专利名称：固相片段法制备卡培立肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽的制备方法，具体地涉及卡培立肽的制备方法。
背景技术：
卡培立肽(Carperitide),别名基因重组心房肽、卡哌利丁、Hamp、人脑利钠肽,它的适应症是急性心功能衰竭(包括慢性心功能衰竭加重)。卡培立肽药理学作用是通过刺激心肌伸展，由心室内颗粒合成的，然后通过冠状动脉分布全身，作用于血管平滑肌和肾脏等组织，调节血压和体内电解质平衡。卡培立肽为28个氨基酸组成的一种循环调节激素，起血管扩张和利尿作用。卡培立肽引起的血管舒张是由于与血管平滑肌的ANP(心房利钠多肽)受体结合，通过提高鸟苷酸环化酶的活性而实现的，提示可减轻心脏前、后负荷。目前卡培立肽的合成方法分为两大类:一是基因重组，二是采用Boc路线液相或固相合成。ZL200510012425.5公开了采用基因重组技术生产卡培立肽的方法，CN102382188报道了一种采用固相Fmoc路线逐个偶联制备卡培立肽的方法，CA1245635A1报道的为采用Boc路线固相合成卡培立肽最后通过HF树脂切割、液相氧化、HPLC (高压液相色谱)纯化等步骤得到精肽，CA1245637A1报道的为采用基因重组技术生产卡培立肽，其它的专利文献如EP0440311A1、JP3004169A、US4673732A等都是或者采用基因重组技术生产卡培立肽或者采用Boc路线固相或液相方法合成得到精肽。采用基因重组技术，操作繁琐，投资大，药物纯度不高，存在较高的技术壁垒。采用Boc路线液相或固相合成，需要使用HF及大量使用TFA,由此带来对环境的严重污染。同时液相法存在操作周期长、操作繁琐等缺点，不利于大规模工业化生产。而采用固相Fmoc路线逐个偶联制备卡培立肽具有合成周期长、产率低的缺点。为了克服上述缺点，本发明采用Fmoc路线固液结合片段法合成卡培立肽，具有操作简单、合成周期短、对环境友好的特点。
发明内容
本发明提供了一种采用Fmoc路线固液结合片段法合成卡培立肽的方法，申请人发现，采用该方法，多个片段合成同时进行，合成周期减少了 2/3，中间体易纯化，成本低，最终产品纯度高，副产物少，产品收率高，利于卡培立肽的大规模生产。在一个实施方案中使用本发明的方法得到的粗肽纯度为75%以上，总收率达到25%以上。本发明所述卡培立肽的序列为:H-Serl-Leu2-Arg3-Arg4-Ser5-Ser6-Cys7-Phe8-Gly9-Gly10-Arg11-Met12 - ASp13-Arg14-1 Iei5-Glyl6-Alai7-Glnl8-Seri9-Gly20-Leu21-Gly22-Cys23-Asn24-Ser25-Ph-e26-Arg27-Tyr28-0H (S-S: 7-23)具体地，本发明所述方法包括如下步骤:
I)在固相载体上采用固相Fmoc路线分别合成4个侧链全保护肽树脂A’、B’、C’和D’，然后将其分别裂解得到4个侧链全保护肽片段A、B、C和D，其氨基酸序列分别为，
片段 A (1-10): Boc-Ser (R) -Leu-Arg (pbf) -Arg (pbf) -Ser (R) -Ser (R) -Cys (Trt)-Phe-Gly-Gly-OH,片段B (11-16):Fmoc-Arg(pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(pbf)-1le-Gly-OH，片段C (17-20) =Fmoc-Ala-Gln (Trt) -Ser (R) -Gly-OH,片段D (21-22):Fmoc-Leu-Gly-OH，和在固相载体上采用固相Fmoc路线合成肽树脂片段E，其氨基酸序列为E (23-28):Fmoc-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(R)-Phe-Arg(pbf)-Tyr (tBu) - Resin,其中，丝氨酸Ser的侧链保护基R=tBu或Trt ；2)将所述步骤I)得到的侧链全保护肽片段D与肽树脂片段E偶联得到肽树脂I ;3)将所述步骤I)得到的侧链全保护肽片段C与所述步骤2)得到的肽树脂I偶联得到肽树脂II ；4)将所述步骤I)得到的侧链全保护肽片段B与所述步骤3)得到的肽树脂II偶联得到卡培立肽肽树脂III ；5)将所述步骤I)得到的侧 链全保护肽片段A与所述步骤4)得到的肽树脂III偶联得到卡培立肽肽树脂IV ；6)将所述步骤5)得到的卡培立肽肽树脂IV裂解得到卡培立肽线性肽；7)将所述步骤6)得到的卡培立肽线性肽液相氧化，得到环化的卡培立肽。本发明优选还包括卡培立肽的纯化步骤。所述纯化步骤可采用本领域已知的任意多肽纯化技术进行，优选采用反相高压液相色谱法。发明人发现，在使用本发明的片段法合成卡培立肽的过程中，卡培立肽序列中5个丝氨酸Ser的侧链保护基可以用tBu或Trt或两者的任意组合。优选地，卡培立肽序列中第6位和第19位的丝氨酸的保护基为Trt，第1、5、25位的丝氨酸的保护基为tBu，这种组合可使得副产物最少，卡培立肽的纯度最高。
图1(A)为线性卡培立肽粗肽的HPLC谱图，图1(B)为线性卡培立肽粗肽经H2O2氧化得到的环化卡培立肽粗肽HPLC谱图。图2为使用HPLC检测卡培立肽醋酸盐精肽纯度的数据。
具体实施例方式本文的术语“肽树脂”是指多肽的C端连有树脂、N端的氨基连有Fmoc保护基的多肽树脂。本文的术语“肽片段”是指上文提及的“肽树脂”脱除C端树脂露出游离羧基、N端的氨基连有Fmoc保护基的多肽。本发明中所用缩写及其含义列于下表:
