抗-p-选择蛋白抗体制剂的制作方法

抗-p-选择蛋白抗体制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种稳定液体药物制剂，其包含40mg/ml至200mg/ml的针对P-选择蛋白的抗体；0.01％至0.1％的泊洛沙姆；5mM至00mM缓冲液；和100mM至500mM至少一种稳定剂；其pH在4.5-7.0的范围内。
【专利说明】抗-p-选择蛋白抗体制剂

【技术领域】
[0001] 本发明涉及针对P-选择蛋白的抗体分子的稳定药物液体制剂、用于制备所述制 剂的方法和所述制剂的用途。

【背景技术】
[0002] 针对P-选择蛋白的抗体具有治疗利益，特别是作为用于治疗和预防炎性的和血 栓性的病症和心血管疾病的药物。针对P-选择蛋白的抗体（⑶62P、GMP-140、PADGEM、 LECAM3)被描述在例如W0 2005/100402中。这些抗体会在粘附测定中抑制白细胞-样HL60 细胞对被固定化在微量滴定板上的经纯化的P-选择蛋白的粘附，具有〇. 08-0. 5 μ g/ml的 IC50 值。
[0003] 在W0 2010/031720中公开了呈液体形式、低压冻干形式或从低压冻干形式重构 的液体形式的抗-P-选择蛋白抗体的低浓度制剂（15mg/ml抗体）。
[0004] 抗体分子（作为蛋白药物集合中的组成部分）非常易于物理和化学降解。化学 降解包括涉及经由键形成或切割而修饰蛋白从而产生新化学实体的任何过程。已知多种 化学反应会影响蛋白。这些反应可以涉及水解，包括肽键的切割以及脱酰胺化、异构化、 氧化和分解。物理降解表示高级结构的变化，且包括变性、吸附至表面、聚集和沉淀。蛋 白稳定性受蛋白本身的特征（例如氨基酸序列、糖基化模式）和外部影响（诸如温度、溶 剂pH、赋形剂、界面或剪切速率）而影响。所以，重要的是，限定最佳制剂条件以在制备、 贮存和施用过程中保护蛋白免于降解反应（Manning，M.C.，等人（1989)，"Stability of protein pharmaceuticals(蛋白药物的稳定性）"，Pharm Res 6(ll)，903_918;Zheng， J. Y. ,Janis,L. J. (2005), uInfluence of pH, buffer species,and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298(pH、 缓冲剂种类和贮存温度对人源化单克隆抗体LA298的物理化学稳定性的影响）"，Int. J. Pharmaceutics308,46-51)。当制剂要包括高浓度的抗体时，特别难以得到治疗性抗体的 稳定液体制剂。
[0005] 因此，本发明的一个目的是，提供含有尽可能少的必要赋形剂的、高度浓缩的、 抗-P-选择蛋白抗体的稳定制剂，其能够实现期望的给药并允许将所述抗体方便地施用给 患者。
[0006] 本发明的制剂在2_8°C的预期贮存温度贮存18个月以后表现出良好稳定性，没有 形成肉眼可见的颗粒，这允许在不使用线内过滤器的情况下静脉内施用，从而实现更大的 施用便利。将摇动和多次冻融步骤施加于液体制剂以模拟在药物产品的制备或运输过程中 可能发生的物理应激条件。本发明的制剂在施加摇动和冻融应激以后表现出良好稳定性。


【发明内容】

[0007] 在一个方面，本发明涉及一种稳定液体药物制剂，其包含：
[0008] -40mg/ml至200mg/ml的针对P-选择蛋白的抗体；
[0009] -0· 01 %至0· 1 %的泊洛沙姆；
[0010] _5mM 至 100mM 缓冲液；
[0011] -100mM至500mM至少一种稳定剂；
[0012] 其pH在4. 5-7.0的范围内。
[0013] 在一个实施方案中，所述针对P-选择蛋白的抗体的浓度是在40mg/ml至100mg/ml 的范围内，特别是50mg/ml。
[0014] 在另一个实施方案中，本发明涉及这样的药物制剂，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙 姆 188。
[0015] 在另一个实施方案中，所述泊洛沙姆以在0. 01 %至0. 05%范围内、特别是0. 02% 的浓度存在。
[0016] 在一个实施方案中，本发明涉及这样的药物制剂，其中所述缓冲液是组氨酸缓冲 液，特别是组氨酸乙酸盐缓冲液。
[0017] 在另一个实施方案中，所述缓冲液具有在10_30mM范围内、特别是20mM的浓度。
[0018] 在另一个实施方案中，所述制剂的pH是在5. 0-6. 0的范围内，特别是在5. 5。
[0019] 在一个实施方案中，本发明涉及这样的药物制剂，其中至少一种稳定剂选自糖、多 元醇和氨基酸。更具体地，本发明的稳定液体制剂包含一种选自糖、多元醇和氨基酸的稳定 剂。
[0020] 在另一个实施方案中，所述至少一种稳定剂以在140_250mM范围内、特别是在 210-230mM范围内的浓度存在。
[0021] 在另一个实施方案中，所述稳定剂选自：海藻糖、蔗糖、山梨糖醇和精氨酸盐酸盐。
[0022] 在一个实施方案中，本发明涉及这样的药物制剂，其中所述针对P-选择蛋白的抗 体是人抗体或人源化抗体。
[0023] 在另一个实施方案中，所述针对P-选择蛋白的抗体包含可变区，所述可变区独立 地选自：
[0024] a)由SEQ ID N0 :2的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0 :1的氨 基酸序列限定的轻链可变结构域；
[0025] b)由SEQ ID N0 :4的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0 :3的氨 基酸序列限定的轻链可变结构域；
[0026] c)由SEQ ID N0 :6的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0 :5的氨 基酸序列限定的轻链可变结构域；
