专利名称：一种可抑制病毒粒子释放的蛋白，其编码序列及在抑制逆转录病毒从细胞释放中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可抑制病毒粒子释放的蛋白，其编码序列及在抑制逆转录病毒粒子从细胞释放中的应用，特别涉及一种马tetherin蛋白，其编码序列及在抑制EIAV、HIV以及SIV从细胞释放中的应用，属于生物技术领域。
背景技术：
机体内存在一些先天的免疫因子，这些因子可以起到控制病毒蔓延和防止病毒跨种间传播的作用，被称为“宿主限制因子”，参与先天性免疫反应，干扰病毒生命周期的不同阶段。在人免疫缺陷病毒研究中发现，宿主细胞天然存在若干种屏障，对病毒的侵入、复制和出芽存在限制作用。目前有四大类限制因子:APOBEC (可诱导前病毒DNA产生致命的超级突变)、Trim5a (可特异性与刚进入细胞的病毒核衣壳蛋白结合，从而阻止病毒的脱壳和逆转录)、Tetherin (限制逆转录病毒释放)、SAMHDl (阻碍逆转录病毒cDNA的合成，干扰病毒感染)。这些限制因子可有效地限制逆转录病毒感染，是宿主抵抗病毒感染的一个重要防御屏障。 1994年人们首次发现BST-2表达在人的浆细胞系、骨髓间质细胞和B细胞的表面，并推测该蛋白在B细胞的发育过程中发挥作用。2006年，研究人员证实BST-2是卡波西肉瘤相关性抱疫病毒(Kaposi’ s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)K5 蛋白(又称 MIR2)的一个靶点，由此推测BST-2很可能与宿主抗病毒的防御机制有关。2008年这一抗病毒活性得到证实，它可以抑制Vpu缺陷的HIV-1病毒的释放，重新命名为tetherin。Tetherin (BST2/CD317)是一种由干扰素诱导产生的抗病毒分子，它能够抑制感染哺乳动物的多种衣壳病毒粒子从感染细胞中释放。所有这些病毒共同具有的结构——病毒外膜，是tetherin作用的祀点。Tetherin通常只在类楽；树突状细胞上、部分癌细胞、终末分化成熟的B细胞和骨髓间质细胞中高效表达，但是tetherin也可以受I型干扰素(IFN-1)的诱导而表达。人体感染HIV-1病毒后，病毒粒子与树突状细胞(IFN的主要生成细胞)上的CD4受体结合，经内吞作用进入细胞浆，内涵体中的病毒核酸与TLR7/9结合，启动信号传导通路，诱导IFN-1 (包括IFNa、IFN^和IFNco三种形式)的表达。IFN-1可以诱导上百种不同基因的表达，并活化天然杀伤性细胞、骨髓树突细胞、T细胞、B细胞和巨噬细胞。IFN-a和IFN-β与它们相应受体结合，通过JAK/STAT信号途径诱导感染病毒的细胞中tetherin的表达。诱导产生的tetherin首先迁移到内质网上,然后通过COPI1-coated泡状体运送到高尔基体的区室中，最终到达浆膜，同时利用胞质尾区保守的酪氨酸基团与AP2衔接蛋白复合物结合，在网格蛋白介导的内吞作用下进入包涵体，并在高尔基体和细胞表面之间循环往返。为了防止促炎细胞因子产生过剩，造成免疫亢奋，还有一个负反馈调节机制，即tetherin与浆细胞树突状细胞上的TLR7结合，抑制IFN-1和其他促炎细胞因子的表达。当新生的病毒出芽或释放时，Tethein —端或两端的膜锚定区可插入到病毒的衣壳中，进而将病毒锚定在细胞膜的表面，在细胞的内吞作用下，利用溶酶体降解病毒粒子。
在长期进化过程中，病毒往往通过自身编码的蛋白来抑制Tetherin的活性，从而形成了特定的逃逸机制。例如，人免疫缺陷病毒(HIV-1)的Vpu及猴免疫缺陷病毒(SIV)的Nef蛋白可拮抗tetherin的限制作用。然而适应一种宿主的病毒只能对抗该宿主的tetherin的限制作用，对异种动物tetherin的限制不具有对抗作用。因此,tetherin被认为在防止病毒跨种间传播方面具有重要作用。Vpu蛋白是HIV-1病毒的辅助调节蛋白之一，是一个大小为16kDa的跨膜蛋白，可直接与Tetherin的跨膜区相互作用。这种相互作用具有高度的特异性，tetherin跨膜区位点的突变可使其克服Vpu的拮抗作用。Vpu弓I起宿主细胞表面tetherin水平下降、也会使细胞中tetherin总量减少。Vpu在高尔基体反面的网状结构或早期内涵体上祀定tetherin,通过β-TrCP (嵌合泛素连接酶)-依赖机制,经蛋白酶或溶酶体途径降解tetherin,从而将tetherin的作用沉默。然而，Vpu上的结合位点β-TrCP的突变并不能完全干扰Vpu克服tetherin的作用；而tetherin含量下调也并不完全取决于Vpu的中和作用。所以，tetherin在细胞表面表达减少、在细胞内被降解或者沉默的确切机制，以及Vpu依赖性的病毒释放增强机制中各因子的作用还需要进一步的研究。