专利名称：具有靶向抗血栓活性的rgdfyigsk、制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有靶向抗血栓活性的多肽RGDFYIGSK。本发明还涉及它的制备方法以及它作为抗血栓剂的应用，属于生物医药领域。
背景技术：
细胞黏附在细胞黏附性疾病(癌转移、血栓形成、化学致炎和骨质疏松)的发展过程中起关键作用。调节性糖蛋白例如昆布氨酸、纤维蛋白原、RGD肽、YIGSR和YIGSK等都可 以参与细胞黏附过程。它们与整合素受体有很强的结合能力。例如在血小板聚集过程中，RGDF与活化的血小板表面受体GP Ilb/IIIa结合起至关重要的作用。RGDF与活化的血小板表面受体GP Ilb/IIIa的特异性结合，赋予了 RGDF—种重要性质，即含RGDF可以向血小板活化的部位富集。在这样一个前提下，把RGDF与抗细胞黏附的YIGSK缀合，便可以获得靶向抗细胞黏附多肽。
发明内容
本发明的目的之一是对RGDF与HGSK进行缀合，制备得到具有靶向抗血栓活性的多肽。本发明的目的之二是提供一种制备抗血栓活性的RGDFYIGSK的方法。该方法包括I.采用液相合成方法，通过逐步接肽分别合成RGDF和YIGSK的保护中间体；2.脱去RGDF保护中间体的C端保护基；3.脱去YIGSK保护中间体的N端保护基；4.把C端游离的RGDF保护中间体和N端游离的HGSK保护中间体缀合，再脱去保护基得到RGDFYIGSK。其中，所述的N端保护基是对多肽的N端进行保护时所常用的保护基团，例如可以是叔丁氧羰基(Boc);所述的C端保护基是对多肽的C端进行保护时所常用的保护基团，例如可以是苄氧基(OBzl)，甲氧基(OMe)等。以上所述的液相合成中间体并加以保护的方法是本领域的常规并公知的技术。动物模型试验证明，本发明的RGDFYIGSK具有较强的抗血栓活性。为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。本发明中所出现的缩略语的说明THF四氢呋喃DCC二环己基酰亚胺
DCU二环己基脲OBzl苄氧基Boc叔丁氧羰基OMe甲氧基HOBtN-羟基苯并三唑NMMN-甲基吗啉
具体实施方式
实施例I HCl · Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl) -Lys (Z) -OBzl 的制备I) Boc-Ser (Bzl)-Lys (Z)-OBzl 的制备将O. 59g(2. Ommol)Boc-Ser (Bzl)溶解在 6ml 无水 THF 中，O °C 下加入O. 27g(2. Ommol) N-羟基苯并三唑(HOBt)和 O. 45g(2. 2mmol) 二环己基羰二亚胺(DCC)。搅拌10分钟后加入I. 084g(2. OmmoDTos · Lys(Z)-OBzl的无水THF溶液。反应混合物用N-甲基吗啉(NMM)调节pH 8-9，(TC搅拌24小时。停止反应，过滤除去沉淀出的二环己基脲(DCU)。滤液减压浓缩，残留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、5%KHSO4水溶液和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水NaSO4干燥3小时。滤除NaSO4,滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。残留物用柱层析分离(CHCl3 CH3OH, 30 I)，得到I. 216g(94% )目标化合物。ESI-MS (m/z) 648 [M+H] +。2) HCl · Ser (Bzl)-Lys(Z) -OBzl 的制备将O. 648g(l. Ommol)Boc-Set (Bzl) -Lys (Z) -OBzl 溶解在 IOml 氯化氢-乙酸乙酯(6mol/l)溶液中，室温搅拌2小时，TLC检测原料点消失，减压抽去乙酸乙酯，反复加少量乙醚进行减压抽气以除去产品中的酸气。最后加少量乙醚将产品研磨成固体粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS (m/z) 548 [M+H] +。3) Boc-Ile-Gly-OMe 的制备将O. 498g(2. Ommol)Boc-Ile · H2O 溶解在 5mL 无水 THF 中，O °C 下力卩入O. 27g(2. OmmoDHOBt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。搅拌 10 分钟后加入 O. 251g(2. Ommol)HCl -Gly-OMe的无水THF溶液。反应混合物用NMM调节pH 8_9，0°C搅拌24小时。停止反应，过滤除去沉淀出的DCU。滤液碱压浓缩，残留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水NaSO4干燥3小时。