[0027] d)由SEQ ID N0 :8的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0 :7的氨 基酸序列限定的轻链可变结构域；
[0028] e)由SEQ ID N0 :10的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0 :9的氨 基酸序列限定的轻链可变结构域；
[0029] f)由SEQ ID N0 :12的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0 :11的 氨基酸序列限定的轻链可变结构域；
[0030] g)由SEQ ID N0 :14的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0 :13的 氨基酸序列限定的轻链可变结构域；
[0031] h)由SEQ ID N0 :16的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0 :15的 氨基酸序列限定的轻链可变结构域；
[0032] i)由SEQ ID N0 :18的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0 :17的 氨基酸序列限定的轻链可变结构域；
[0033] j)由SEQ ID N0 :20的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0 :19的 氨基酸序列限定的轻链可变结构域；和
[0034] k)由SEQ ID N0 :22的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0 :21的 氨基酸序列限定的轻链可变结构域。
[0035] 在另一个实施方案中，本发明涉及这样的药物制剂，其中所述针对P-选择蛋白的 抗体的重链可变结构域包含SEQ ID N0 :4的氨基酸序列，且所述针对P-的抗体的轻链可变 结构域包含SEQ ID N0 :3的氨基酸序列。
[0036] 在另一个实施方案中，本发明涉及这样的药物制剂，其中所述针对P-选择蛋白的 抗体是包含SEQ ID N0:24的重链氨基酸序列和SEQ ID N0:23的轻链氨基酸序列的人抗 体。
[0037] 本发明的另一个方面提供了一种稳定液体药物制剂，其包含：
[0038] 50mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID N0 :24的重链氨 基酸序列和SEQ ID N0 :23的轻链氨基酸序列；和
[0039] (i)0. 02 % 的泊洛沙姆 188，
[0040] 230mM海藻糖，和
[0041] ρΗ5· 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0042] (ii)0. 02% 的泊洛沙姆 188，
[0043] 210mM 蔗糖，和
[0044] ρΗ5· 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0045] (iii)0. 02% 的泊洛沙姆 188，
[0046] 145mM精氨酸盐酸盐，和
[0047] ρΗ5· 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0048] (iv) 0· 02% 的泊洛沙姆 188，
[0049] 23〇mM山梨糖醇，和
[0050] pH5. 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液。
[0051] 在另一个实施方案中，本发明涉及这样的稳定液体药物制剂，其中甲硫氨酸作为 第二种稳定剂存在，特别是以5-25mM的浓度。
[0052] 例如，这样的制剂可以包含：
[0053] 50mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID N0 :24的重链氨 基酸序列和SEQ ID N0 :23的轻链氨基酸序列；和
[0054] (v) 0· 02% 的泊洛沙姆 188，
[0055] 230mM 海藻糖，
[0056] 10mM甲硫氨酸，和
[0057] ρΗ5· 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0058] (￥丨）0.02%的泊洛沙姆188，
[0059] 210mM 蔗糖，
[0060] lOmM甲硫氨酸，和
[0061] pH5. 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0062] (vii)O. 02% 的泊洛沙姆 188，
[0063] 145mM精氨酸盐酸盐，
[0064] 10mM甲硫氨酸，和
[0065] pH 5. 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0066] (viii)O. 02% 的泊洛沙姆 188，
[0067] 230mM山梨糖醇，
[0068] 10mM甲硫氨酸，和
[0069] pH5. 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液。
[0070] 在另一个方面，本发明提供了一种稳定液体药物制剂，其包含：
[0071] (a) 40mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID N0 :24的重链 氨基酸序列和SEQ ID N0 :23的轻链氨基酸序列，
[0072] 0· 01 %的泊洛沙姆188，
[0073] 210mM 蔗糖，和
[0074] ρΗ5· 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0075] (b) 60mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID N0 :24的重链 氨基酸序列和SEQ ID N0 :23的轻链氨基酸序列，
