一种从乳猪皮中制备未变性天然胶原的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从乳猪皮中提取未变性天然胶原的方法，其特点是：用脱脂剂辅以间歇性超声波分步多次不同组合进行处理，用脱毛剂和非胶原蛋白去除剂分别进行脱毛和非胶原蛋白的去除，脱毛后皮中已无毛根，测定脂肪含量低于0.5%，灰分含量低于0.3%；以乙酸-蛋白酶浸提得到酶溶胶原，利用高速离心、氯化钠盐析和透析纯化胶原，冻干后得到海绵状乳猪皮胶原，胶原的提取率超过50%（干重），电泳图表明乳猪皮胶原含有β链和α链，分子量分别为20万和10万，无其他杂蛋白条带，表明胶原保留了三股螺旋结构，且具有较高的纯度。
【专利说明】一种从乳猪皮中制备未变性天然胶原的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从乳猪皮中制备未变性天然胶原的方法，属于生物医用材料的制备领域。
【背景技术】
[0002]未变性天然胶原仍保持其独特的三股螺旋结构，呈右手超螺旋结构，分子结构为独特的甘氨酸-X-Y(X、Y为其他种类的氨基酸，多为脯氨酸、羟脯氨酸)周期结构。主要分布于皮肤、骨、角膜、肌腱等部位，具有人工合成高分子所不可媲美的低抗原性、良好的生物相容性和生物降解性等功能，其应用已广泛渗透到烧创伤、矫形以及硬组织修复等领域。
[0003]未变性天然胶原的广泛应用必然导致其需求量愈来愈大，对其品质的要求也愈来愈高。从哺乳动物皮如猪皮、牛皮中提取的胶原具有较好的耐酶、耐热稳定性和机械性能，因此哺乳动物皮仍是目前胶原制备的主要原材料。[0004]然而，传统胶原制备仅局限于以成年哺乳动物皮为原材料，缺乏对于幼年哺乳动物皮胶原制备的研究。尽管，有文献探讨了增龄性改变对于牛皮胶原理化性质的影响(张文熊、武芳、戴晓涛，《胎牛及成牛皮胶原性质的研究》，中国皮革，2008，I (37): 32-34)。但是，关于猪皮胶原的提取和性质研究主要集中在生长年龄6个月以上的成年猪，国内外尚缺乏关于乳猪皮胶原制备的研究。
[0005]并且，通过附图1中组织切片图a从上往下:可以发现乳猪皮有较成年猪皮更薄的表皮层，约为成年猪皮表皮层厚度的1/2，预处理不当很容易造成真皮层胶原纤维的损伤。其乳头层的毛囊周围分布有发达的脂肪锥和脂腺，毛囊位置较深但针毛短。脱毛时，脱毛剂需穿过或破坏很厚的脂肪锥内的细胞层才能达到毛根，进而削弱毛囊和毛根的联系使毛脱落。其真皮层的胶原纤维不具有固定的织形，胶原纤维束比成年猪皮的细小，纤维束间的间隙比成年猪皮胶原大，已公开发表的文献中的处理方法易造成乳猪皮胶原纤维的破坏。且其真皮层中的脂肪含量与成年猪皮相当，接近15%，脂肪的大量存在严重影响化学药品的渗透，因此仅通过单纯的化学试剂脱脂很难较好的去除脂肪，将不利于脱毛处理，进而严重影响月父原的提取率和品质。
[0006]鉴于乳猪皮组织结构与成年猪皮的差异性，现有从陆生动物组织中提取未变性天然胶原的制备方法并不适用于制备未变性天然乳猪皮胶原。本专利得到的胶原提取率高达50%以上，而成年猪皮胶原提取率仅为30% (赵帅，《猪皮的不同脱脂方法对胶原提取率的影响》，中国皮革，2007，9 (36): 33-36)。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种从乳猪皮中制备未变性天然胶原的方法，特点是将乳猪皮进行脱脂、脱毛和去除非胶原蛋白组分，使脂肪含量低于0.5%、灰分含量低于0.3%，组织切片显示已无针毛、绒毛；胶原提取率高于50% ;获得的海绵状乳猪皮胶原具有较高的纯度。[0008]本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料除特殊说明外，均为重量份数。
[0009]从乳猪皮中制备未变性天然胶原的方法包括以下步骤:
[0010](I)原料预处理
