红光发射罗丹明类离子荧光探针及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一类红光发射罗丹明类离子荧光探针，其为通式（Ⅰ）化合物或为通式（Ⅱ）化合物。此外，本发明还公开了该荧光探针的应用。其可以用来对体系、细胞以及组织内的离子浓度进行测定，特别是用来对体系、细胞及组织内的钙离子或镁离子浓度进行测定。
【专利说明】红光发射罗丹明类离子荧光探针及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一类新化合物，具体涉及荧光染料领域，特别涉及一类红光发射罗丹明类离子荧光探针及其应用，特别是其在生物体系内的应用。
【背景技术】
[0002]钙离子在细胞的生命活动中起着重要作用，是机体各项生理活动不可缺少的重要离子，许多生理生化过程如信号传递、肌肉收缩、物质代谢、细胞正常代谢、细胞分化和增殖等都必须有Ca2+参与。随着人们对于钙代谢、钙通道、钙受体及其调控，钙的转运和利用以及某些疾病发生和发展关系的认识越来越深入，细胞内Ca2+浓度在时间和/或空间的变化已经成为细胞学、细胞生物学、神经科学研究的共同课题。因此，需要对钙离子浓度在细胞或亚细胞空间上进行更加准确的测定和获得更加合适的响应时间，而这些都是在不影响系统的生物学过程的情况下进行的。目前为止，所谓的荧光钙离子探针可以很好的满足这种需求，有一系列经过特殊设计的荧光染料，这些荧光染料通过螯合钙离子的同时产生荧光光谱性质的变化，这些变化可以是染料荧光强度或波长的改变，也可以是二者的同时改变。典型的，光谱的改变与钙离子浓度呈线性关系，因此可以对钙离子的浓度进行定量。
[0003]得益于Tsien及其合作者的开创性工作，目前已经产生了一系列具有不同荧光性质和I丐离子解离常数的荧光探针。到目前已有三代I丐荧光探针:第一代是20世纪80年代初合成的quin-2 (Biochemistry, 19:2396-2404);后又合成了能用于双波长比率测定的第二代探针，即 Indo-1 和 Fura-2 (J.Biol.Chem.260:3440-3450 ；U.S.Pat.N0.4，603，209)，这两代钙离子探针均需要紫外光激发；后来又合成了由可见光激发的第三代荧光探针，即Fluo-3 (J.Biol.Chem.264:8179-8184);后来又合成了 Rhod-2 (U.S.Pat.N0.5，049，673)，以及分子探针公司的钙绿-1和钙绿-2 (U.S.Pat.N0.5，453，517)，这几种荧光探针的发射波长大多位于蓝光，绿光到黄光区域。
[0004]目前商业化的荧光探针仍然具有缺点:最主要的问题是它们的激发和发射波长相对较短。当使用短波长光(例如紫外光)进行激发时，许多细胞组分会发射蓝色荧光，这要归咎于所谓的自发荧光或背景荧光。紫外光激发还有可能引起细胞损伤，例如对DNA的破坏，因此对于活细胞探测，紫外光激发的染料并不合适。而可见光激发Ca2+荧光探针与紫外激发的Ca2+荧光探针相比，具有很多优点:可以被大多数基于激光的设备有效激发，包括激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞仪；可以有效避免由于紫外光激发而引起的对细胞的损伤和细胞自发荧光的干扰；细胞光损伤小，光散射较弱；当染料吸收很强时，可以减少染料的浓度，因此可以减少对活细胞的毒性；与光活化探针(锁笼)和其他UV光吸收的探针具有很好的相容性，可以增加多参数测定的选择性；随着钙离子浓度增加，荧光强度显著增加，可以更敏锐的检测Ca2+浓度的瞬间变化，在很多情况下，随着钙离子浓度增加，荧光强度变化越大，越有利于钙离子瞬变的检测。基于以上几点，可见光类的钙离子荧光探针Fluo-3和Rhod-2是对Indo-1和Fura-2的重大改进。其后开发的Calcium Orange和Calcium Crimson更是将Fluo-3和Rhod-2的光谱扩展到橙色光到红色光区域(U.S.Pat.N0.5, 453, 517)。U.S.Pat.N0.5, 453, 517 描述的 Calcium Orange, Calcium Crimson 和其他类似的钙离子荧光探针与以前的钙离子荧光探针(例如Fura-2，Indo-1, Fluo-3和Rhod-2)具有根本的不同，在以前的钙离子荧光探针设计中，钙离子螯合剂部分直接与发色团部分相连。离子螯合剂部分与发色团直接相连的结果是对离子的螯合产生非常好的光谱响应。然而,Calcium Orange和Calcium Crimson的设计是将I丐离子螯合剂部分与发色团通过共价连接基团相连。金属离子螯合剂与发色团的非直接相连使光谱对钙离子的螯合响应较低。
[0005]总之，虽然钙离子荧光探针的开发已走过了 30年的历程，但仍然需要开发出具有高度灵敏性同时具有长波吸收和长波发射的新型钙离子荧光探针，同时需要开发出一系列具有不同钙离子解离常数的荧光探针，从而满足体系、细胞以及组织内钙离子测定的需求。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题之一是提供一种新型化合物(即通式(I )化合物)，此化合物可作为非透膜荧光探针；