[0076] 0· 01 %的泊洛沙姆188，
[0077] 210mM 蔗糖，和
[0078] ρΗ5· 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0079] (c) 40mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID N0 :24的重链 氨基酸序列和SEQ ID N0 :23的轻链，
[0080] 0· 03%的泊洛沙姆188，
[0081] 210mM 蔗糖，和
[0082] ρΗ5· 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0083] (d) 60mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID N0 :24的重链 氨基酸序列和SEQ ID N0 :23的轻链氨基酸序列，
[0084] 0· 03%的泊洛沙姆188，
[0085] 210mM 蔗糖，和
[0086] ρΗ5· 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0087] (e) 40mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID N0 :24的重链 氨基酸序列和SEQ ID N0 :23的轻链氨基酸序列，
[0088] 0· 01 %的泊洛沙姆188，
[0089] 210mM 蔗糖，和
[0090] pH6. 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0091] (f) 60mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID N0 :24的重链 氨基酸序列和SEQ ID N0 :23的轻链氨基酸序列，
[0092] 0· 01 %的泊洛沙姆188，
[0093] 210mM 蔗糖，和
[0094] pH6. 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0095] (g) 40mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID N0 :24的重链 氨基酸序列和SEQ ID N0 :23的轻链氨基酸序列，
[0096] 0· 03%的泊洛沙姆188，
[0097] 210mM 蔗糖，和
[0098] ρΗ6· 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0099] (h) 60mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID N0 :24的重链 氨基酸序列和SEQ ID N0 :23的轻链氨基酸序列，
[0100] 0· 03%的泊洛沙姆188，
[0101] 210mM 蔗糖，和
[0102] pH6. 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者
[0103] (i) 50mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID N0 :24的重链 氨基酸序列和SEQ ID N0 :23的轻链氨基酸序列，
[0104] 0· 02%的泊洛沙姆188，
[0105] 210mM 蔗糖，和
[0106] ρΗ5· 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液。
[0107] 在本发明的另一个方面，提供了用于预防或治疗炎性疾病和血栓性疾病以及由 炎性过程和/或血栓性过程驱动的血管疾病病状的稳定液体药物制剂。这样的疾病包括 具有基础性动脉粥样化血栓形成（atherothrombosis)和血管狭窄的血管疾病，诸如冠 状动脉疾病（coronary artery disease, CAD)、急性冠状动脉综合征（acute coronary syndrome，ACS)、周围动脉疾病（peripheral arterial disease，PAD)、周围动脉闭塞性 疾病（peripheral arterial occlusive disease，PA0D)、重症肢体缺血（critical limb ischemia，CLI)、冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting，CABG)后狭窄、 冠状静脉移植物疾病（coronary vein graft disease)、经皮冠状动脉介入（percutaneous coronary intervention，PCI)后再狭窄、透析分流狭窄（dialysis shunt stenosis)、透 析分流阻塞（dialysis shunt occlusion)以及动脉和深静脉血栓形成和血栓性血小板减 少性紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura, TPP)。其它应用是预防和治疗由心 肌梗死（myocardial infarction)、脑缺血事件（例如卒中）、肾梗死、急性肾损伤、器官移 植排斥和急性白细胞介导的肺损伤造成的缺血后组织损伤。针对P-选择蛋白的抗体的 稳定液体药物制剂也适合用于治疗脓毒性休克（septic shock)、变应性病症（allergic conditions)、哮喘（asthma)、慢性阻塞性月市疾病（chronic obstructive pulmonary disease，C0PD)、移植血管病变（transplant vasculopathy)、急性膜腺炎（acute pancreatitis)、炎性肠病（inflammatory bowel disease)、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis)、特应性皮炎（atopic dermatitis)、银屑病（psoriasis)、镰状细胞病（sickle cell disease)和预防肿瘤转移（tumor metastasis)。
