddH20 ;流动相B为100%乙腈。较优的，步骤3) b反相高效液相色谱分离法中，收集分子量为585. 32Da的多肽的洗脱峰，即为生物活性多肽QEPVL。在本发明反相高效液相色谱法分离过程中，已知QEPVL的分子量，收集分子大小为585.32Da的洗脱峰，即为本发明的生物活性多肽QEPVL。具体的，本发明分子大小为585. 32Da的洗脱峰其保留时间为33min。较优的，步骤4)所述两步酶解法具体步骤为将QEPVL溶于灭菌去离子水中，并加入胃蛋白酶，获得反应液，调节反应液PH值为2. 0±0. 1，在37±0.5°C的恒温水浴中保温反应60 120min，获得第一步酶解液；将第一步酶解液的pH值调整为7. 5±0. 1，并加入胰酶，于37±0. 5°C的恒温水浴中保温反应120 180°C，获得第二步酶解液；将第二步酶解液采用沸水浴法使酶失活，获得酶解产物；酶解产物冷冻干燥获得产品。较优的，步骤4)所述胃蛋白酶的添加量为胃蛋白酶10 30mg/g底物；所述胰酶的添加量为胰酶30 50mg/g底物。更优的，步骤4)所述胃蛋白酶的添加量为胃蛋白酶20mg/g底物；所述胰酶的添加量为胰酶40mg/g底物。较优的，步骤4)中将QEPVL配置成450 550 μ g/mL的多肽QEPVL溶液。更优的，配置成500 μ g/mL QEPVL溶液。
本发明第三方面公开了前述生物活性多肽在制备抗氧化和/或增强机体免疫力的食品、保健品及药物中的应用。本发明的生物活性多肽QEPV可以用于酸奶等乳制品、减少自由基对皮肤伤害的化妆品；并且由于本发明的生物活性多肽QEPV能够通过胃肠道直接吸收不被降解，因此可以用于制备提高免疫力的保健品，或者用于制备具有抗氧化和/或增强机体免疫力的药物。本发明第四方面公开了一种抗氧化药物，包含前述生物活性多肽QEPV或前述生物活性多肽QEPV的衍生物。本发明第五方面公开了一种增强机体免疫力药 物，包含前述生物活性多肽QEPV或前述生物活性多肽QEPV的衍生物。所述多肽的衍生物，是指在多肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。本发明生物活性多肽QEPV的有益效果为本发明的乳源性生物活性多肽QEPV具有较好的抗氧化活性和促进机体免疫力活性；一方面能够清除机体内的自由基，减少自由基对人体的伤害；另一方面，本发明的生物活性多肽QEPV还能够增强机体免疫力，增强淋巴细胞、巨噬细胞的增殖能力，使巨噬细胞一氧化氮诱生量增加，并促巨噬细胞分泌细胞因子，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且不会引起机体的免疫排斥反应，对开发具有抗氧化功能及增强免疫功能的乳制品、和保健品和药品具有十分重要的意义。
图1 :瑞士乳杆菌发酵乳与未经发酵处理的脱脂乳超滤后粗提物的质谱对比图(A 3000Da未经发酵的脱脂乳粗提物质谱图，B 3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物质谱图)图2 :3000Da未经发酵脱脂乳粗提物与3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳粗提物分子
量差异及丰度比较图3 :反相高效液相色谱分离对照发酵乳和瑞士乳杆菌发酵乳中生物活性多肽比较图(a曲线对照发酵乳反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱；b曲线瑞士乳杆菌发酵乳3000Da上清液反相高效液相色谱215nm的洗脱图谱)图4 :质量色谱提取图(m/z=585. 32)图5 :质荷比为585. 32的片段的一级质谱6 :质荷比为585. 32的片段的二级质谱7 :生物活性多肽QEPVL经过消化酶处理前后的总离子流8 :生物活性多肽QEPVL经消化酶处理前后b2峰的质谱分析9 :生物活性多肽QEPVL经消化酶处理前后bl峰的质谱分析10 :生物活性多肽QEPVL经消化酶处理后b3峰的质谱分析11 :生物活性多肽QEPVL经消化酶处理后b4峰的质谱分析12 : [DPPH ·]甲醇标准曲线图13 :FeS04标准曲线图14 :生物活性多肽QEPV的体外巨噬细胞增殖能力实验结果
图15 :不同浓度QEPVL和QEPV对一氧化氮诱生量的比较(正常组)图16 :不同浓度QEPVL和QEPV对一氧化氮诱生量的比较(炎症组)图17 =TNF-Y标准曲线图18 :添加生物活性多肽QEPV的淋巴细胞培养时间与IFN- Y分泌量的关系图19 :不同浓度的生物活性多肽QEPV在有分裂原(ConA)存在和没有分裂原存情况下在对细胞因子IFN-Y分泌的促进作用