滤除NaSO4，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。残留物用柱层析分离(CHCl3 CH3OH,60 I)。得到 O. 567g(94% )目标化合物。ESI-MS (m/z) 303 [M+H]+。4) HCl · Ile-Gly-OMe 的制备将O. 567g(l. 87mmol)Boc-Ile-Gly-OMe 溶解在 15ml 氯化氢 _ 乙酸乙酯溶液(6mo I/1)中，室温搅拌2小时，TLC检测原料点消失，减压抽去乙酸乙酯，反复加少量乙醚进行减压抽气以除去产品中的酸气。最后加少量乙醚将产品研磨成固体粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS (m/z) 203 [M+H]+。5) Boc-Tyr-Ile-Gly-OMe 的制备将O. 525g(l. 87mmol)Boc-Tyr 溶解在 5ml 无水 THF 中，O °C 下加入O. 270g(2. OmmoDHOBt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。搅拌 10 分钟后，加入 O. 377g(l. 87mmol)HCl · Ile-Gly-OMe的无水THF溶液。反应混合物用NMM调节pH 8-9，(TC搅拌24小时。停止反应，过滤除去沉淀出的DCU。滤液减压浓缩，残留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、5 % KHSO4水溶液和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水NaSO4干燥3小时。滤除NaSO4，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。残留物用柱层析分离(CHCl3 CH3OH,60 I)。得到 O. 808g(93% )目标化合物。ESI-MS (m/z) 466 [M+H]+。6)Boc-Tyr-Ile-Gly 的制备将O. 808g(l. 87mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly-OMe 溶解在 IOml 甲醇中，(TC下加入 NaOH水溶液(1.5mol/l)，调节pH值到11，搅拌反应O. 5h，TLC检测反应结束。加饱和KHS04调节pH值到6 7，滤除析出的盐，滤液减压蒸馏除去全部甲醇，残留水溶液继续用KHSO4调节PH值到2，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯层合并，用饱和NaCl萃洗三次，无水NaSO4干燥3小时，过滤，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯，得到0.834g(99% )目标化合物 。ESI-MS(m/ζ)450[Μ-ΗΓ。7) Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl) -Lys (Z) -OBzl 的制备将O. 857g(l. 9mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly 溶解在 5ml 无水 THF 中，O °C 下加入O. 257g(l. 9mmol)H0Bt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。搅拌 10 分钟后，加入 I. 039g(l. 9mmol)HCl · Ser (Bzl)-Lys(Z) -OBzl的无水THF溶液。反应混合物用NMM调节pH 8-9，(TC搅拌24小时。停止反应，过滤除去沉淀出的DCU。滤液减压浓缩，残留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水NaSO4干燥3小时。滤除NaSO4,滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。残留物用柱层析分离(CHCl3 CH3OH, 30 I)。得到 1.71g(92%)目标化合物。ESI-MS (m/z) 981 [M+H]+。8) HCl · Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl)-Lys (Z)-OBzl 的制备将O. 98g(I. Ommol)Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl)-Lys (Z)-OBzl 溶解在 20ml 氯化氢-乙酸乙酯溶液(6mol/l)中，室温搅拌2小时，TLC检测原料点消失，减压抽去乙酸乙酯，反复加少量乙醚进行减压抽气以除去产品中的酸气。