专利名称：一种小分子亲和肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及一种小分子肽及其应用。
背景技术：
免疫球蛋白IgG，即抗体是一种特殊的蛋白质分子，被作为体外诊断的试剂、治疗疾病的药物、免疫亲和层析的配基等，在生命科学研究、生物技术及医学领域中有着广泛的应用。目前，IgG的分离纯化多采用抗体的天然亲和配体ProteinA/G,由于ProteinA/G存在与抗体Fe片段专一性识别的能力，使用ProteinA/G亲和色谱纯化抗体，获得的产品的纯度较高。但是由于ProteinA/G也属于具有活性的生物物质，因此ProteinA/G分离也存在一些问题:I)价格昂贵:因为蛋白A配基需要通过基因工程的方法生产纯化，因此生产成本高，其价格达到$10000/升亲和介质；2)缺乏有效的清洗方法，由于蛋白A在碱性环境下不稳定，因此不能使用一般的氢氧化钠原位清洗法；3)由于配基也属于蛋白质，易被存在原料液中的蛋白酶水解，从而降低分离效果;4)与一般的化学配基相比，蛋白A色谱的使用生命周期较短；5)配基易脱落， 脱落的蛋白A会引起人的免疫反应且在临床上已经证实对人体有
毒害;6)洗脱pH较低(pH2-3)，易引起一些抗体失活或者出现聚集，常常需要边收集产品，边中和，增加操作的复杂度。对于抗体的分离纯化，也有很多研究者尝试使用小分子化合物作为配体，也取得的了一定的效果，但是目前的小分子化合物配体也存在一些问题:I)生理毒性:目前的小分子化合物配体多含有杂环，具有一定毒性。例如，4-巯基-乙基吡啶(MEP)，其对小鼠50%致死量为178mg/kg。2)亲和性差:目前的小分子化合物配体亲和力通常较ProteinA/G低。所以，目前IgG的分离纯化缺乏一种高效安全经济的亲和配体。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供了一种小分子亲和肽作为亲和配体，实现高效安全经济的IgG分离纯化。本发明的另一目的是提供上述小分子亲和肽的应用。本发明的小分子亲和肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1-18中的任一项所示。进一步地，根据本发明的小分子亲和肽，其结构特征，自N端至C端如下:NH2-R1-R2-R3-R4-COOH,
其中，R1为谷氨酸(Glu)或门冬氨酸(Asp)，R2和R3为色氨酸(Trp)或酪氨酸(Tyr)或苯丙氨酸(Phe)，R4为半胱氨酸(Cys)。也可以理解为R1为酸性氨基酸，R2和R3为含苯环结构的氨基酸，R4为半胱氨酸(Cys)。本发明的小分子亲和肽，所述小分子亲和肽与人免疫球蛋白IgG的Fe片段结合。进一步的，本发明通过将所述的小分子肽偶联于载体以分离纯化免疫球蛋白IgG。本发明提供一种小分子亲和肽及其应用，用于分离纯化免疫球蛋白IgG，通过将所述的小分子肽偶联于不同的载体可以实现不同条件下免疫球蛋白IgG的分离或纯化，例如将该小分子肽偶联于琼脂糖凝胶，可以制备亲和层析柱纯化免疫球蛋白IgG ;而将该小分子肽偶联于透析器的中空纤维膜，则可应用于自身免疫性疾病的血液净化治疗，选择性的清除致病IgG。本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果:I)高效:该小分子亲和肽的结合力与人免疫球蛋白天然配体ProteinA/G相当。2)安全:该小分子亲和肽分子量小(小于6肽)，无免疫原性；其残基序列取自20
种必需氨基酸，安全无毒。3)经济:该小分子亲和肽由固相合成而得，成本较低且便于质量管控。因而采用该小分子亲和肽作为亲和配体，可以实现高效、安全、经济的IgG分离纯化。
图1为本发明中小分子亲和肽I与免疫球蛋白IgG的SPR动力学测定曲线；图2为天然配体与免疫球蛋白IgG的SPR动力学测定曲线。