权利要求
1.一种制备卡培立肽的方法，包括以下步骤: 1)在固相载体上采用固相Fmoc路线分别合成4个侧链全保护肽树脂A’、B’、C’和D’，然后将其分别裂解得到4个侧链全保护肽片段A、B、C和D，其氨基酸序列分别为， 片段 A (1-10):Boc-Ser(R)-Leu-Arg(pbf)-Arg(pbf)-Ser(R)-Ser (R)-Cys (Trt)-Phe-Gly-Gly-OH, 片段 B (11-16):Fmoc-Arg(pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(pbf)-1le-Gly-OH,片段 C (17-20) =Fmoc-Ala-Gln (Trt) -Ser (R) -Gly-OH,片段 D (21-22):Fmoc-Leu-Gly-OH，和 在固相载体上采用固相Fmoc路线合成肽树脂片段E，其氨基酸序列为E (23-28) =Fmoc-Cys(trt)-Asn(Trt)-Ser(R)-Phe-Ar g(pbf)-Tyr(tBu) - Resin, 其中，丝氨酸Ser的侧链保护基R=tBu或Trt ； 2)将所述步骤I)得到的侧链全保护肽片段D与肽树脂片段E偶联得到肽树脂I; 3)将所述步骤I)得到的侧链全保护肽片段C与所述步骤2)得到的肽树脂I偶联得到肽树脂II ； 4)将所述步骤I)得到的侧链全保护肽片段B与所述步骤3)得到的肽树脂II偶联得到卡培立肽肽树脂III ； 5)将所述步骤I)得到的侧链全保护肽片段A与所述步骤4)得到的肽树脂III偶联得到卡培立肽肽树脂IV ； 6)将所述步骤5)得到的卡培立肽肽树脂IV裂解得到卡培立肽线性肽； 7)将所述步骤6)得到的卡培立肽线性肽液相氧化，得到环化的卡培立肽。
2.权利要求1的方法，其中在步骤I)中合成所述侧链全保护肽树脂A’、B’、C’和D’所采用的固相载体为2-CTC树脂，所述树脂替代度范围为0.65-1.lmmol/g ;合成所述肽树脂 A’、B’、C，和 D’ 所采用的偶联剂为 HOBT/DIC、PyBOP/HOBT/DIEA 或 TBTU/HOBT/DIEA，优选TBTU/HOBT/DIEA ;裂解所述侧链全保护肽树脂A’、B’、C’和D’所采用的裂解液按体积比计为 TFE:DCM=1:4。
3.权利要求1的方法，其中在步骤I)中合成肽树脂片段E所用的固相载体为wang树脂或2-CTC树脂，所述树脂替代度范围为0.3-0.6mmol/g，在所述树脂上连接第一个氨基酸所使用的偶联剂为:a)所用树脂为wang树脂时所用偶联剂为HOBT/DIC/DMAP ；b)所用树脂为2-CTC树脂时所用偶联剂为DIEA，第二个氨基酸及之后氨基酸的偶联所用的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBT/DIEA 或 TBTU/HOBT/DIEA，优选为 H0BT/DIC。
4.权利要求1的方法，其中，步骤2)、步骤3)和步骤4)所用的偶联剂为H0BT/DIC、PyBOP/HOBT/DIEA 或 HBTU/HOBT/DIEA，优选为 HBTU/HOBT/DIEA，所采用的溶剂为 DMF、DCM、NMP> DMSO或其任意两者或两者以上的混合物，优选为，按体积比计NMP =DMF=1:1。
5.权利要求1的方法，其中，步骤5)所用的偶联剂为HOBT/DIC、PyBOP/HOBT/DIEA或HBTU/HOBT/DIEA，优选为 HBTU/HOBT/DIEA，所采用的溶剂为 DMF、DCM、NMP、DMSO 或其任意两者或两者以上的混合物，优选为，按体积比计NMP =DMSO=I: I。
6.权利要求1的方法，其中，按体积比计，步骤6)中用于裂解卡培立肽肽树脂IV的裂解液选自 TFA:H20=95:5、TFA:EDT:PHOH:H2O= (90-95): (1-5): (1-3): (1-2)或 TFA:PhSMe:TIS:PHOH:H2O= (80-85): (1-5): (1-5):15: (1-5)，优选为 TFA:PhSMe:TIS:PH0H:H20=80:5:5:5: 5，裂解时间为2-3.5小时，优选为2.5小时。
7.权利要求1的方法，其中在步骤7)中用于氧化卡培立肽线性肽的物质选自DMS0、碘或 H2O2，优选 H2O2。
8.权利要求1的方法，其中，卡培立肽序列中第6位和第19位的丝氨酸的保护基为Trt，第1、5、25位的丝氨酸的保护基为tBu。
9.权利要求1-8中任一项的方法，还包括卡培立肽的纯化步骤。
10.权利要求9的方法，其中纯化步骤采用反相高压液相色谱(RP-HPLC)法，收集目的峰馏分后，经蒸发 浓缩、冻干得到卡培立肽精肽。
全文摘要
本发明公开了一种采用Fmoc路线固液结合片段法合成卡培立肽的方法，该方法中多个片段合成同时进行，合成周期减少了2/3，中间体易纯化，成本低，最终产品纯度高，副产物少，产品收率高，利于卡培立肽的大规模生产，使用本发明的方法得到的粗肽纯度为75%以上，总收率达到25%以上。
文档编号C07K1/04GK103204923SQ20131009306
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者张文治, 刘建, 马亚平, 袁建成 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司