最后加少量乙醚将产品研磨成固体粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS (m/z) 881 [M+H] +。实施例2 Boc-Arg (Tos)-Gly-Asp (OMe)-Phe 的制备I) Boc-Asp (OMe)-Phe-OBzl 的制备将O. 494g(2. Ommol)Boc-Asp (OMe)溶解在 5ml 无水 THF 中，O °C 下加入O. 27g(2. OmmoDHOBt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。搅拌 10 分钟后，加入 O. 854g(2. Ommol)Tos · Phe-OBzl的无水THF溶液。反应混合物用NMM调节pH 8_9，0°C搅拌24小时。停止反应，过滤除去沉淀出的DCU。滤液减压浓缩，残留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、5 % KHSO4水溶液和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水NaSO4干燥3小时。滤除NaSO4，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。残留物用柱层析分离(CHCl3 CH3OH,30 I)。得到 0.96g(99%)目标化合物。ESI-MS (m/z) 485 [M+H]+。2) HCl · Asp (OMe) -Phe-OBzl 的制备将O. 960g (I. 98mmol) Boc-Asp (OMe)-Phe-OBzl 溶解在 IOml 氯化氢-乙酸乙酯溶液(6mol/l)中，室温搅拌2小时，TLC检测原料点消失，减压抽去乙酸乙酯，反复加少量乙醚进行减压抽气以除去产品中的酸气。最后加少量乙醚将产品研磨成固体粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS (m/z) 385 [M+H] +。
3) Boc-Arg (Tos) -Gly-OMe 的制备将O. 856g(2. Ommol)Boc-Arg(Tos)溶解在 5ml 无水 DMF 中，O °C 下加入O. 27g(2. OmmoDHOBt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。搅拌 10 分钟后，加入 O. 251g(2. Ommol)HCl ·Gly-OMe的无水DMF溶液。反应混合物用NMM调节pH 8_9，(TC搅拌24小时。停止反应，过滤除去沉淀出的DCU。滤液减压浓缩，残留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水NaSO4干燥3小时。滤除NaSO4，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。残留物用柱层析分离(CHCl3 CH3OH,30 I)。得到 0.96g(96%)目标化合物。ESI-MS (m/z) 500 [M+H]+。4) Boc-Arg (Tos)-Gly 的制备将O. 960g(I. 9mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-OMe 溶解在 IOml 甲醇中，O °C 下加入的NaOH水溶液(1.5mol/l)调节pH值到11，搅拌反应O. 5h，TLC检测反应结束。加饱和KHSO4调节PH值到6 7，滤除析出的盐，滤液减压蒸馏除去全部甲醇，残留水溶液继续用1(肥04调节PH值到2，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯层合并，用饱和NaCl萃洗三次，无水NaSO4干燥3小时，过滤，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯，得到0.903g(98% )目标化合物。ESI-MS(m/·ζ)484[Μ-ΗΓ。5) Boc-Arg (Tos) -Gly-Asp (OMe) -Phe-O Bzl 的制备将O. 903g (I. 86mmol) Boc-Arg (Tos) -Gly 溶解在 5ml 无水 THF 中，0 °C 下加入O. 252g(l. 86mmol)H0Bt 和 O. 428g(2. 08mmol)DCC。搅拌 10 分钟后，加入 0. 784g(l. 86mmol)HCl *Asp (OMe)-Phe-OBzl的无水THF溶液。反应混合物用NMM调节pH 8-9，(TC搅拌24小时。停止反应，过滤除去沉淀出的DCU。滤液减压浓缩，残留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用饱和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水NaSO4干燥3小时。