具体实施例方式实施例1多肽合成I)活化树脂:称取 IOOOmg FMOC Cys-wang Resin，加入 10_15mLDMF浸泡 30min(浸没全部树脂)，使其充分溶胀。2)脱保护:压滤除去浸泡树脂的DMF，加入用20%哌啶的DMF溶液10mL，氮气吹沸反应15min，然后压滤除去用20%哌啶的DMF溶液，脱除氨基的FMOC基团，用IOmL异丙醇洗涤树脂三次，IOmL DMF洗三次，而后用茚三酮法检测树脂应成黑色或紫色。3)缩合反应:连接下一个氨基酸，称取FMOC-氨基酸(Glu或Asp)的用量是
1.4mmol/g 树脂，910mg TBTU,加入 IOmL DMF 和 0.45g HOBt 混和均匀后，加入 0.52mL DIEA配成反应液，室温下氮气吹沸反应2h。反应完毕后，用异丙醇洗涤树脂三次，然后用DMF洗涤树脂三次。检测氨基。4)重复步骤2)-3):按多肽的顺序自C端向N端延伸多肽。重复脱保护、洗涤、缩合的过程至剩余的氨基酸连接完毕，完成多肽的连接。第二位与第三位氨基酸为Trp或Tyr或Phe，末位氨基酸为Cys。5)多肽切割:用氮气将多 肽-树脂复合物吹干，按TFA/phenol/H20/thioanisole/EDT/TIS (80/5/5/5/3/2)的比例配成混和切割试剂。将肽树脂置于圆底烧瓶中，加入切割液磁力搅拌2小时，用200目砂芯过滤器除去树脂，滤液直接抽入冷冻乙醚中，3000r / min离心使粗肽沉淀，冻干至恒重即得粗肽，干燥称重。6)粗肽用HPLC纯化至95%以上，质谱鉴定。实施例2IgG亲和特性测定I)配制 10mmol/L Hepes 缓冲液，ρΗ7.4，NaCl 含量 150mmol/L。2)以I)中配制液体为流动相，运行BiaCoreT200分析仪。3 )插入检测芯片CM5，设定流速30 μ L/min。4)依次注入EDC和NHS各100 μ L，活化芯片。5)将IgG溶解于醋酸钠缓冲液，ρΗ4.5，IgGlOO μ g/mL。6)注入5)中IgG溶液100 μ L，固定IgG于芯片表面。7)将小分子亲和肽I (氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示)，小分子亲和肽2 (氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示)，小分子亲和肽3 (氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示)和天然配体(ProG与ProA),溶解于I)中配制液体,含量100 μ g/mL。8)依次注入不同浓度的多肽和天然配体，记录其与IgG的吸附曲线。求得其相关参数，具体结果见图1、图2及其表I (小分子亲和肽2、3的免疫球蛋白IgG的SPR动力学测定曲线图的绘制同小分子亲和肽1，本实施例不再累述给出)。表I为本发明中小分子亲和肽，ProteinA/G与免疫球蛋白IgG结合常数比较表
权利要求
1.一种小分子亲和肽，其特征在于，所述小分子亲和肽的氨基酸序列如SEQ IDN0.1-18中的任一项所示。
2.根据权利要求1所述的小分子亲和肽，其特征在于，所述小分子亲和肽与人免疫球蛋白IgG的Fe片段结合。
3.权利要求1所述小分子亲和肽的应用。
4.根据权利要求3所述的小分子亲和肽的应用，其特征在于，所述的应用为在分离、纯化或清除人免疫球蛋白IgG中的应用。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体地，本发明涉及一种小分子肽及其应用。本发明的小分子亲和肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1-18中的任一项所示。根据本发明的小分子亲和肽，其与人免疫球蛋白IgG的Fc片段结合。采用本发明的小分子亲和肽作为亲和配体，可以实现高效、安全、经济的IgG分离纯化。
文档编号C07K1/22GK103087150SQ201310008029
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月9日 优先权日2013年1月9日
发明者徐霞, 韦宇平 申请人:中国科学院过程工程研究所