[0011]将新鲜乳猪皮100份，去除皮下脂肪，用料液比为1: 5-20 (w/v)，体积浓度为30%-60%单一脱脂剂处理24-48h，伴随间歇性功率为50-200W超声波每作用10_30min停5-20min，重复5-10次，中途换液3-5次，自来水冲洗，加入料液比为1: 1.5-4(w/v)，体积浓度为0.5%-3%脱毛剂，保持温度为25-45°C，转动30_60min进行脱毛，然后将皮切碎，加入料液比为I: 10-40 (w/v)，浓度为0.05-0.511/1非胶原蛋白去除剂，搅拌处理24-4811，中途换液3-5次，自来水冲洗，调节pH至7.5-9.0,再用料液比为1: 6_15 (w/v),体积浓度为20-50%复合脱脂剂处理24-48h，伴随间歇性功率为50-200W超声波每作用10_30min停5-20min，重复5_10次，中途换液3_5次，蒸馏水浸洗，测定脂肪含量为0.3%~0.5%，产物作为胶原提取原料；
[0012](2)未变性天然胶原的提取
[0013]将上述预处理所得的乳猪皮加入浓度为0.1-2M/L乙酸溶液和浓度为lwt%_5wt%提取剂，搅拌提取2-3天，获得未变性乳猪皮胶原溶液；
[0014](3)未变性天然胶原的纯化
[0015]将上述未变性乳猪皮胶原溶液用8000-20000rpm高速离心机分离，除去滤渣，上清液中加入0.5-3M/L的NaCl盐析，沉淀经离心后用0.05-1M/L的乙酸溶解，如此反复盐析操作2-4次，再以浓度为0.1-1M/L的乙酸溶液为透析液透析处理2-3天，冻干，得到海绵状乳猪皮胶原；`
[0016](4)以上步骤中除特殊说明外，均在温度15°C以下进行。
[0017]所述单一脱脂剂为AXAUT-50或AXAUT AP,复合脱脂剂为AXAUT-50或AXAUT-AP中的任一种与异丙醇或丙酮中的任一种的组合。
[0018]所述脱毛剂为蛋白酶Buzyme7703、蛋白酶Nowolase NG或蛋白酶Basozyme LlO中的任一种。
[0019]所述非胶原蛋白去除剂为磷酸盐缓冲液(PBS)、脱氧胆酸钠或牛磺胆酸钠中的任一种。
[0020]所述提取剂为酸性蛋白酶或真菌复合酶。
[0021]结构表征与性能测试:
[0022]采用组织切片对脱毛后的乳猪皮进行纵向切片，详见图1a所示。
[0023]采用组织切片对脱毛后的乳猪皮进行横向切片，详见图1b所示。
[0024]结果表明，乳猪皮中毛囊位置较深，脱毛后皮中已无毛根，有利于后续操作；
[0025]采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对未变性乳猪皮胶原进行分子量测定，详见图2所示。
[0026]结果表明，乳猪皮胶原含有β链和α链，分子量分别为20万和10万，其中α链为两条，无杂蛋白条带，很好地保证了胶原的纯度、保存了胶原蛋白的三股螺旋结构。
[0027]本发明具有如下优点:
[0028]1、从乳猪皮中提取胶原蛋白打破了传统胶原制备仅以成年哺乳动物皮为原材料的思路；[0029]2、利用组织切片技术证明了脱毛剂的有效脱毛；脱脂剂并辅以超声处理，有效的避免了胶原纤维被破坏，极大地去除了脂肪，最终测得脂肪含量低于0.5% ;灰分含量低于
0.3%，表明了所选用试剂对于非胶原物质的有效去除，从而保证了胶原较高的纯度和产率(大于50%)。
[0030]3、采用乙酸、蛋白酶在低温下提取胶原，保留了胶原特有的三股螺旋结构，保证了胶原蛋白的生物活性，所得胶原具有低免疫原性、生物相容性和生物可降解性。
【专利附图】
【附图说明】:
[0031 ] 图1.a为乳猪皮组织切片的纵切图
[0032]图1.b为乳猪皮组织切片的横切图
[0033]图2.为未变性乳猪皮胶原的SDS-PAGE图谱。
【具体实施方式】:
[0034]下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0035]( I)原料预处理
[0036]将新鲜乳猪皮10 0g，去除皮下脂肪，用料液比为1: 20 (w/v)，体积浓度为30%的AXAUT-50处理24h，伴随间歇性功率为50W超声波每作用30min停20min，重复5次，中途换液3次，自来水冲洗，加入料液比为1: 4 (w/v)，体积浓度为0.5%的蛋白酶Buzyme7703溶液，保持温度为25°C，转动30min进行脱毛，然后将皮切碎，加入料液比为1: 10 (w/v)，浓度为0.5M/L的PBS溶液，搅拌处理24h，中途换液3次，自来水冲洗，调节pH至7.5，测定灰分含量0.3%。再用料液比为1: 15 (w/v)，体积浓度为20%异丙醇和AXAUT AP复合脱脂剂处理24h，伴随间歇性功率为50W超声波每作用30min停20min，重复5次，中途换液3次，蒸馏水浸洗，测定脂肪含量为0.5%，产物作为胶原提取原料；
[0037]( 2 )未变性天然胶原的提取
[0038]将上述预处理所得的乳猪皮20g (干重6.3g)加入浓度为0.1M/L乙酸溶液和浓度为lwt%酸性蛋白酶，搅拌提取2天，获得未变性乳猪皮胶原溶液；
[0039]( 3)未变性天然胶原的纯化
[0040]将上述未变性乳猪皮胶原溶液用8000rpm高速离心机分离，除去滤渣，上清液中加入0.5M/L的NaCl盐析，沉淀经离心后用0.05M/L的乙酸溶解，如此反复盐析操作2次，再以浓度为0.1M/L的乙酸溶液为透析液透析处理2天，冻干，得到海绵状乳猪皮胶原3.16g，干重提取率为50.2% ；
[0041](4)以上步骤中除特殊说明外，均在温度15°C以下进行。
[0042]实施例2
[0043]( I)原料预处理
[0044]将新鲜乳猪皮100g，去除皮下脂肪，用料液比为1: 10 (w/v)，体积浓度为45%的异丙醇处理36h，伴随间歇性功率为150W超声波每作用20min停lOmin，重复8次，中途换液4次，自来水冲洗，加入料液比为I: 2.5(w/v)，体积浓度为1.5%的蛋白酶Nowolase NG溶液，保持温度为35°C，转动45min进行脱毛，然后将皮切碎，加入料液比为1: 30 (w/v)，浓度为0.3M/L脱氧胆酸钠溶液，搅拌处理36h，中途换液4次，自来水冲洗，调节pH至8.0，测定灰分含量0.2%。再用料液比为1: 10 (w/v)，体积浓度为35%丙酮和AXAUT-50复合脱脂剂处理36h，伴随间歇性功率为150W超声波每作用20min停lOmin，重复8次，中途换液4次，蒸馏水浸洗，测定脂肪含量为0.3%，产物作为胶原提取原料；
[0045]( 2 )未变性天然胶原的提取
[0046]将上述预处理所得的乳猪皮30g (干重9.45g)加入浓度为0.8M/L乙酸溶液和浓度为3wt%酸性蛋白酶，搅拌提取3天，获得未变性乳猪皮胶原溶液；
[0047]( 3)未变性天然胶原的纯化
[0048]将上述未变性乳猪皮胶原溶液用15000rpm高速离心机分离，除去滤渣，上清液中加入1.5M/L的NaCl盐析，沉淀经离心后用0.5M/L的乙酸溶解，如此反复盐析操作3次，再以浓度为0.5M/L的乙酸溶液为透析液透析处理3天，冻干，得到海绵状乳猪皮胶原5.13g，干重提取率为54.3% ；
[0049](4)以上步骤中除特殊说明外，均在温度15°C以下进行。
[0050]实施例3
[0051](I)原料预处理