滤除NaSO4，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。残留物用柱层析分离(CHCl3 CH3OH,30 I)。得到 1.47g(93%)目标化合物。ESI-MS (m/z) 852 [M+H]+。6) Boc-Arg (Tos)-Gly-Asp (OMe)-Phe 的制备将O. 852g (I. Ommol) Boc-Arg (Tos) -Gly-Asp (OMe) -Phe-OBzl 溶解在 IOml 甲醇中，(TC下加入NaOH水溶液(I. 5mol/l)调节pH值到11，搅拌反应O. 5h，TLC检测反应结束。加饱和KHSO4调节pH值到6 7，滤除析出的盐，滤液减压蒸馏除去全部甲醇，残留水溶液继续用KHSO4调节pH值到2，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯层合并，用饱和NaCl萃洗三次，无水NaSO4干燥3小时，过滤，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯，得到O. 731g(96% )目标化合物。ESI-MS (ι /ζ)760[Μ-ΗΓ。实施例3 RGDFYIGSK的制备I)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Phe-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lyz(Z)-OBzl 的制备将O. 762g(I. Ommol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Phe 溶解在 5ml 无水 THF中，O °C 下加入 O. 135g(l. OmmoDHOBt 和 O. 23g(l. 09mmol)DCC。搅拌 10 分钟后，加入O. 916g(l. OmmoDHCl Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl) -Lys (Z) -OBzl 的无水 THF 溶液。反应混合物用NMM调节pH8-9，(TC搅拌24小时。停止反应，过滤除去沉淀出的DCU。滤液减压浓缩，残留物溶于乙酸乙酯中，得到的溶液依次用饱和NaHCOjK溶液、5% KHSO4水溶液和饱和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯层用无水NaSO4干燥3小时。滤除NaSO4，滤液减压浓缩除去乙酸乙酯。残留物用柱层析分离(CHCl3 CH3OH, 30 I)。得到 I. 46g(90% )目标化合物。1HNMR(BHSC-300，CDCl3-d3) δ = 7. 85 (d, J = 5. OHz, 10H) ,7. 87 (d, J = 7. 0Hz,2H) ,7. 34 (d, J = 7. OHz,2H)，7· 19(m，20H)，6· 95 (d, J = 7. 0Ηζ，2Η)，6· 65 (d, J = 7. ΟΗζ，2Η)，5· 7 (s，1Η)，5· 34 (S，4Η)，5· 17 (q, J = 6. 0Hz, 1Η)，5· 0(s，1Η)，4· 92 (q, J = 6. 0Ηζ，3Η)，4· 63(s，2H)，4· 52 (t, J=6. 0Ηζ，3Η)，4· 09 (d, J = 6. 0Ηζ，4Η)，3· 87 (d, J = 5. 0Ηζ，2Η)，3· 67(s，3H)，3· 05 (d. J =
6.0Ηζ,4Η)，2· 96(q, J = 6. ΟΗζ, 2Η), 2. 7 (d, J = 7. ΟΗζ, 4Η), 2. 5 (m, 1Η)，2· 35 (s, 3Η), 2. O (s,2Η)，I. 7-1. 9(q, J = 7. 0Ηζ，4Η)，I. 4(s，9H)，I. 45-1. 6 (m，4Η)，O. 8-1. 3(m, J = 8. ΟΗζ, IOH)。ESI-MS (m/z) 1624 [M+H]+。元素分析 C82Hltl5N13O2OS 理论值 C 60. 61, H, 6. 51, N 11. 21.实测值 C 60. 80，H 6. 67，N 11. 38。2) RGDFYIGSK 的制备