[0108] 更具体地，针对p-选择蛋白的抗体的稳定液体药物制剂被用于预防或治疗急性 冠状动脉综合征（ACS)、冠状动脉旁路移植术（CABG)后狭窄、冠状静脉移植物疾病、经皮冠 状动脉介入（PCI)诸如血管成形术或支架放置后再狭窄、周围动脉疾病（PAD)、周围动脉闭 塞性疾病（PAOD)和重症肢体缺血（CLI)。
[0109] 本发明的另一个方面是，所述稳定液体药物制剂用于制备药物的用途，所述药物 用于预防或治疗炎性疾病和血栓性疾病以及由炎性过程和/或血栓性过程驱动的血管疾 病病状。这样的疾病包括具有基础性动脉粥样化血栓形成和血管狭窄的血管疾病，诸如冠 状动脉疾病（CAD)、急性冠状动脉综合征（ACS)、周围动脉疾病（PAD)、周围动脉闭塞性疾病 (PA0D)、重症肢体缺血（CLI)、冠状动脉旁路移植术（CABG)后狭窄、冠状静脉移植物疾病、 经皮冠状动脉介入（PCI)后再狭窄、透析分流狭窄、透析分流阻塞以及动脉和深静脉血栓 形成和血栓性血小板减少性紫癜（TPP)，所述药物用于预防和治疗由心肌梗死、脑缺血事件 (例如卒中）、肾梗死、急性肾损伤、器官移植排斥和急性白细胞介导的肺损伤造成的缺血 后组织损伤，所述药物用于治疗脓毒性休克、变应性病症、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（C0PD)、 移植血管病变、急性胰腺炎、炎性肠病、类风湿性关节炎、特应性皮炎、银屑病、镰状细胞病 和预防肿瘤转移。
[0110] 更具体地，本发明涉及针对P-选择蛋白的抗体的稳定液体药物制剂用于制备 药物的用途，所述药物用于预防或治疗急性冠状动脉综合征（ACS)、冠状动脉旁路移植术 (CABG)后狭窄、冠状静脉移植物疾病、经皮冠状动脉介入（PCI)诸如血管成形术或支架放 置后再狭窄、周围动脉疾病（PAD)、周围动脉闭塞性疾病（PA0D)和重症肢体缺血（CLI)。
[0111] 本发明的另一个方面是，一种方法，其用于预防或治疗炎性疾病和血栓性疾病以 及由炎性过程和/或血栓性过程驱动的血管疾病病状，特别是用于预防或治疗具有基础性 动脉粥样化血栓形成和血管狭窄的血管疾病，诸如冠状动脉疾病（CAD)、急性冠状动脉综合 征（ACS)、周围动脉疾病（PAD)、周围动脉闭塞性疾病（PA0D)、重症肢体缺血（CLI)、冠状动 脉旁路移植术（CABG)后狭窄、冠状静脉移植物疾病、经皮冠状动脉介入（PCI)后再狭窄、透 析分流狭窄、透析分流阻塞以及动脉和深静脉血栓形成和血栓性血小板减少性紫癜（TPP)， 用于预防和治疗由心肌梗死、脑缺血事件（例如卒中）、肾梗死、急性肾损伤、器官移植排斥 和急性白细胞介导的肺损伤造成的缺血后组织损伤，用于治疗脓毒性休克、变应性病症、哮 喘、慢性阻塞性肺疾病（C0PD)、移植血管病变、急性胰腺炎、炎性肠病、类风湿性关节炎、特 应性皮炎、银屑病、镰状细胞病和预防肿瘤转移，所述方法包括施用根据本发明的稳定液体 药物制剂。

【具体实施方式】
[0112] 本发明涉及一种稳定的药物液体制剂，其包含高浓度的针对P-选择蛋白的抗体。
[0113] 术语"药物制剂"表示这样的制品：其处于允许活性成分的生物活性明确有效的形 式，且其不含有对所述制剂要施用的受试者有毒的额外组分。
[0114] 本文中结合根据本发明的制剂使用的术语"液体"表示，在大气压下在至少约2°C 至约8°C的温度为液体的制剂。
[0115] "稳定的"制剂是这样的制剂：其中所含的蛋白（例如抗体）在贮存后基本上保留 它的物理和化学稳定性，且因而保留它的生物活性。
[0116] "稳定的液体药物抗体制剂"是，在冷藏温度（2_8°C )保持至少12个月、特别是2 年、更特别是3年后没有观察到显著变化的液体抗体制剂。稳定性的标准如下：通过尺寸排 阻色谱法（SEC-HPLC)测得，不超过10%、特别是5%的抗体单体被降解。此外，通过视觉分 析，该溶液是无色或透明至轻微乳白色。所述制剂的蛋白浓度具有不超过±10%变化。形 成不超过10%、特别是5%的聚集。通过本领域已知的方法，诸如紫外光谱法、尺寸排阻色 谱法（SEC-HPLC)、离子交换色谱法（IE-HPLC)、比浊法和目检，测量稳定性。
[0117] 术语 "P-选择蛋白"表示如 Hsu-Lin 等人，J Biol Chem 259 :9121(1984)和 Me Ever等人，J Clin Invest 84 :92(1989)所描述的由人血小板和内皮细胞表达的140kDa蛋 白质。该I型跨膜糖蛋白（SwissProt序列P16109)由NH 2-端凝集素结构域、其后的表皮 生长因子（EGF)样结构域和九个共有重复结构域构成。它通过单个跨膜结构域锚定在膜中 并且含有一个小细胞质尾。
[0118] 术语"针对P-选择蛋白的抗体"和"抗-P-选择蛋白抗体"表示这样的抗体：其 能够以足够的亲和力结合P-选择蛋白，使得所述抗体可在靶向P-选择蛋白中用作诊断剂 和/或治疗剂。本文中使用的术语"结合P-选择蛋白"是指，在BIAcore测定（Pharmacia Biosensor AB，Uppsala,瑞典）中或在ELISA中抗体对P-选择蛋白的结合，其中将经纯化 的P-选择蛋白或P-选择蛋白CH0转染子包被在微量滴定板上。
[0119] 在BIAcore测定中，抗体结合于表面上，并且通过表面等离子体共振（SPR)来测量 P-选择蛋白的结合。结合的亲和性由术语ka(来自抗体/抗原复合物中的抗体的结合速率 常数）、kd(解离常数）以及KD(kd/ka)来定义。对于本发明特别有用的抗体表现出ΚΓ 8或 更小、特别是约ΚΓ11至1(Γ9Μ的KD。