[0052]将新鲜乳猪皮100g，去除皮下脂肪，用料液比为1: 5 (w/v)，体积浓度为60%的AXAUT AP处理48h，伴随 间歇性功率为200W超声波每作用IOmin停5min，重复10次，中途换液5次，自来水冲洗，加入料液比为1: 1.5 (w/v),体积浓度为3%的蛋白酶BasozymeLlO溶液，保持温度为45°C，转动60min进行脱毛，然后将皮切碎，加入料液比为1: 40(w/V)，浓度为0.05M/L脱氧胆酸钠溶液，搅拌处理48h，中途换液5次，自来水冲洗，调节pH至9.0，测定灰分含量0.2%。再用料液比为I: 6 (w/v),体积浓度为50%丙酮和AXAUT-50复合脱脂剂处理48h，伴随间歇性功率为200W超声波每作用IOmin停5min，重复10次，中途换液5次，蒸馏水浸洗，测定脂肪含量为0.4%，产物作为胶原提取原料；
[0053]( 2 )未变性天然胶原的提取
[0054]将上述预处理所得的乳猪皮35g (干重Ilg)加入浓度为2M/L乙酸溶液和浓度为5wt%真菌复合酶，搅拌提取3天，获得未变性乳猪皮胶原溶液；
[0055]( 3)未变性天然胶原的纯化
[0056]将上述未变性乳猪皮胶原溶液用20000rpm高速离心机分离，除去滤渣，上清液中加入3M/L的NaCl盐析，沉淀经离心后用1M/L的乙酸溶解，如此反复盐析操作4次，再以浓度为1M/L的乙酸溶液为透析液透析处理3天，冻干，得到海绵状乳猪皮胶原5.79g，干重提取率为52.6% ；
[0057](4)以上步骤中除特殊说明外，均在温度15°C以下进行。
【权利要求】
1.一种从乳猪皮中制备未变性天然胶原的方法，其特征在于该方法包括以下步骤:(1)原料预处理将新鲜乳猪皮100份，去除皮下脂肪，用料液比为1: 5-20(w/v)，体积浓度为30%-60%单一脱脂剂处理24-48h，伴随间歇性功率为50-200W超声波每作用10_30min停5_20min，重复5-10次，中途换液3-5次，自来水冲洗，加入料液比为1: 1.5-4 (w/v)，体积浓度为0.5%-3%脱毛剂，保持温度为25-45，V转动30_60min进行脱毛，然后将皮切碎，加入料液比为I: 10-40 (w/v)，浓度为0.05-0.511/1非胶原蛋白去除剂，搅拌处理24-4811，中途换液3-5次，自来水冲洗，调节pH至7.5-9.0，再用料液比为I: 6-15(w/v)，体积浓度为20-50%复合脱脂剂处理24-48h，伴随间歇性功率为50-200W超声波每作用10_30min停5_20min，重复5-10次，中途换液3-5次，蒸馏水浸洗，测定脂肪含量为0.3%~0.5%，产物作为胶原提取原料；(2)未变性天然胶原的提取将上述预处理所得的乳猪皮加入浓度为0.1-2M/L乙酸溶液和浓度为lwt%-5wt%提取剂，搅拌提取2-3天，获得未变性乳猪皮胶原溶液；(3)未变性天然胶原的纯化将上述未变性乳猪皮胶原溶液用8000-20000rpm高速离心机分离，除去滤渣，上清液中加入0.5-3M/L的NaCl 盐析，沉淀经离心后用0.05-1M/L的乙酸溶解，如此反复盐析操作2-4次，再以浓度为0.1-1M/L的乙酸溶液为透析液透析处理2-3天，冻干，得到海绵状乳猪皮胶原；(4)以上步骤中除特殊说明外，均在温度15°C以下进行。
2.如权利要求1所述从乳猪皮中制备未变性天然胶原的方法，其特征在于单一脱脂剂为AXAUT-50或AXAUT AP,复合脱脂剂为AXAUT-50或AXAUT-AP中的任一种与异丙醇或丙酮中的任一种的组合。
3.如权利要求1所述从乳猪皮中制备未变性天然胶原的方法，其特征在于脱毛剂为蛋白酶Buzyme7703、蛋白酶Nowolase NG或蛋白酶Basozyme LlO中的任一种。
4.如权利要求1所述从乳猪皮中制备未变性天然胶原的方法，其特征在于非胶原蛋白去除剂为磷酸盐缓冲液、脱氧胆酸钠或牛磺胆酸钠中的任一种。
5.如权利要求1所述从乳猪皮中制备未变性天然胶原的方法，其特征在于提取剂为酸性蛋白酶或真菌复合酶。
【文档编号】C07K14/78GK103601803SQ201310603757
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】李国英, 吴论文, 刘文涛 申请人:四川大学