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式
之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。实施例1活性肽QEPVL的制备一、发酵乳的制备I)瑞士乳杆菌发酵乳采用脱脂奶粉(新西兰NZMP牌脱脂奶粉)与水配置12wt%的脱脂乳(12wt%的脱脂乳的制备为将12g脱脂奶粉加入到88g水中，下同)。在无菌条件下，挑取瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus,CICC6024)菌落三环，将其加入已灭菌的12wt%的脱脂乳中，搅拌均匀。接种完成后，用铝箔封口，以防止污染。置于培养箱中37°C培养19小时。培养结束后，在无菌条件下将凝乳搅拌均匀，即完成瑞士乳杆菌的活化，制得用于制备瑞士乳杆菌发酵乳的发酵剂。取IOmL已制备的瑞士乳杆菌发酵剂接种到500mL已灭菌的12wt%脱脂乳中(接种率为2v/v%)，37°C发酵19小时后，在无菌条件下搅开凝乳，在4°C条件下保存，得到瑞士乳杆菌发酵乳。2)对照发酵乳采用同样方法，使用保加利亚乳杆菌(Lactobacillus Bulgaricus,LB340)和嗜热链球茵(Streptococcus Thermophilus, TA40)作为发酵菌种制作对照发酵乳。具体方法为在无菌条件下，分别挑取保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵菌落三环，将其分别加入已灭菌的12wt%的脱脂乳中，在无菌条件下搅拌均匀。接种完成后，用铝箔封口，以防止污染。置于培养箱中37°C培养19h。培养结束后，在无菌条件下将凝乳搅拌均匀，即完成保加利亚乳杆菌与嗜热链球茵的活化，制得用于制备对照发酵乳的两种发酵剂。取5mL已制备的保加利亚乳杆菌发酵剂和5mL嗜热链球菌发酵剂，共同接种到500mL已灭菌的12被％脱脂乳中(接种率为2v/v%)，37°C发酵19h后，在无菌条件下搅开凝乳，在4°C条件下保存，得到对照发酵乳。二、生物活性多肽的确认1.实验方法I)样品处理分别将前一步骤制备的瑞士乳杆菌发酵乳和对照发酵乳，以及12wt%的脱脂乳装入离心管中进行低温离心，离心条件为9000rpm/min，4°C，20min。离心后弃沉淀，取上清液。将上清液分别倒入超滤杯中，为了防止生物活性多肽被氧化，打开氮气罐压力阀充氮，同时打开磁力搅拌装置，以防止溶液出现浓差极化现象。使样品分别通过截留分子量为10kDa、3kDa的滤膜，待有滤液流出时进行收集。超滤过程中，应保持流速稳定，滤液清澈。流速控制在lmL/min左右，压力为O. Γ0. 3MPa，分别收集瑞士乳杆菌发酵乳、对照发酵乳，以及未发酵的12wt%脱脂乳的滤液作为实验样、对照样以及空白对照，于-4V冷冻保存。2)质谱分析将前一步骤收集的瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的滤液(实验样)和脱脂乳超滤后的滤液(空白对照)进行质谱分析，质谱条件如下离子方式ES+ 质量范围(m/z):100-1500毛细管电压(Capillary)(kV) 3. O采样锥(V):35· O离子源温度(°C)) :100去溶剂温度(°C ):350去溶剂气流(L/hr)600. O碰撞能量(eV):6. O扫描时间(sec):0. 3内扫描时间(sec):0. 022.实验结果瑞士乳杆菌发酵乳超滤后的滤液(实验样)和脱脂乳超滤后的滤液(空白对照)的质谱对比结果见图1 2。图1中的A曲线为3000Da未经发酵的脱脂乳(空白对照)粗提物样品，图1中的B曲线为3000Da瑞士乳杆菌发酵乳粗提物样品(实验样)。经过比较可以看出，经过瑞士乳杆菌发酵后，3000Da未经发酵乳粗提物和3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳粗提物的组分上发生很大变化，且这些组分由于疏水性不同保留时间亦有所差异。此质谱质量范围为100Da-1500Da，因此可知脱脂乳在1500Da以下、210nm处有吸收的小分子物质相对较少；而经过瑞士乳杆菌发酵后，在这一分子量范围内的物质明显增多，说明了这些多肽并不存在于未经发酵处理的脱脂乳中，而是经瑞士乳杆菌发酵后才产生的。而且我们发现随着发酵时间的延长，多肽的丰度明显增多，进一步证实了通过瑞士乳杆菌的发酵，脱脂乳中原有的大分子蛋白被分解，从单一的大分子蛋白变为量多且复杂的小分子多肽。图2是3000Da未经发酵脱脂乳(空白对照)粗提物与3000Da瑞士乳杆菌发酵脱脂乳(实验样)粗提物不同分子量物质丰度差异的比较结果。纵向轴表明在脱脂乳粗提物中所含物质对应的分子量，横向轴表明发酵乳粗提物中所含物质对应的分子量。通过比较，可以得到瑞士乳杆菌发酵乳和未经发酵脱脂乳中，因为发酵所带来的差异较大的物质的分子量，从而选择这些质荷比的母离子通过二级质谱进行进一步的分析。如图1所示，分子量397. 07Da，保留时间6. 72分钟的物质在脱脂乳粗提物中含量较高(图1-A图谱中的峰)，而对照发酵乳中几乎没有。而分子量为232. lOTa，保留时间为
