具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱的合成及其药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物的合成方法，具体包括：(1)昆布氨酸缩丙醛希夫碱的合成；(2)双昆布氨酸缩乙二醛希夫碱的合成；(3)昆布氨酸缩3,5-二溴水杨醛希夫碱的合成；(4)昆布氨酸缩2-羟基-1-萘醛希夫碱的合成；(5)昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱的合成。针对上述化合物进行药理学分析研究，具体包括：(1)化合物与DNA相互作用的研究，包括紫外吸收光谱滴定和荧光猝灭光谱滴定；(2)化合物与BSA相互作用的研究，包括色氨酸荧光猝灭光谱滴定；(3)体外细胞毒试验使用SRB检测。本发明技术适合在抗癌领域中推广应用，具有一定的医学价值，为抗癌药物的推广提供了一定依据。
【专利说明】具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱的合成及其药物组合物
【技术领域】
[0001]本发明涉及具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱的合成及其药物组合物，属于药物合成【技术领域】。
【背景技术】
[0002]2012年，世界卫生组织指出，癌症已是导致人类死亡的一个主要原因，目前每年在全球夺去700多万人的生命，预计全世界癌症死亡人数将继续上升，到2030年可能将超过1310万。据全国肿瘤登记中心发布的《2012中国肿瘤登记年报》显示，我国每年新发肿瘤病例约为312万例，平均每天8550人，全国每分钟有6人被诊断为癌症。专家预计，2020年，因癌死亡人数将超过400万。
[0003]尽管目前抗癌药物已有生物烧化剂(Bioalkylating Agengts)、天然产物药物、金属钼配合物等类型，如专利CN1569862A中提出了一种由甲氧基乙酸根Pt (II)胺配合物用于癌症的治疗，但这与癌症种类的多样性、多发性相比较还是急切寻求选择性强、毒副作用小、具有独特构效关系的抗癌新药，这已成为人类当今生命科学和化学科学中急迫而重大的前沿研究课题之一。
[0004]昆布氨酸是源自海洋植物海带中的一种具有独特生物活性的非蛋白质氨基酸，用其合成抗癌新药具有天然无毒、可水溶性、生物相容性好的优点，是目前尚待开发的医药宝库。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物的合成方法，并进行药理学分析，以表征该化合物的具抗癌活性作用。
[0006]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
[0007]具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物的合成方法，具体包括:
[0008](I)昆布氨酸缩丙醛希夫碱的合成:
[0009]将40mmol (2.88g)丙醒用IOmL无水乙醇稀释,缓慢滴加到溶解有40mmol (7.56g)昆布氨酸的40mL乙醇溶液中。滴加完毕后温度缓慢升至70°C，继续反应4小时。蒸发溶液至余下约5mL，加入冰乙醇20mL，有大量沉淀生成。将溶液过滤，分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得白色目标产物。室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，在水中溶解性良好。
[0010](2)双昆布氨酸缩乙二醛希夫碱的合成:`[0011]将40mmol (2.32g)乙二醛用IOmL无水乙醇稀释，缓慢滴加到溶解有80mmol (15.12g)昆布氨酸的40mL乙醇溶液中。滴加完毕后温度缓慢升至70°C，继续反应4小时。蒸发溶液至余下约10mL，加入冰乙醇20mL，有大量沉淀生成。将溶液过滤，分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得微黄色目标产物。室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，在水中溶解性良好。[0012](3)昆布氨酸缩3，5- 二溴水杨醛希夫碱的合成:
[0013]按(1)所示方法合成，将方法中的丙醛用3，5-二溴水杨醛代替，获得预期产物。
[0014]室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，在水中溶解性良好。
[0015](4)昆布氨酸缩2-羟基-1-萘醛希夫碱的合成:
[0016]按(1)所示方法合成，将方法中的丙醛用2-羟基-1-萘醛代替，获得预期产物。
[0017]室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，易溶于水。
[0018](5)昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱的合成:
[0019]按(1)所示方法合成，将方法中的丙醛用2-吡啶甲醛代替，获得预期产物。
[0020]室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，易溶于水。
[0021]针对上述化合物进行药理学分析研究，具体包括:
[0022](1)化合物与DNA相互作用的研究:
[0023]本发明化合物与DNA相互作用能力研究，应用鲱鱼鱼精DNA(HS-DNA)作为研究对象。鲱鱼鱼精DNA(HS-DNA)用NaCl/Tris-HCl (pH = 7.16)缓冲溶液配制成10-4Μ的溶液，测量260nm和280nm处的吸光度⑷，A260/A280在1.8~1.9的范围内，说明HS-DNA溶液符合实验要求。测量HS-DNA在260nm处的吸光度，根据朗姆-比尔定律计算DNA的浓度(以DNA碱基对的摩尔浓度计，ε 260 = 6600L.moF1.cnT1)。
[0024]紫外吸收光谱滴定:化合物用NaCl/Tris-HCl缓冲溶液配成10-3Μ的溶液，然后稀释到IO-5M的浓度；以NaCl/Tris-HCl缓冲溶液作为空白对照液，测定200~800nm波长范围内的紫外光谱。每次加样，分别向空白和配体样品中加入等量配制好的HS-DNA溶液(10_3M)，充分混合然后静止IOmin后再进行扫描。键合常数由以下公式确定:
[0025][DNA] / ( ε a- ε f) = [DNA] / ( ε a- ε f) +1/Kb ( ε a- ε f)
[0026]其中[DNA]代表DNA的浓度，ε a，ε f和ε b分别代表在各DNA浓度下的、游离的和与DNA键合饱和的配体的摩尔吸光系数。以[DNA]/( ε a- ε f)对[DNA]作图，键合常数Kb为直线的斜率和截距之比。
[0027]荧光猝灭光谱滴定:EB_DNA复合体系的配制:将5 μ L EB (1X 1O-3mol -L-1)溶液加入到ImL HS-DNA(IO-3M)溶液中置于IOmL比色管中，常温下避光保存2h。然后加入NaCl/Tris-HCl缓冲溶液稀释至5mL，混合均匀后。以522nm的波长激发，记录EB-DNA复合体系在584nm处的荧光发射波长及强度。每次加样，向样品中加入等量配制好的配体样品溶液(I(T3M)，记录不同浓度配体对EB-DNA复合体系的荧光猝灭光谱。猝灭系数由Stern-Volmer公式确定:
[0028]I0/I = 1+KSV[Q]
[0029]其中I0和I分别代表不加化合物和加化合物时EB-DNA复合体系的的荧光强度；[Q]表示猝灭剂(化合物)的浓度。以10/1对[Q]作图，斜率即为猝灭常数Ksv。
[0030](2)化合物与BSA相互作用的研究:
[0031]本发明化合物与蛋白相互作用能力研究，应用牛血清白蛋白(BSA)作为研究对象。紫外吸收光谱滴定:将配制好的BSA储备液(100 μ Μ)稀释到10 μ Μ，以NaCl/Tris-HCl缓冲溶液作为空白对照，测定200~350nm波长范围内的紫外光谱，每次加样分别向空白和BSA样品中加入等量配制好的化合物溶液(10_3M)，充分混合然后静止IOmin后再进行扫描。
[0032]色氨酸荧光猝灭光谱滴定:将配制好的BSA储备液(100 μ M)稀释到10 μ Μ，以295nm的波长激发，记录BSA溶液在584nm处的荧光发射波长及强度。每次加样，向样品中加入等量配制好的化合物样品溶液(IO-3M)，记录不同浓度化合物对BSA溶液的荧光猝灭光谱。粹灭系数由Stern-Volmer公式确定:
[0033]10/I = 1+KSV[Q] = I+Kq τ 0[Q]
[0034]其中I。和I分别代表不加化合物(配合物)和加化合物(配合物)时的荧光强度；[Q]表示化合物(配合物)的浓度；KSV为动态粹灭常数；&为动态粹灭速率常数;τ 0为无猝灭剂是荧光分子的平均寿命(ΙΟΛ—1)。以IcZI对[Q]作图，斜率即为Ksv。各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0X IOltlL.moF1.s'通过Ksv =Kq τ。,求得 Kp
[0035]在静态猝灭过程中，假设在生物大分子上有两到三个相似又彼此独立的结合位点，则荧光强度与猝灭剂之间的关系可表示为公式:
[0036]nQ+B — Qn...B
[0037]其中B表示发荧光的生物大分子，Q是猝灭剂分子，Qn...B表示生成的无荧光强度的生物分子，其生成常数可表示为:
[0038]K = [Qn...B]/[Q]n[B]
[0039]如果生物大分子的总浓度为Btl,则[Btl] = [Qn...B] + [B]，[B]表示未结合的生物大分子的浓度，则荧光强度和未结合的生物大分子的浓度的关系为[BVtBci] = F/F0, Ftl和F分别表示未加猝灭剂和加入猝灭剂时`生物大分子的荧光强度。从以上关系中可推出公式:
[0040]log [ (F0-F) /F] = logK+nlog[Q]
[0041]其中K表示猝灭剂和生物大分子的结合常数，η表示猝灭剂和生物大分子的结合位点数，以log[(Ftl-FVF]对log[Q]作图，斜率即为n，由截据求得结合常数K。
[0042](3)本发明化合物的体外细胞毒试验使用SRB检测法，测定了加入上述合成的化合物后，培养基在515nm处的OD读数，由测得的OD值，通过如下公式计算待测样品对人肝癌细胞株(SMMC-7721)、肺腺癌细胞株(A549)细胞、人急性早幼粒白血病(HL-60)和正常小鼠角质细胞(Pam212)的抑制率:
[0043]
抑制率(%) = fl 一加药组本底对照,卻|)χ!00
1) { 正常组OD值-本底对照组αο值」
[0044]以被测样品浓度对抑制率做线性回归，求出其48h内的半数抑制浓度(IC5(I)。以顺钼作为阳性对照。
[0045]该发明的有益效果在于:本发明提供了一种具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物的合成方法，并进行了药理学分析，证明该化合物的具抗癌活性作用，适合在抗癌领域中推广应用，且找到了一种新的药物合成方法，具有一定的医学价值，为抗癌药物的开发、推广提供了一定依据。
【专利附图】
【附图说明】[0046]图1是本发明实施例1中所合成的昆布氨酸缩丙醛希夫碱结构式。
[0047]图2是本发明实施例2中所合成的双昆布氨酸缩乙二醛希夫碱结构式。
[0048]图3是本发明实施例3中所合成的昆布氨酸缩3，5- 二溴水杨醛希夫碱结构式。
[0049]图4是本发明实施例4中所合成的昆布氨酸缩2-羟基-1-萘醛希夫碱结构式。
[0050]图5是本发明实施例5中所合成的昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱结构式。
【具体实施方式】
[0051]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】进行描述，以便更好的理解本发明。
[0052]实施例1:
[0053]昆布氨酸缩丙醛希夫碱的合成:
[0054]将40mmol (2.88g)丙醒用IOmL无水乙醇稀释,缓慢滴加到溶解有40mmol (7.56g)昆布氨酸的40mL乙醇溶液中。滴加完毕后温度缓慢升至70°C，继续反应4小时。蒸发溶液至余下约5mL，加入冰乙醇20mL，有大量沉淀生成。将溶液过滤，分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得白色目标产物。图1是本发明实施例1中所合成的昆布氨酸缩丙醛希夫碱结构式。