大多数灵长类慢病毒并不含有Vpu蛋白，有些慢病毒(例如分别感染乌白眉猴sooty mangabeys、短尾猴 macaques、Syke 猴、Syke，s monkeys 和非洲绿猴 African greenmonkeys的SIVsmm、SIVmac、SIVsyk和SIVagm病毒)利用自身编码的Nef蛋白抵抗tetherin的抑制作用。另外，感染黑猩猩chimpanzees和大猩猩gorillaz的SIVcpz和SIVgor病毒是HIV-1的起源，也含有Vpu蛋白， 但是却应用Nef蛋白阻断tetherin的作用。Nef是病毒在体内有效复制的关键蛋白，它可以在宿主细胞中调控细胞的运输、信号转导和基因的表达。Nef是如何拮抗tetherin的作用目前还不清楚，但是Nef可作为衔接蛋白(adaptorprotein),与胞浆中的⑶4、⑶28和MHC-1相互作用，使它们的表达量降低。Nef还可以锚定Tetherin的胞质尾区，降低tetherin在宿主细胞表面的表达。如果在Nef上做某些突变，可阻断它对tetherin的作用，同时也可以消除它对⑶4表达量下调的作用。Tetherin抗病毒活性的发现为宿主防御机制研究方面开辟了一个新的领域。目前，人们对病毒与宿主之间相互作用的复杂机制的了解还刚刚开始，仍有一些宿主限制因子没有发现，受IFN-1诱导产生因子的功能也还未可知。是否不能诱导IFN-1反应的病毒就不需要有自身编码的拮抗基因的存在还不清楚。Tetherin拮抗物对于病毒复制方面的重要意义还需要进一步的研究。进一步的研究不仅可以揭示病毒与其宿主相互斗争的分子机制，而且还可以引入基因干预的思路来治疗HIV和其他病毒
发明内容
本发明的目的在于通过分子克隆技术，构建马tetherin蛋白基因和EIAV感染性克隆的真核表达载体，研究马tetherin与EIAV的相互作用关系，并确定他们相互作用的关键位点。为了达到以上目的本发明采用了以下技术方案:本发明利用普通PCR从马血中扩增马tetherin基因，应用克隆技术构建该基因及其突变基因(delCT、delGP1、N51A、N78A)的重组质粒，利用融合PCR技术和克隆技术构建EIAVaenv的Gp2、Gp3包装质粒；通过脂质体Lipofectamine2000在驴皮肤细胞上转染马tetherin重组质粒，再感染EIAV病毒，或者在Hela或者HEK293T细胞上通过磷酸钙法共转染目的基因和包装质粒，收集细胞裂解液和培养液上清，进行Western Blotting分析，或者固定细胞进行间接免疫荧光试验。结果成功构建了 PEF4.HA.Flag和Eq.te重组质粒，经测序分析，克隆的马tetherin基因与该基因的预测序列的同源性为99%(493/498)，相对应的氨基酸序列同源率为94.0% (156/166);经Western blottining分析,在26Ku处能够检测到目的蛋白的表达。在感染试验中，通过研究发现转染马tetherin的驴皮肤细胞的培养液上清中检测不到EIAV。在重组质粒共转染试验中，马tetherin和Gpl/Gp2/Gp3重组质粒共转染HEK293T或Hela细胞,经Western blottining分析,对照组未转染tetherin的细胞裂解物和培养液上清中均可检测到EIAV的病毒样颗粒，而不能在转染tetherin的细胞却在上清液检测到病毒；应用间接免疫荧光试验，在共聚焦显微镜下观察，马tetherin和EIAV共定位于细胞浆、细胞膜和核膜上。共转染马tetherin缺失基因delCT/delGPI或N51A/N78A和Gp2重组质粒，delCT和delGPI的培养液上清中可检测到EIAV，其所释放的病毒量少于阴性对照、多于阳性对照的；N51A和N78A上清液中所释放的病毒与阳性对照无明显差异，与阴性对照相比病毒量均显著降低。共转染马tetherin、EIAV的env和Gpl重组质粒,在上清液中能够重新检测到EIAV的病毒样颗粒。通过以上实验证实本发明所克隆得到的马tetherin基因所编码的蛋白可以抑制EIAV病毒从细胞中释放，并将EIAV限制在细胞膜和核膜上，马tetherin基因中的胞浆尾区(CT)和GPI是tetherin与EIAV作用的关键位点，N51和N78糖基化位点的突变对病毒的限制作用没有影响。在病毒与宿主的相互作用上，EIAV的env蛋白能够拮抗tetherin对EIAV的限制作用。另外，通过进一步的实验研究发现，本发明所克隆得到的马tetherin基因所编码的蛋白同样可以抑制HIV以及SIV病毒从细胞中释放。因此，在此研究的基础上，提出了本发明。本发明的一种可抑制病毒粒子释放的蛋白，为马tetherin蛋白，其特征在于具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。本发明还提供了编码所述蛋白的核苷酸序列。