[0120] 在P-选择蛋白-特异性的ELISA中，将表达经纯化的P-选择蛋白的CH0转染子 包被在微量滴定板上，并且用生物素化的抗-人IgG和ELISA的常规步骤检测抗体对P-选 择蛋白的结合。对于本发明特别有用的抗体在该测定中的EC 5(I值范围是在0. 01-0. 08 μ g/ ml之间，更特别地是在0. 01-0. 04 μ g/ml之间。
[0121] 术语"抗体"包括不同形式的抗体结构，包括、但不限于完整抗体和抗体片段。根 据本发明的抗体具体地是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗体片段或其它遗传工程改造抗 体，只要保留根据本发明的特有性能即可。更具体地，所述抗体是人或人源化的单克隆抗 体，特别是重组人抗体。
[0122] "抗体片段"包含全长抗体的一部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合位点。 抗体片段的例子包括由抗体片段形成的双抗体、单链抗体分子和多特异性抗体。scFv抗体 描述在例如 Houston，J. S.，Methods in Enzymol. 203(1991)46-96 中。另外，抗体片段包 括具有VH结构域（即能够与 '结构域装配在一起）或结合Α β的' 结构域（即能够与VH 结构域装配在一起成为功能性抗原结合位点并由此提供性质）的特征的单链多肽。
[0123] 本文中使用的术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"表示具有单一氨基酸组 成的抗体分子的制品。
[0124] 术语"嵌合抗体"指一种抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区， 以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。包 括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是特别重要的。本发明涵盖的"嵌合抗体"的其它形式 是这样的那些，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生根据本 发明的特性，特别是关于Clq结合和/或Fc受体（FcR)结合。也将这种"嵌合"抗体称作 "类别转换抗体"。嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包括编码免疫球蛋 白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。制备嵌合抗体的方法包括目前 在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如，Morrison，S.L.，等，美国国 家科学院学报（Proc. Natl. Acad Sci. USA)81 (1984)6851-6855 ;美国专利号 5, 202, 238 和 5, 204, 244。
[0125] 术语"人源化抗体"指这样的抗体，其中的框架或"互补决定区"（⑶R)已经被修饰 为包括与母体免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在一个优选实施方案中， 将鼠 CDR移植到人抗体的框架区以制备"人源化抗体"。见，例如，Riechmann，L.，等，自然 (Nature) 332 (1988) 323-327 ;和 Neuberger，M. S.，等，自然（Nature) 314 (1985) 268-270。特 别优选的CDRs对应于识别以上指出的关于嵌合抗体的抗原的那些代表性序列。本发明涵 盖的"人源化抗体"的其它形式是这样的那些，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区 开始进行修饰或改变以产生根据本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或Fc受体（FcR) 结合。
[0126] 本文中使用的术语"人抗体"意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区 和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的（van Dijk，M. A.，和van de Winkel，J. G， 当前化学生物学观点（Curr. Opin. Chem. Biol). 5(2001)368-374)。人抗体还可以在转基因 动物（例如小鼠）中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条 件下产生人抗体的全部所有组成成分或选择部分（selection)。在所述种系突变小鼠中转 移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体（见，例如Jakobovits，A.， 等·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院学报）90 (1993) 2551-2555 Jakobovits， A.，等·，Nature (自然）362 (I993) 255_258 ;Bruggemann，Μ·，等·，Year Immunol.(免疫 学年度）7(1993)33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生〇1〇(^61113〇〇111，！1.1?.，和 Winter，G.，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志）227 (1992) 381-388 ;Marks，J. D.，等·，J. Mol. Biol.(分子生物学杂志）222 (1991) 581-597)。Cole，等和Boerner等的技术也可以用于 制备人单克隆抗体（Cole，等·，Monoclonal antibodies and Cancer Therapy (单克隆抗 体和癌症治疗），Alan R. Liss，第 77 页（l985);和 Boerner, Ρ·，等·，J. Immunol.(免疫学 杂志）147 (1991) 86-95)。如已经对根据本发明的嵌合和人源化抗体所提及地，术语"人抗 体"用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生根据本发明的特性，特 别是关于Clq结合和/或FcR结合，例如通过"类别转换"即改变或突变Fc部分（例如由 IgGl 到 IgG4 和 / 或 IgGl/IgG4 突变。）