将200mg(0. 123mmol) Boc-Arg (Tos)-Gly-Asp (OMe)-Phe-Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl)-Lys(Z)-OBzl溶于4mL三氟醋酸中，加入ImL三氟甲磺酸和ImL苯甲醚，(TC下搅拌反应I小时，减压抽气5分钟，一次性加入IOOmL乙醚，析出的产品固体粉末使用S^hadex G 10进行提纯，得到产品 114mg (89% ). 1HNMR (BHSC-300, CDCl3-d3) δ = 11. O (s，2Η)，7· 80 (d，J = 5. 0Ηζ,8Η),7. 21(d, J = 7·0Ηζ，2Η)，7· 12 (m，2Η) · 7· 08 (t，J = 7. ΟΗζ, 1Η) ,6. 95 (d, J=7. 0Ηζ,2Η) ,6. 68 (d, J = 7. 0Hz, 2Η)，5· 7 (s, 1Η)，5· 0(s, 1Η) ,4. 92 (q, J = 6. 0Ηζ,2Η)，4. 86 (q, J = 6. 0Hz, 1Η)，4· 62 (s，1Η)，4· 50 (t, J = 6. 0Ηζ，2Η)，4· 09 (d, J = 6. 0Ηζ，4Η)，4. 03 (d, J = 7. 0Ηζ，2Η)，3· 56 (m, 1Η), 3. 05 (d, J = 6. 0Ηζ，4Η)，2· 73 (t, J = 6. 0Ηζ，2Η)，
2.65 (q, J = 6. ΟΗζ, 4Η), 2. 5 (m, 1Η), 2. O (s, 8Η), I. 79 (q, J = 7· 0Hz，4Η)，I. 55 (m，4Η)，O. 8-1. 3 (m, J = 8. OHz，10Η)。ESI-MS (m/z) 1042 [M+H] +。元素分析 C47H71N13O14 理论值 C
54.17，H 6. 87，N 17. 47.实测值 C 60. 80，H 6. 67，N 11. 38。试验例I RGDFYIGSK的抗血栓活性试验I)大鼠手术与器械SD大鼠(雄性，220 230g)按1200mg -kg^1剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，准备在远心端插管。2)插管插管为硅烷化过的聚乙烯胶管，分三段，中段为聚乙烯胶管，长60. 0mm，内径
3.5mm ;两端为相同的聚乙烯管,管长100. Omm,内径I. Omm,外径2. Omm该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为I. Omm0将编好号的干净青霉素小瓶中分别装入6cm长的黑色手术线，称重；然后取出丝线，按照编号放入准备好的插管的中段较粗的插管中。打开大鼠右侧动脉夹，用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU · kg—1)，然后将插管的动脉端插入大鼠右侧颈总动脉，将计算量的肝素缓缓注入大鼠体内。3)给药药品生理盐水(3ml · kg-1)、阿斯匹林(剂量为30mg/kg)的生理盐水溶液、RGDFYIGSK的(剂量为ΙΟμπιοΙ/kg)的生理盐水溶液。夹闭大鼠右侧颈动脉夹，拔下插管静脉端的注射器，将吸有计算量的药品水溶的药液注射器插入插管的静脉端，打开大鼠右侧颈动脉夹，将药品缓缓推入大鼠体内。夹闭右侧颈动脉夹，将茶馆的静脉端插入分离好的大鼠左侧颈静脉，打开动脉夹，使血液开始循环。并同时开始计时。此过程中插管中央的粗管中的丝线上会因为血液循环而产生血栓。4)血栓称重计时开始15分钟后，剪断动静脉插管，停止循环，用眼科镊小心取出丝线，在滤纸上轻轻蘸掉血滴，放入事先称重好的青霉素小瓶中，精确称重并记录。计算出血栓的湿重。每个药品重复11次给药。统计各组的血栓湿重(X 士 SD)，并做t检验。5)结果RGDFYIGSK具有很好的抗栓活性。结果列入表I。表1RGDFYIGSK在大鼠模型上的抗血栓活性
_药品_血检湿jS ( SD mg)
生理盐水20.97 ±3.18
阿斯匹林10.10±3.01a
RGDFYIGSK10.21 ±3.03aη = 11 ；a.与生理盐水相比，P < O. OOl0
权利要求
1.具有靶向抗血栓活性的多肽RGDFYIGSK。
2.一种制备权利要求I的RGDFYIGSK的方法，包括 (1)采用液相合成方法，通过逐步接肽分别合成RGDF的保护中间体和YIGSK的保护中间体； (2)脱去RGDF的保护中间体的C端保护基； (3)脱去HGSK的保护中间体的N端保护基； (4)把N端游离的YIGSK保护中间体和C端游离的RGDF保护中间体缀合得到RGDFYIGSK的保护中间体； (5)把RGDFYIGSK的保护中间体脱去保护基，得到RGDFYIGSK。
3.权利要求I的RGDFYIGSK在制备抗血栓药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种具有靶向抗血栓活性的多肽RGDFYIGSK，还公开了它的制备方法以及它作为抗血栓剂的应用，属于生物医药领域。本发明通过RGDF与YIGSK缀合，制备得到具有靶向抗血栓活性的多肽。动物模型试验证明，RGDFYIGSK具有较强的抗血栓活性。
文档编号A61K38/08GK102702316SQ20121010512
公开日2012年10月3日 申请日期2006年11月30日 优先权日2006年11月30日
发明者彭师奇, 王超, 赵婧华, 赵明 申请人:首都医科大学