在本发明中，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。含有所述的核苷酸序列的表达载体及含有该所述的表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。再进一步的，本发明还提供了所述的蛋白在制备抑制逆转录病毒从细胞释放的药物中的应用，所述的逆转录病毒包括马传染性贫血病毒(EIAV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及猴免疫缺陷病毒(SIV)。所述的核苷酸序列在制备抑制病毒从细胞释放的药物中的应用，所述的病毒包括马传染性贫血病毒(EIAV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及猴免疫缺陷病毒(SIV)。更进一步的，本发明还提供了马传染性贫血病毒(EIAV)的囊膜蛋白(env)在制备拮抗本发明所述的蛋白对马传染性贫血病毒(EIAV)从细胞释放的抑制作用的药物中应用。在本发明中，所述的囊 膜蛋白(env)的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
图1为VR-Gp2载体构建示意图；图2为VR_Gp3载体构建示意图；图3为pHAHA阳性质粒的酶切鉴定结果；I:pcDNA3.1 (+) ；2:pHAHA-Clonel ；3:pHAHA-Clone2图4为pHF重组质粒PCR鉴定结果；图5为目的基因的扩增；图6为Eq.te重组质粒的鉴定；图7为核苷酸序列的比对结果；图8为蛋白质序列的比对结果；图9为Eq.te、delCT和delGPI阳性克隆序列的比对结果；图10为Eq.te、delCT和delGPI重组质粒在HEK293T细胞上的表达情况；图11为马Tetherin抑制EIAV病毒的释放情况；图12为马tetherin与EIAV的共定位；图13为马teherin突变体对EIAV的影响；图14 为 EIAV Env 对马 tetherin 的影响；图15为马tetherin对HIV释放的影响；图16为马tetherin对SIV释放的影响。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。实施例11.材料与方法1.1 材料111 细胞E.coli HBlOl工程菌由本实验室保存，培养与LB培养基中(细菌培养所用胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)均购自 Sigma 公司)；HEK293T、Hela、驴皮肤(FDD)细胞和驴血管内皮细胞由本实验室保存，培养于DMEM高糖(购自Gibco公司)培养基中。1.1.2载体与主要试剂pef4myc-his-B、pFD3-8(含有EIAV的全基因序列)质粒为本实验室留存，pMD-18T购自TaKaRa公司，pcDNA3.1 (+)、pVR载体由本实验保存；pNL43_Hsas质粒为HIV Vif缺失性的感染性克隆，pBR238.E.N质粒为SIV Env和Nef缺失性的感染性克隆；人Tetherin(H0.te)和猴Tetherin (M ac.te)、真核表达质粒为本实验室已构建并保存的。AxyPrep血RNA小量制备试剂盒购自A XYGEN公司；PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒均购自Omega公司；Lipofectamine2000脂质体购自Invitrogen公司；细胞培养用试剂血清等均购自Gibco公司；M_MLV逆转录酶购自Invitrogen公司；LA Taq、dNTP购自TaKaRa公司；EcoR1、NotI, BamHI等限制性内切酶和T4DNA Iigase购自NEB公司。Monoclonal Ant1-HA clone HA_8Mouse Ascites Fluid(H9658)和 Monoclonalant1-beta-actin clone AC-15Mouse Ascites Fluid (A5441)购自 Sigma 公司 Ant1-mouseIgG (H & L) Antibody IRDye800Conjugated (MinXBvCh Gt GP Ham Hs Hu Rb Rt & Sh SerumProteins) (610-732-124)购自 ROCKLAND 公司；Rabbit polyclonal secondary antibodyto horse IgG-H&L (TRIC 或者 FITC)购自 abeam 公司，Ant1-Mouse IgG R-Phycoerythrin(或者FITC) conjugate购自SIGMA公司；HIV的p24单克隆抗体和SIV的p27单克隆抗体为实验室自备；核酸 DL2000DNA Marker 购自 TianGEN 生化公司，PageRuler PrestainedProtein Ladder (SM0671)购自 Fermentas 公司。