[0127] 本文中使用的针对P-选择蛋白的人抗体的特征在于，相对于E-选择蛋白和L-选 择蛋白，对P-选择蛋白的高选择性。根据本发明的这样的抗体以在〇. 01-0. 07 μ g/ml范围 内的EC5Q值结合表达P-选择蛋白的细胞。在表达E-选择蛋白和L-选择蛋白的细胞上的 EC5Q值优选地超过100 μ g/ml。
[0128] 本文中使用的术语"重组人抗体"意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离 的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NS0或CH0细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基 因的转基因动物（例如小鼠）的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗 体。这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。根据本发明的重组人抗体已经 经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是尽管源自并涉及 人种系VH和VL序列，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中的序列。
[0129] 本文中使用的"可变区"（轻链的可变区（')、重链的可变区（VH))或"可变结构 域"表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链结构域。可变轻链和重链结构域具有 相同的一般结构且每个结构域包括4个框架（FR)区，所述框架区的序列普遍保守，其通过3 个"高变区"（或互补决定区，⑶R)相连接。框架区采用β-折叠构象，且⑶R可以形成连 接β-折叠结构的环。每条链中的CDR通过框架区以其三维结构保持并与来自另一条链的 CDR -起形成抗原结合位点。抗体的重链和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性 /亲和性方面发挥特别重要的作用。本文中使用的术语"抗体的抗原结合部分"表示抗体的 负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包括来自"互补决定区"或"CDR"的氨基 酸残基。"框架"或"FR"区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因 此，抗体的轻链和重链可变结构域从Ν端到C端包括结构域FR1XDR1、FR2XDR2、FR3XDR3 和FR4。特别地，重链的⑶R3是最有助于抗原结合并限定抗体的性能的区域。按照Kabat 等，免疫目的的蛋白质序列（Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第 5 版，公众健康服务，国家健康研究所（Public Health Service, National Institutes of Health)，Bethesda，MD. (1991)的标准定义，确定CDR和FR区域和/或来自"高变环"的那 些残基。
[0130] 术语"表位"包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表 位决定簇包括分子的化学活性表面分组（groupings)，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰 基，且，在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和或特定的带电特性。表位是被 抗体结合的抗原区域。
[0131] 对于本发明特别有用的抗体具体地能够在有P-选择蛋白片段氨基酸 60-75(SWissPr 〇t序列P16109)存在下结合P-选择蛋白，和/或不会竞争性地抑制由指定 为ATCC登记号HB11041的细胞系分泌的抗体对P-选择蛋白的结合。
[0132] "恒定区"或"恒定结构域"不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应子 功能。取决于它们的重链的恒定区的氨基酸序列，将抗体或免疫球蛋白分成以下类别：IgA、 IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几类可以进一步分成亚类（同种型），例如IgGl、 IgG2、IgG3和IgG4、IgAl和IgA2。在本发明中使用的抗体具体地属于IgG类型，更具体地 属于IgGl或IgG4人亚型。
[0133] 对于本发明特别有用的抗体的特征在于，它含有从人起源衍生出的Fc部分，并且 它不会结合补体因子Clq也不会结合效应细胞上的Fcy受体。具体地，所述抗体的特征在 于，它是含有至少一个在 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和 / 或 P329 中的 突变的人亚类IgGl的抗体，或含有至少一个在L235和S228(根据EU索引编号）中的突变 的人亚类IgG4的抗体。更具体地，它是人亚类IgG4的抗体，其中S228被P替代且L235被 E替代（SPLE突变）。这样的抗体被定义为IgG4vl (S228P ;L235E)。特别感兴趣的其它抗 体是被定义为 IgGlvl(PVA-236 ;如由 E233P 指定的 GLPSS331 ;L234V ;L235A ;8G236 ;A327G ; A330S ;P331S)和 IgGlv2(L234A ;L235A)的那些。
