一种鸡卵黄抗体的提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸡卵黄抗体的提取方法，步骤如下：将免疫鸡蛋进行清洗、消毒；分离卵黄，打碎，加入蒸馏水稀释，加入量是卵黄溶液体积的3-6倍，根据高免蛋黄抗体效价确定具体稀释比例，搅匀后装入塑料袋内；在-20℃冰柜中冷冻，冻透后取出，使其在室温缓慢融化，边融化边用滤布过滤装置过滤；滤液依次用滤纸、孔径0.8μm滤膜和孔径0.22μm滤膜过滤，滤液即为透明澄清的卵黄抗体液。本发明具有以下有益效果：解决了卵黄抗体的简便、成本低廉，适于大规模工业化生产的问题。提取过程中不使用任何化学药物，对环境无污染，使卵黄抗体真正无残留、无副作用。提取过程中抗体损失较小，提取物抗体效价与蛋黄抗体效价基本一致。
【专利说明】一种鸡卵黄抗体的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及疾病免疫【技术领域】，具体涉及一种鸡卵黄抗体的提取方法。
【背景技术】
[0002]卵黄抗体即卵黄免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobulin, IgY),是通过免疫鸡，从蛋黄中获取的相关抗体。自从1893年，Klemperer报道了鸡蛋中存在抗体以来，卵黄抗体的研究发展越来越快。以其高的特异性和针对性，识别和结合外来抗原并使之失活而用于人类和畜禽疾病的诊断与防治。卵黄抗体化学性质稳定，耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶降解能力。在75°C以下稳定性良好，室温6个月，2-4°C五年活性无明显变化。60°C,，30min巴氏消毒不影响其活性；pH4.0-11.0时比较稳定，对胃蛋白酶有较高的抵抗力。耐反复冻融，反复冻融5次活性不受影响。卵黄抗体具有来源丰富，产量高，成本低，无副作用，无残留，不发生交叉血清反应，使用方便，既可注射又可口服等优点。此外IgY比从哺乳动物提取的抗体更加安全卫生 。
[0003]20世纪末页由于新城疫、鸡传染性法氏囊病的大量流行，卵黄抗体已在我国广泛应用，不过那时只是将高免蛋黄打碎加适量的生理盐水和防腐抑菌剂，制作方法简单、粗略、安全性低，准确的说不能叫卵黄抗体，而是“卵黄液”。现今人们已经研制出多种提取、精制卵黄抗体的方法，如无机盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、氯仿抽提法、水稀释法、冻融法、超滤法、硫酸葡聚糖、天然胶，如藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。
[0004]上述提取方法存在提取过程复杂、提取成本较高，抗体损失较多，并对环境造成污染，大量生产有一定的局限性。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术的不足，本发明依据水稀释法、冻融法的原理设计出水稀释-冻融提取方法，本发明步骤简单，成本低，易大规模工业化生产，不使用化学试剂，无抗体损失的物理提取技术。
[0006]为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是:一种鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于，具体步骤如下:
[0007].1)、将免疫鸡蛋进行清洗、消毒；
[0008].2)、从免疫鸡蛋中取得卵黄，打碎，加入蒸馏水稀释，加入量是卵黄溶液体积的3-6倍，稀释倍数根据卵黄抗体效价确定，搅匀后装入塑料袋内；
[0009].3)、在_20°C冰柜中冷冻，冻透后取出，使其在室温缓慢融化，边融化边用滤布过滤装置过滤；
[0010].4)、将步骤3)得到的滤液依次用滤纸、孔径0.8 μ m滤膜和孔径0.22 μ m滤膜过滤，滤液即为透明澄清的卵黄抗体液。
[0011]上述的消毒，是用0.1%高锰酸钾水浸泡十分钟消毒。
[0012]本发明的进一步改进是在用孔径0.22μπι滤膜过滤之前，向滤液中加入保护剂，所述的保护剂成分和其成分在提取卵黄液中含量为氯化钠0.9%、亚硫酸氢钠0.2%、EDTA2Na0.08%、吐温 800.4%。
[0013]所述步骤2)中加入蒸馏水的量是卵黄溶液体积的6倍。
[0014]所述步骤2)中加入蒸馏水的量是卵黄溶液体积的3倍。
[0015]所述步骤I)还包括取出消毒后的免疫鸡蛋，将免疫鸡蛋表面的高锰酸钾液晾干。