3.61min的物质在发酵乳和脱脂乳中的含量均比较高。因此，我们选择了在发酵乳中含量较高而在未经发酵的脱脂乳中含量较低的组分进行了差异比较，比较结果见表I。根据MarkerLynx软件分析，得到具有显著性差异的(p>0. 05)分子量片段如表I所示，根据丰度和质荷比情况，选择585. 3251Da，保留时间为16. 20min的多肽进行二级质谱的测序分析。表1:3000Da发酵乳粗提物与3000Da脱脂乳粗提物差异比较
权利要求
1.一种生物活性多肽，其氨基酸序列为Gln-Glu-PiO-Val。
2.编码权利要求1所述生物活性多肽的核苷酸片段。
3.权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述核苷酸片段的序列如SEQID NO2所示。
4.权利要求1所述生物活性多肽的制备方法，步骤如下O发酵将瑞士乳杆菌添加到脱脂乳中进行厌氧发酵，获得瑞士乳杆菌发酵乳；2)多肽的粗提对步骤I)的瑞士乳杆菌发酵乳进行低温离心分离，取上清液；3)多肽的纯化a.对步骤2)的上清液进行超滤处理，收集滤液；b.收集的滤液采用反向层析柱SOURSE5RPC ST进行反相高效液相色谱分离，收集生物活性多肽QEPVL ；4)多肽的消化采用两步酶解法酶解步骤3)的生物活性多肽QEPVL，获得生物活性多肽QEPV ;第一步酶解所采用的酶为胃蛋白酶,第二步酶解所采用的酶为胰酶。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤I)所述厌氧发酵的条件为发酵温度36 38°C，发酵时间15 20h。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)a所述超滤法所采用的滤膜的截留分子量分别为IOkDa和3kDa ;所述超滤过程中，压力范围为O.1 O. 3MPa，滤液流速为O.8 L 2mL/min。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述两步酶解法为将生物活性多肽QEPVL溶于灭菌去离子水中，并加入胃蛋白酶，获得反应液，调节反应液pH值为2.0±0. 1，在37±0. 5°C的恒温水浴中保温反应60 120min，获得第一步酶解液；将第一步酶解液的PH值调整为7. 5±0. 1，并加入胰酶，于37±0. 5°C的恒温水浴中保温反应120 180°C，获得第二步酶解液；将第二步酶解液采用沸水浴法使酶失活，获得酶解产物；酶解产物冷冻干燥获得产品。
8.权利要求1所述生物活性多肽在制备抗氧化和/或增强机体免疫力的食品、保健品及药物中的应用。
9.一种抗氧化药物，包含前述生物活性多肽QEPV或前述生物活性多肽QEPV的衍生物。
10.一种增强机体免疫力药物，包含前述生物活性多肽QEPV或前述生物活性多肽QEPV的衍生物。
全文摘要
本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种具有体外抗氧化活性和增强机体免疫力的乳源性生物活性多肽，其氨基酸序列为Gln-Glu-Pro-Val。经过体外抗氧化实验、体外免疫功能促进实验，验证了多肽QEPV具有较好的抗氧化生物学活性和促进细胞免疫的活性，一方面能够清除机体内的自由基，减少自由基对人体的伤害；另一方面，本发明的生物活性多肽QEPV还能够增强机体免疫力，增强淋巴细胞、巨噬细胞的增殖能力，使巨噬细胞一氧化氮诱生量增加，并促巨噬细胞分泌细胞因子，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，对开发具有抗氧化功能及增强免疫功能的乳制品、保健品和药品具有十分重要的意义。
文档编号C07K5/103GK103012552SQ201210536588
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者张少辉, 卢姗姗, 马鎏镠, 孙冠华, 崔磊, 金赢凯, 徐海红 申请人:上海交通大学