[0134] 药物制剂所含的针对P-选择蛋白的抗体的浓度是在40mg/ml至200mg/ml的范围 内，特别是在40mg/ml至100mg/ml的范围内，更特别地在40mg/ml至60mg/ml的范围内，最 特别地为50mg/ml。
[0135] 本发明的药物制剂包含泊洛沙姆作为表面活性剂，以减少抗体的聚集和颗粒形 成。本文中使用的术语"泊洛沙姆（poloxamer)"包括由聚氧丙烯中央疏水链和侧接的2 个聚氧乙烯亲水链构成的聚氧乙烯-聚氧丙烯三嵌段共聚物，其被称作泊洛沙姆188,并 由BASF(Parsippany, N. J.)在商业名称PLURONiC? F68下销售。在本发明的制剂中 可以使用的其它泊洛沙姆包括泊洛沙姆403(销售为PLURONIC? P123)、泊洛沙姆 407 (销售为PLURONIC? P127)、泊洛沙姆402 (销售为PLURONiC? P122)、泊洛沙 姆181 (销售为PLURONIC?L61)、泊洛沙姆401 (销售为PLURONlC?:L121)、泊洛沙 姆 185 (销售为 PLURONiC? P65)和泊洛沙姆 338 (销售为 PLURONIC?. F108)。
[0136] 本文中使用的术语"表面活性剂"表示，用于保护蛋白制剂抵抗物理应力（如搅拌 和剪切）的药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的表面活性剂的例子包括：聚氧乙烯脱 水山梨糖醇脂肪酸酯（吐温）、聚氧乙烯烷基醚（例如在商标Brij?下销售的那些）和聚 氧乙烯-聚氧丙烯共聚物（泊洛沙姆，Pluronic)。聚氧乙烯脱水山梨糖醇-脂肪酸酯的例 子是聚山梨酯20 (在商标吐温20?下销售）和聚山梨酯80 (在商标吐温80?下销售）。
[0137] 本文中使用的术语"缓冲液"表示稳定药物制剂的pH的药学上可接受的赋形剂。 合适的缓冲液是本领域众所周知的，且可以在文献中找到。优选的药学上可接受的缓冲液 包括但不限于：组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、精氨酸缓 冲液、磷酸盐缓冲液或其混合物。特别感兴趣的缓冲液包含L-组氨酸或L-组氨酸和L-组 氨酸盐酸盐的混合物，其用本领域已知的酸或碱进行pH调节。上述的缓冲液通常以约5mM 至约100mM、特别是约10mM至约30mM、更特别是约20mM的量使用。独立于使用的缓冲液， 用本领域已知的酸或碱（例如盐酸、乙酸、磷酸、硫酸和柠檬酸、氢氧化钠和氢氧化钾）可 以将pH调至在4. 5-7. 0范围内的值，特别是调至在5. 0-6. 0范围内的值，最特别地是调至 pH5. 5±0. 03。
[0138] 术语"稳定剂"表示，在制备、贮存和应用过程中保护活性药物成分和/或制剂免 于化学和/或物理降解的药学上可接受的赋形剂。Cleland等人（1993)，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4) :307-77,Wang(1999)Int J Pharm 185(2) ： 129-88,Wang(2000) Int J Pharm 203(1-2) :1-60 和 Chi 等人（2003)Pharm Res 20(9) :1325-36 综述了蛋白药 物的化学和物理降解途径。稳定剂包括、但不限于：糖，氨基酸，多元醇，环糊精，例如羟丙 基-β-环糊精、磺丁基乙基-β-环糊精、β-环糊精，聚乙二醇，例如PEG 3000、PEG 3350、 PEG 4000、PEG 6000,白蛋白，人血清白蛋白（HSA)，牛血清白蛋白（BSA)，盐，例如氯化钠、 氯化镁、氯化钙，螯合剂，例如EDTA，如在后面定义的。在本发明中具体地使用的稳定剂选自 糖、多元醇和氨基酸。更具体地，所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和精氨酸盐酸盐。 稳定剂可以以下述量存在于制剂中：约lOOmM至约500mM的量，特别是约140至约250mM的 量，更特别是约210mM至约230mM的量。更具体地，以约210mM至约230mM的量使用蔗糖或 海藻糖作为稳定剂。
[0139] 在某些实施方案中，本发明的稳定液体药物制剂包含抗氧化剂作为第二种稳定 齐IJ。"抗氧化剂"是阻止活性药物成分的氧化的药学上可接受的赋形剂。抗氧化剂包括、但 不限于：螯合剂诸如EDTA、柠檬酸、抗坏血酸、丁羟甲苯（BHT)、丁羟茴香醚（BHA)、亚硫酸 钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、甲硫氨酸、乙醇、苯甲醇和正乙酰基 半胱氨酸。可以以下述量使用抗氧化剂：约〇. 01至约l〇〇mM的量，特别是约5至约50mM的 量，更特别是约5至约25mM的量。具体地，选择甲硫氨酸作为第二种稳定剂，特别是以约5 至约25mM的浓度，更特别地以约10mM的浓度。
[0140] 本文中使用的术语"糖"表示单糖或寡糖。单糖是不可被酸水解的单体碳水化合 物，包括单糖和它们的衍生物，例如氨基糖。单糖的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、 山梨糖、核糖、脱氧核糖、神经氨酸。寡糖是由超过一个经由糖苷键连接的单体糖单元组成 的支链或直链碳水化合物。在寡糖内的单体糖单元可以是相同的或不同的。取决于单体糖 单元的数目，寡糖是二糖、三糖、四糖、五糖诸如此类。与多糖不同，单糖和寡糖是水溶性的。 寡糖的例子包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖和棉子糖。具体地，糖选自蔗糖和海藻糖。