[0007]本发明要解决的技术问题之二是提供另一种新型化合物(即通式(II )化合物)，此化合物可作为透膜荧光探针；
[0008]本发明要解决的技术问题之三是提供通式(I )化合物的应用，即其作为荧光探针探测样品中钙离子或镁离子的方法。
[0009]本发明要解决的技术问题之四是提供通式(II)化合物的应用，即其作为荧光探针探测活细胞样品内钙离子或者镁离子的方法。
[0010]本发明提供一类可作为远红外激发，远红外发射的荧光探针，此荧光探针以BAPTA或APTRA为螯合部分，以扩展的罗丹明环为发色团；本发明提供具有不同解离常数的离子荧光探针以满足体系、细胞以及组织内离子测定的需求；本发明提供一种用于细胞内离子水平测定的可透膜的离子荧光探针；本发明提供一种水溶性较好的离子荧光探针以很好的改善在细胞内离子测定时存在的区室化问题；本发明提供一种简便快速合成此类荧光探针的方法以满足商业化的需求。
[0011]在详细描述本发明之前，描述各种术语用来帮助理解:
[0012]术语“共价连接基团”或“L”此处是指单一共价键或者由1-30个非氢原子(可以选择C，N, O, S和P)组成的一系列稳定的共价键，且含有一个化学活性基团与目标分子相连。共价连接基团可以与其他成分组成结合物，例如目标部分为抗体、配体、生物分子、药物和其类似物。
[0013]术语“载体分子”或“W”此处指本发明化合物与生物活性成分或非生物活性成分之间形成共价键。这些成分包括但不仅限于:氨基酸，多肽，蛋白质，多糖，核苷，核苷酸，寡核苷酸，核酸，半抗原，脂素，药物，激素，脂质，脂质体，葡聚糖，合成聚合物，聚合微粒，生物细胞，病毒或者其组合形式。
[0014]术语“亲和力”此处是指两个分子之间的结合力，例如螯合剂与金属离子之间或者阳离子和阴离子之间的结合力。
[0015]术语“体系”此处是指以水为主要成分并且保留水的特性的溶液体系，此处，水溶液体系可以是指在水中加入其他一些溶剂，但水仍是主要成分。[0016]术语“细胞透膜性”是指可以穿过活细胞的细胞壁，可以在本发明化合物上连接亲脂性基团，从而穿过细胞膜而进入活细胞。一旦进入细胞内，亲脂性基团被水解形成带电基团从而使本发明化合物保留在活细胞内。特别有用的亲脂性基团包括乙酰氧甲基(AM)酯和乙酸乙酯，一旦进入细胞内，他们就会被非特异性酯酶水解成为带电分子。
[0017]术语“探测响应”此处指检测样品中由于金属离子的存在而引起的可被肉眼或仪器检测到的直接或间接的信号。典型的，探测响应为光学信号，可以是波长的分布变化，吸收或荧光强度，光散射变化，荧光量子产率，荧光寿命，荧光偏振，激发或发射波长的位移或者是以上参数的混合变化。然而荧光强度增强和/或荧光激发或发射的变化是最有用的。基于离子结合而引起荧光探针的荧光改变一般是由于荧光团的基态或激发态变化，在离子结合位点的电子密度变化，与目标金属离子结合后产生荧光淬灭，或有这些或其他因素的组合引起的。
[0018]术语“荧光团”此处是指化合物固有荧光或与生物活性成分或金属离子或经酶新陈代谢后与产物(例如隐色团)结合而产生的荧光变化。可以对荧光团进行修饰从而改变其溶解性，光谱性质或物理性质。大部分已知的荧光团包括但不仅限于香豆素，吖啶，呋喃，1- 二甲氨基萘-5-磺酰，菁，花，萘，苯并呋喃，喹啉，喹唑啉酮，吲哚，苯并恶唑，和咕吨(包括荧光素，罗丹明等)等。荧光团可以进行修饰从而增强溶解性，活细胞透膜性，改变吸收和发射光谱。
[0019]术语”金属螯合离子”或“目标金属离子”此处是指可以与现有的BAPTA或APTRA及其类似物，衍生物结合的任何金属离子。典型的，这些金属离子都具有相对的生理学或营养学意义，例如:Na+，K+，Zn2+，Mg2+，Fe2+和Ca2+。条目所述金属离子也可以是Ga3+，Tb3+，La3+，Pb2+，Hg2+, Cd2+, Cu2+, Ni2+, Co2+, Mn2+, Ba2+ 和 Sr2+。
[0020]术语“活性基团”此处是指可以与其他化学基团反应形成共价键的基团，例如在合成的反应条件下具有共价活性，一般代表可以与其它底物连接的点。活性基团只是一部分，例如羧酸或者琥珀酰亚胺酯，本发明中所指活性基团是可以与其他不同化合物形成共价连接的官能团。活性基团一般包括亲核，亲电和光活化基团。
[0021]术语“样品”此处是指包含金属离子的任何材料。典型的，样品是活细胞或者由内生主细胞蛋白构成的生物流体或者食品或者环境样品(例如水样品)。样品可以为水溶液，细胞培养物，固体或半固体表面的固着物，例如聚丙烯酰胺凝胶，模印迹或微矩阵。
[0022]本发明描述了一类新型化合物，这类新型化合物可作为离子浓度测定的荧光探针使用，此荧光探针包含与金属离子选择性结合的配体部分(金属离子螯合剂)和荧光团两部分，并且直接将配体部分与荧光团部分相连，当探针的配体部分与某种金属离子结合时，引起荧光团的荧光参数的探 测响应，依据这种关联，可以获得待测离子的信息。因此，本发明荧光探针可以用来对金属离子进行检测，定性和定量。与目前存在的类似探针相比，本发明探针的一个显著优点是具有更长的吸收波长和荧光发射波长，典型的，本发明探针发射红色到深红色荧光；本发明具有更长波长的探针可以使生物体系的自发荧光最小化；另外，红色或深红色荧光可以与其它更短波长的荧光探针联合使用，例如与绿色或蓝色荧光探针联合使用用于多色荧光显影。