[0016]本发明克服了现有卵黄抗体提取过程复杂，成本高，抗体损失较多，并对环境造成污染，不适合规模化生产等不足。具有以下有益效果:(1)解决了卵黄抗体的简便、低成本，适宜规模化生产的问题。(2)本发明提取过程中不使用任何化学药物，对环境无污染，使卵黄抗体真正无残留、无副作用。(3)本发明提取过程中对抗体损失较少，鸡卵黄中抗体血凝抑制效价和提纯卵黄抗体效价比例与稀释倍数基本一致；抗体液中不含卵黄颗粒，易吸收，无刺激。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
[0018](I)鸡新城疫克隆株30活疫苗；
[0019](2)免疫20只褐壳蛋鸡，间隔10天免疫一次，共免疫3次。第三免后第10天检测卵黄抗体水平，确定卵黄的稀释倍数为1:6。
[0020](3)抗体水平较高时期收集鸡蛋，消毒，分离卵黄，加6倍的蒸馏水，充分搅拌，装入塑料袋内，在冰柜冷冻，冻透后取出缓慢融化，同时进行滤布过滤，滤液依次用滤纸、孔径0.8 μ m滤膜过滤，向滤液中加入保护剂，所述的保护剂成分和其成分在提取卵黄液中含量为氯化钠0.9%、亚硫酸氢钠0.2%、EDTA2Na0.08%、吐温800.4%。，最后孔径0.22 μ m滤膜过滤，即获得澄清透明的卵黄抗体液，核酸蛋白检测仪检测蛋白含量，分装。
[0021]实施例2
[0022]( I)鸡新城疫克隆株30活疫苗；
[0023](2)免疫20只褐壳蛋鸡，间隔10天免疫一次，共免疫3次。第三免后第12天检测卵黄抗体水平，确定卵黄的稀释倍数为1:5。
[0024](3)抗体水平较高时期收集鸡蛋，消毒，分离卵黄，加5倍的蒸馏水，充分搅拌，装入塑料袋内，在冰柜冷冻，冻透后取出缓慢融化，同时进行滤布过滤，滤液依次用滤纸、孔径0.8 μ m滤膜过滤，向滤液中加入保护剂，所述的保护剂成分和其成分在提取卵黄液中含量为氯化钠0.9%、亚硫酸氢钠0.2%、EDTA2Na0.08%、吐温800.4%。，最后孔径0.22 μ m滤膜过滤，即获得澄清透明的卵黄抗体液，核酸蛋白检测仪检测蛋白含量，分装。
[0025]实施例3
[0026](I)禽流感H9活疫苗
[0027](2)免疫20只褐壳蛋鸡，间隔10天免疫一次，共免疫3次。第三免后第10天，用血凝抑制试验检测禽流感H9卵黄抗体水平，确定卵黄的稀释倍数为1:6。
[0028](3)抗体水平较高时期收集鸡蛋，消毒，分离卵黄，加6倍的蒸馏水，充分搅拌，装入塑料袋内，在冰柜冷冻，冻透后取出缓慢融化，同时进行滤布过滤，滤液依次用滤纸、孔径0.8 μ m滤膜过滤，向滤液中加入保护剂，所述的保护剂成分和其成分在提取卵黄液中含量为氯化钠0.9%、亚硫酸氢钠0.2%、EDTA2Na0.08%、吐温800.4%。，最后孔径0.22 μ m滤膜过滤，即获得澄清透明的卵黄抗体液，核酸蛋白检测仪检测蛋白含量，分装。
[0029]实施例4
[0030](I)禽流感H9活疫苗
[0031](2)免疫20只褐壳蛋鸡，间隔10天免疫一次，共免疫3次。第三免后第9天，用血凝抑制试验检测禽流感H9卵黄抗体水平，确定卵黄的稀释倍数为1:4。
[0032](3)抗体水平较高时期收集鸡蛋，消毒，分离卵黄，加4倍的蒸馏水，充分搅拌，装入塑料袋内，在冰柜冷冻，冻透后取出缓慢融化，同时进行滤布过滤，滤液依次用滤纸、孔径
0.8 μ m滤膜过滤，向滤液中加入保护剂，所述的保护剂成分和其成分在提取卵黄液中含量为氯化钠0.9%、亚硫酸氢钠0.2%、EDTA2Na0.08%、吐温800.4%。，最后孔径0.22 μ m滤膜过滤，即获得澄清透明的卵黄抗体液，核酸蛋白检测仪检测蛋白含量，分装。
[0033]实施例5
[0034](I)禽流感 H5-4、H5-5、H5-6 活疫苗；
[0035](2)免疫20只褐壳蛋鸡，间隔10天免疫一次，共免疫3次。第三免后第8天检测卵黄抗体水平，确定卵黄的稀释倍数为1:3。
[0036](3)抗体水平较高时期收集鸡蛋，消毒，分离卵黄，加3倍的蒸馏水，充分搅拌，装入塑料袋内，在_20°C冷冻，冻透后取出缓慢融化，同时进行滤布过滤，滤液依次用滤纸、孔径0.8 μ m滤膜过滤，向滤液中加入保护剂，所述的保护剂成分和其成分在提取卵黄液中含量为氯化钠0.9%、亚硫酸氢钠0.2%、EDTA2Na0.08%、吐温800.4%。，最后孔径0.22 μ m滤膜过滤，即获得澄清透明的卵黄抗体液，核酸蛋白检测仪检测蛋白含量，分装。
[0037]为了进一步说明本发明的具体使用效果，以下采用实验数据来加以验证。
[0038]一、安全和稳定性试验
[0039](1)动物安全试验
[0040]取本发明卵黄抗体样品，注射5只家兔、5只小白鼠和10只鸡，间隔12h量一次兔子体温，并观察各组试验动物有无异常症状。连续观察15天，各组试验动物未出现异常症状，家兔体温无变化。
[0041](2)光稳定性试验