[0055]室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，在水中溶解性良好。IR峰位及兀素微 量分析结果见表1和表2。
[0056]表1:实施例1目标物IR峰位
【权利要求】
1.一种具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物，其特征在于:所述昆布氨酸缩丙醛希夫碱的合成方法为:将40mmol (2.88g)丙醛用IOmL无水乙醇稀释，缓慢滴加到溶解有40mmol (7.56g)昆布氨酸的40mL乙醇溶液中；滴加完毕后温度缓慢升至70°C，继续反应4小时；蒸发溶液至余下约5mL，加入冰乙醇20mL，有大量沉淀生成；将溶液过滤，分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得白色目标产物；室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，在水中溶解性良好。
2.根据权利要求1所述的具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物，其特征在于:所述双昆布氨酸缩乙二醛希夫碱的合成方法为:将40mmol (2.32g)乙二醛用IOmL无水乙醇稀释，缓慢滴加到溶解有80mmOl(15.12g)昆布氨酸的40mL乙醇溶液中；滴加完毕后温度缓慢升至70°C,继续反应4小时；蒸发溶液至余下约IOmL,加入冰乙醇20mL,有大量沉淀生成；将溶液过滤，分别用冰乙醇、乙醚洗涤多次，真空干燥，得微黄色目标产物；室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，在水中溶解性良好。
3.根据权利要求1所述的具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物，其特征在于:所述昆布氨酸缩3，5- 二溴水杨醛希夫碱的合成方法为:按权I所示方法合成，将方法中的丙醛用3，5-二溴水杨醛代替，获得预期产物；室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，在水中溶解性良好。
4.根据权利要求1所述的具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物，其特征在于:所述昆布氨酸缩2-羟基-1-萘醛希夫碱的合成方法为:按权I所示方法合成，将方法中的丙醛用2-羟基-1-萘醛代替，获得预期产物；室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，易溶于水。
5.根据权利要求1所述的具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物，其特征在于:所述昆布氨酸缩2-吡啶甲醛希夫碱的合成方法为:按权I所示方法合成，将方法中的丙醛用2-吡啶甲醛代替，获得预期产物；室温下目标产物很稳定，难溶于四氯化碳、氯仿和苯，微溶于甲醇、乙醇，易溶于水。
6.根据权利要求1至5所述的具抗癌活性的昆布氨酸希夫碱及其药物组合物，其特征在于:针对上述化合物进行药理学分析研究，具体包括: (I)化合物与DNA相互作用的研究: 上述化合物与DNA相互作用能力研究，应用鲱鱼鱼精DNA(HS-DNA)作为研究对象；鲱鱼鱼精DNA (HS-DNA)用NaCl/Tris-HCl (pH = 7.16)缓冲溶液配制成KT4M的溶液，测量260nm和280nm处的吸光度(A)，A260/A280在1.8~1.9的范围内，说明HS-DNA溶液符合实验要求；测量HS-DNA在260nm处的吸光度，根据朗姆-比尔定律计算DNA的浓度(以DNA碱基对的摩尔浓度计，ε 260 = 6600L.moF1.cnT1)； 紫外吸收光谱滴定:化合物用NaCl/Tris-HCl缓冲溶液配成10-3Μ的溶液，然后稀释到10_5M的浓度；以NaCl/Tris-HCl缓冲溶液作为空白对照液，测定200~800nm波长范围内的紫外光谱；每次加样，分别向空白和配体样品中加入等量配制好的HS-DNA溶液(10_3M)，充分混合然后静止IOmin后再进行扫描；键合常数由以下公式确定:
[DNA] / ( ε a- ε f) = [DNA] / ( ε a- ε f) +1/Kb ( ε a- ε f) 其中[DNA]代表DNA的浓度，ε a，ε f和ε b分别代表在各DNA浓度下的、游离的和与DNA键合饱和的配体的摩尔吸光系数；以[DNA]/( ε a- ε f)对[DNA]作图，键合常数Kb为直线的斜率和截距之比； 荧光猝灭光谱滴定=EB-DNA复合体系的配制:将5yL EB (I X IO^mol.L—1)溶液加入到ImL HS-DNA(IO-3M)溶液中置于IOmL比色管中，常温下避光保存2h ;然后加入NaCl/Tris-HCl缓冲溶液稀释至5mL，混合均匀后；以522nm的波长激发，记录EB-DNA复合体系在584nm处的荧光发射波长及强度；每次加样，向样品中加入等量配制好的配体样品溶液(I(T3M)，记录不同浓度配体对EB-DNA复合体系的荧光猝灭光谱；猝灭系数由Stern-Volmer公式确定:
10/I = 1+KSV[Q] 其中Itl和I分别代表不加化合物和加化合物时EB-DNA复合体系的的荧光强度；[Q]表示猝灭剂(化合物)的浓度；以1/I对[Q]作图，斜率即为猝灭常数Ksv ； (2)化合物与BSA相互作用的研究: 上述化合物与蛋白相互作用能力研究，应用牛血清白蛋白(BSA)作为研究对象；紫外吸收光谱滴定:将配制好的BSA储备液(100 μ Μ)稀释到10 μ Μ，以NaCl/Tris-HCl缓冲溶液作为空白对照，测定200~350nm波长范围内的紫外光谱，每次加样分别向空白和BSA样品中加入等量配制好的化合物溶液(10_3M)，充分混合然后静止IOmin后再进行扫描； 色氨酸荧光猝灭光谱滴定:将配制好的BSA储备液(100 μ Μ)稀释到10 μ Μ，以295nm的波长激发，记录BSA溶液在584nm处的荧光发射波长及强度；每次加样，向样品中加入等量配制好的化合物样品溶液(IO-3M)，记录不同浓度化合物对BSA溶液的荧光猝灭光谱；猝灭系数由Stern-Volmer公式确定:
10/1 = 1+KSV[Q] = l+Kqx0[Q] 其中I。和I分别代表不加化合物(配合物)和加化合物(配合物)时的荧光强度；[Q]表示化合物(配合物)的浓度；KSV为动态粹灭常数；&为动态粹灭速率常数；τ ^为无粹灭剂是荧光分子的平均寿命(KT8s-1);以IcZI对[Q]作图，斜率即为Ksv ;各类荧光猝灭剂对生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数约为2.0X 1OltlL mol_1.s_1 ;通过Ksv = K, τ ^，求得Kq ； 在静态猝灭过程中，假设在生物大分子上有两到三个相似又彼此独立的结合位点，则荧光强度与猝灭剂之间的关系可表示为公式:nQ+B — Qn...B 其中B表示发荧光的生物大分子，Q是猝灭剂分子，Qn...B表示生成的无荧光强度的生物分子，其生成常数可表示为:
K = [Qn...B]/[Q]n [B] 如果生物大分子的总浓度为Btl，则[Btl] = [Qn...B] + [B],[B]表示未结合的生物大分子的浓度，则荧光强度和未结合的生物大分子的浓度的关系为[BVtBci] = F/F0, Ftl和F分别表示未加猝灭剂和加入猝灭剂时生物大分子的荧光强度；从以上关系中可推出公式:1gt(F0-F) /F] = logK+nlog[Q] 其中K表示猝灭剂和生物大分子的结合常数，η表示猝灭剂和生物大分子的结合位点数，以log [(Ftl-FVF]对log[Q]作图，斜率即为n，由截据求得结合常数K; (3)上述化合物的体外细胞毒试验使用SRB检测法，测定了加入上述合成的化合物后，培养基在515nm处的OD读数， 由测得的OD值，通过如下公式计算待测样品对人肝癌细胞株(SMMC-7721)、肺腺癌细胞株(A549)细胞、人急性早幼粒白血病(HL-60)和正常小鼠角质细胞(Pam212)的抑制率:
【文档编号】C07C251/24GK103694133SQ201310698464
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】李群, 李晓雯, 赵昔慧, 王越, 倪偲, 李子超 申请人:青岛大学