Fast Mutagenesis System 试剂盒购自Transgene 公司。1.1.3主要仪器MASTERCYCLER 梯度 PCR RGppendorf 公司)，Mupid-one 核酸电泳仪(TAKARA 公司)，Champ Gel-3220凝胶成像分析系统(SAGE CREATION公司)，蛋白电泳仪和转膜仪均购自 Bio-Rad 公司；0dyssey Infrared Imaging System (L1-COR 公司)和二氧化碳培养箱(Thermo Scientific公司)；激光共聚焦显微镜购自Leica公司。1.2 方法1.2.1RNA 的提取真空采取健康马血，用AxyPrep血RNA小量制备试剂盒提取血液中的总RNA，300 μ I全血按说明书的步骤操作，最终加入100 μ I Buffer TE洗脱获得马血液RNA。1.2.2引物的合成根据Equus cabalIus tetherin 基因预测的序列(GeneBank 登录号:XM-OO1915091.1)设计并合成引物，利用引物eq.te.F和eq.te.R扩增马tetherin序列，利用上、下引物 HAHA.F/R、HAflag.F/R 或Ps`t1.Linker.S/Bgl I1.Linker.A退火构建带有HAHA,HAflag标签和含有Linker序列的质粒，利用引物eq.delCT.F和eq.te.R扩增5’端(N端)缺失胞衆尾区的马tetherin序列,利用引物eq.te.F和eq.delGP1.R扩增3’端(C端)缺失GPI片段的马tetherin序列，利用引物eqTe.N51A.F/R或eqTe.N78A.F/R引物进行N到A的定点突变；利用融合PCR分别扩增EIAV序列的A、B和C段序列，利用引物gpF和gpR扩增EIAV的gag和pol基因序列，利用引物gtpF和gtpR扩增EIAV的gag、tat和pol基因序列。扩增基因的引物名称及其序列如表I所不。表1.扩增基因的引物名称及其序列
权利要求
1.一种可抑制逆转录病毒粒子释放的蛋白，为马tetherin蛋白，其特征在于具有SEQID N0.1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述蛋白的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQIDN0.2所/Jn ο
4.一种表达载体,其特征在于含有权利要求2或3所述的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求4所述的表达载体。
6.权利要求1所述的蛋白在制备抑制逆转录病毒从细胞释放的药物中的应用，所述的逆转录病毒包括马传染性贫血病毒、人免疫缺陷病毒及猴免疫缺陷病毒。
7.权利要求2或3所述的核苷酸序列在制备抑制逆转录病毒从细胞释放的药物中的应用，所述的逆转录病毒包括马传染性贫血病毒、人免疫缺陷病毒及猴免疫缺陷病毒。
8.马传染性贫血病毒的囊膜蛋白env在制备拮抗权利要求1所述的蛋白对逆转录病毒从细胞释放的抑制作用的药物中应用，所述的逆转录病毒包括马传染性贫血病毒、人免疫缺陷病毒及猴免疫缺陷病毒。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于所述的囊膜蛋白env的氨基酸序列如SEQIDN0.3所示。`
全文摘要
本发明公开了一种可抑制逆转录病毒粒子释放的蛋白，其编码序列及在抑制病毒从细胞释放中的应用。本发明研究了该蛋白与马传染性贫血病毒(EIAV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1)及猴免疫缺陷病毒(SIV)的相互作用关系，并确定他们相互作用的关键位点。本发明通过分子克隆技术，获得了该蛋白基因和EIAV病毒样颗粒的真核表达载体，经测序分析，克隆的该蛋白基因与该基因的预测序列的同源性为99%，相对应的氨基酸序列同源率为94.0%。该蛋白具有限制人免疫缺陷病毒1型、马传染性贫血病毒、以及猴免疫缺陷病毒病毒粒子从细胞释放的能力，进一步的研究发现，EIAV的env蛋白能够拮抗该蛋白对病毒的限制作用。
文档编号C07K14/47GK103073629SQ20131000196
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月4日 优先权日2013年1月4日
发明者王晓钧, 胡哲 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所