[0042]将本发明的卵黄抗体也适量装入玻璃瓶内，密封后在(4500 ±500) Ix光照条件下室温放置，分别于0、5和IOd取样观察。结果表明，本发明外观一直保持透明澄清，未见分层、色变、絮凝、沉淀等现象，抗体效价未发生变化。
[0043](3)温度稳定性和保存时间试验
[0044]将卵黄抗体液分装于玻璃瓶内，密封后分别置于4°C和20°C条件下留样考察，每隔15d取样观察并检测抗体水平。结果表明，本发明在4°C条件下保存9个月外观性状和抗体效价未见明显变化；在20°C条件下6个月外观性状和抗体效价未见明显变化。
[0045](4)反复冻融试验
[0046]将卵黄抗体分装于玻璃瓶中，密封后_20°C冷冻，在室温融化，这样反复冻融8次，每次融化后观察外观并检测抗体效价，试验结果表明冻融五次对抗体效价没有明显影响，第6次开始抗体效价逐渐下降；反复冻融对卵黄抗体的外观无影响。
[0047]二、室内治疗实验
[0048]以鸡新城疫为例，人工感染新城疫治疗实验。[0049]将AA商品代肉仔鸡200只饲养至21日龄(此时母源抗体已消失殆尽)，挑选发育良好、均匀一致的150只，分为5组。分别为:
[0050]1组为预防组:先注射实施例1制得的抗新城疫卵黄抗体液1ml，间隔一天再注射新城疫病毒(XX08-NDV)；
[0051]2组为治疗I组:按100 μ I/只量接种XX08-NDV病毒，发病后注射实施例1制得的抗新城疫卵黄抗体(IgY) Irnl ；
[0052]3组为治疗2组:按100 μ I/只量接种XX08-NDV病毒，发病后注射实施例1制得的抗新城疫卵黄抗体Iml,连续注射两天；
[0053]4组为同居感染治疗组:本试验组鸡与治疗I组一起饲养，同居感染发病后注射实施例2制得的抗新城疫卵黄抗体Iml,连续用两天；
[0054]5组为对照组:只注射XX08-NDV。
[0055]试验按以下标准判定:
[0056]发病:鸡只出现精神食欲异常，呼吸困难，拉绿色稀粪，死亡鸡气管黏膜充血或出血，腺胃黏膜有出血点，肠道黏膜出血或有局灶性溃疡可判为发病。
[0057]治愈:精神活泼，采食增加，粪便正常，体重增加为治愈。
[0058]鸡只攻毒后第三天出现精神沉郁，拉黄白色稀粪，呼吸困难，并出现死亡。病死鸡剖检气管黏膜充血或出血，腺胃黏膜有出血点，肠道黏膜出血或有局灶性溃疡等典型新城疫病理变化。出现症状后开始注射抗新城疫卵黄抗体。注射IgY后第三天症状逐渐消失，第四到五天完全康复。
[0059]预防组保护率为96.66% ;治疗组一次用卵黄抗体保护率为60.00%,两次用卵黄抗体保护率为80.00%;同居感染(相当于自然感染病例)两次用IgY保护率达93.33%。实验
结果详见下表。
[0060]
【权利要求】
1.一种鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)、将免疫鸡蛋进行清洗、消毒； 2)、从免疫鸡蛋中取得卵黄，打碎，加入蒸馏水稀释，加入量是卵黄液体积的3-6倍，搅匀后装入塑料袋内； 3)、在-20°C冰柜中冷冻，冻透后取出，使其在室温缓慢融化，边融化边用滤布过滤装置过滤； 4)、将步骤3)得到的溶液依次用滤纸、孔径0.8 μ m滤膜和孔径0.22 μ m滤膜过滤，滤液即为透明澄清的卵黄抗体液。
2.根据权利要求1所述的一种鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于，所述的消毒，是用0.1%高锰酸钾水浸泡十分钟消毒。
3.根据权利要求1所述的一种鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于，在用孔径0.22 μ m滤膜过滤之前，向滤液中加入保护剂，所述的保护剂成分和其成分在提取卵黄液中含量为氯化钠0.9%、亚硫酸氢钠0.2%、EDTA2Na0.08%、吐温800.4%。
4.根据权利要求1所述的一种鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于，所述步骤2)中加入蒸馏水的量是卵黄溶液体积的6倍。
5.根据权利要求1所述的一种鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于，所述步骤2)中加入蒸馏水的量是卵黄溶液体积的3倍。
6.根据权利要求2所述 的一种鸡卵黄抗体的提取方法，其特征在于，所述步骤I)还包括取出消毒后的免疫鸡蛋，将免疫鸡蛋表面的高锰酸钾液晾干。
【文档编号】C07K16/02GK103509106SQ201310468282
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月8日 优先权日:2013年10月8日
【发明者】银梅, 王新华, 唐海荣, 王秋霞, 宁红梅, 陈桂香 申请人:河南科技学院