[0023]本发明也描述了此类荧光探针的合成和使用方法。
[0024]金属离子螯合剂[0025]本发明描述了金属离子螯合剂，是可以与金属离子结合或螯合的任何部分。典型的，结合或螯合的结果是引起荧光信号的变化。本发明所描述的金属离子是指但并不仅限于 Zn2+，Mg2+，Fe2+ 和 Ca2+，Ga3+，Tb3+，La3+，Pb2+，Hg2+，Cd2+，Cu2+，Ni2+，Co2+，Mn2+，Ba2+ 和 Sr2+。一般而言，此金属离子一般是具有生理学意义的金属离子，包括Zn2+，Mg2+，Fe2+和Ca2+。更进一步而言，此金属离子为Ca2+。目前钙离子测定中最值得信赖的螯合剂均为多聚羧酸类螯合齐[J，BAPTA或APTRA及其类似物均为多聚羧酸类螯合剂，因此可以使用BAPTA或APTRA及其类似物作为金属离子螯合部分，BAPTA或APTRA及其类似物也可以用来螯合上述其它离子。
[0026]此处作为金属螯合部分的” BAPTA”为1，2_双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N'，N'-四乙酸或其类似物，衍生物(例如酯，酰胺，氨基甲酸等)，变体和结合物，所有金属或非金属盐，部分成盐和水合物。其基本结构如下:
[0027]
【权利要求】
1.下述通式(I)化合物:
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于， R2, R3, R4全部为氢； R5为甲基，-CH2CO2-或
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R7为氢，甲基或乙基，R8为氢。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R7和R8连接在一起形成六元环。
5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，W为葡聚糖。
6.下述通式(II)化合物:
7.如权利要求6所述的化合物，其特征在于， R2, R3, R4全为氢； R5为甲基，-CH2CO2R1或
8.如权利要求6所述的化合物，其特征在于，R7为氢，甲基或乙基，R8为氢。
9.如权利要求6所述的化合物，其特征在于，R7与R8连接在一起形成六元环。
10.一种应用权利要求1所述的通式(I )化合物作为荧光探针探测样品中钙离子或镁离子的方法，其特征在于，包含以下步骤: 1)样品与权利要求1所述的通式(I)化合物接触； 2)用合适波长的光源激发样品，并且； 3)探测样品的荧光发射。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述通式(I)化合物，通式(I )中，R2, R3, R4全部为氢；R5为甲基，-CH2CO2 或
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤I)中，如果钙离子或镁离子位于样品的细胞内，则所述通式(I )化合物通过显微注射导入细胞。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤I)中，如果钙离子或镁离子位于样品的细胞外，通式(I )化合物直接与样品接触。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述探测是在荧光显微镜，酶标仪或流式细胞仪设备上进行的。
15.一种应用权利要求6所述的通式(II)化合物作为荧光探针探测活细胞样品内钙离子或者镁离子的方法，包含以下步骤: 1)使细胞样品与权利要求5所述通式(II)化合物接触； 2)培养细胞样品至少5分钟； 3)使用合适波长的光源激发样品，并且； 4)探测样品的荧光发射。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述通式(II)化合物，通式(II)中，R2, R3, R4全为氢； R5为甲基，-CH2CO2R1或
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述细胞样品为细胞培养物，或细胞组织培养物。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述探测是在荧光显微镜，酶标仪或流式细胞仪设备上进行的。
【文档编号】C07D491/22GK103435625SQ201310340800
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月7日 优先权日:2013年8月7日
【发明者】王晓飞, 毛飞 申请人:宝天生物科技（上海）有限公司