[0141] 本文中使用的术语"氨基酸"表示，具有位于羧基的α -位的氨基部分的药学上可 接受的有机分子。氨基酸的例子包括精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬 氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸。通 常以下述量使用氨基酸：约5-500mM的量，特别是约5至约200mM的量，更特别是约100至 约150mM的量。
[0142] 本文中使用的术语"多元醇"表示具有超过一个羟基的药学上可接受的醇。合适的 多元醇包括、但不限于：甘露醇、山梨糖醇、甘油（glycerine)、葡聚糖、丙三醇（glycerol)、 阿糖醇、丙二醇、聚乙二醇和它们的组合。可以以下述量使用多元醇：约10mM至约500mM的 量，特别是约10至约250mM的量，更特别是约200至约250mM的量。
[0143] 术语"稳定剂"也包括冷冻保护剂。术语"冷冻保护剂"表示，在冷冻干燥过程、随 后的贮存和重构中保护不稳定的活性成分（例如蛋白）抵抗失稳条件的药学上可接受的赋 形剂。冷冻保护剂包括、但不限于糖、多元醇（例如糖醇）和氨基酸。具体地，冷冻保护剂 可以选自：糖类诸如蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉 子糖、神经氨酸，氨基糖类诸如葡糖胺、半乳糖胺、N-甲基葡糖胺（"葡甲胺"），多元醇类诸 如甘露醇和山梨糖醇，和氨基酸类诸如精氨酸和甘氨酸或其混合物。通常以下述量使用冷 冻保护剂：约10至约500mM的量，特别是约10至约250mM的量，更特别是约100至约250mM 的量。
[0144] 药物制剂还可以含有张度剂。本文中使用的术语"张度剂"表示用于调节制剂的 张度的药学上可接受的张度剂。所述制剂可以是低渗的、等渗的或高渗的。等渗性通常涉 及溶液的相对渗透压，经常是相对于人血清的渗透压。根据本发明的制剂可以是低渗的、等 渗的或高渗的，但是优选地是等渗的。等渗制剂是液体或从固体形式（例如从低压冻干形 式）重构的液体，且表示具有与它所对比的某种其它溶液（诸如生理学的盐溶液和血清） 相同的张度的溶液。合适的张度剂包括、但不限于氯化钠、氯化钾、甘油和选自以下的任意 组分：氨基酸，糖，尤其是葡萄糖。通常以约5mM至约500mM的量使用张度剂。在稳定剂和 张度剂内，存在一组可以以两种方式起作用的化合物，即它们可以同时为稳定剂和张度剂。 其例子可以在以下集合中找到：糖、氨基酸、多元醇、环糊精、聚二醇和盐。可以同时为稳定 剂和张度剂的糖的一个例子是海藻糖。
[0145] 所述药物制剂还可以含有佐剂诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌操 作和通过包含不同的抗细菌剂和抗真菌剂（例如，对羟基苯甲酸甲酯、三氯叔丁醇、苯酚、 山梨酸等），可以确保阻止微生物的存在。通常以约0.001至约2% (w/v)的量使用防腐剂。 防腐剂包括、但不限于：乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯-间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对 羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵。
[0146] 根据本发明的针对P-选择蛋白的抗体的稳定液体药物制剂可以用于预防或治疗 血栓性病症和炎性疾病，特别是用于预防或治疗选自以下的病症或疾病：血管病症诸如血 管狭窄、动脉粥样硬化、动脉和深静脉血栓形成、急性冠状动脉综合征（ACS)、冠状动脉疾 病（CAD)、冠心病，用于预防用冠状动脉旁路移植术（CABG)外科手术或经皮冠状动脉干预 (PCI)治疗的患者中的继发性心血管事件、狭窄、血管成形术或支架放置以后再狭窄、周围 动脉疾病（PAD)、周围动脉闭塞性疾病（PAOD)、重症肢体缺血（CLI)、由以下病症造成的白 细胞介导的缺血后组织损伤：心肌梗死、脑缺血事件（例如卒中）、血液透析分流狭窄、透析 分流阻塞、肾梗死、急性肾损伤、脓毒症、急性白细胞介导的肺损伤、变态反应诸如哮喘、移 植血管病变，用于预防器官移植排斥、急性胰腺炎、炎性肠病、自身免疫疾病诸如类风湿性 关节炎、血栓性血小板减少性紫癜（TPP)、银屑病、镰状细胞病，和用于通过抑制循环癌细胞 的粘附而预防肿瘤转移。
[0147] 更具体地，针对P-选择蛋白的抗体的稳定液体药物制剂可以用于预防或治疗急 性冠状动脉综合征（ACS)、用冠状动脉旁路移植术（CABG)外科手术或经皮冠状动脉干预 (PCI)治疗的患者中的继发性心血管事件、狭窄、血管成形术或支架放置以后再狭窄、周围 动脉疾病（PAD)、周围动脉闭塞性疾病（PA0D)和重症肢体缺血（CLI)。
[0148] 通过静脉内（i. V.)、皮下（s. c.)或任意其它胃肠外施用方式（如药学领域中已知 的那些方式），可以施用根据本发明的稳定液体药物制剂。
[0149] 考虑到它们的高稳定性，根据本发明的药物制剂可以在不需要线内过滤器 (in-line filter)的情况下静脉内施用，且因而比需要用线内过滤器才能施用的常规制剂 远远更方便地操作。必须将线内过滤器诸如Stenfix'R安装在静脉内药物的输注线中，以 防止可能存在于静脉内溶液或线中的任何颗粒、空气或微生物的施用。5-20微米尺寸和更 大的颗粒具有阻塞穿过肺毛细血管的血流的能力，这会导致并发症诸如肺栓塞。外来颗粒 还可以在注射部位处造成静脉炎，并且过滤器可以帮助降低静脉炎的发病率。
[0150] 要用于体内施用的稳定制剂必须是无菌的。这通过穿过无菌过滤膜的过滤容易地 实现。
[0151] 通过本领域已知的方法，例如超滤-透析过滤、透析、添加和混合、冷冻干燥、重构 及其组合，可以制备根据本发明的稳定液体药物制剂。可以在下文中找到根据本发明的制 剂的制备例子。
[0152] 根据本发明的稳定液体药物制剂还可以呈低压冻干形式或呈从低压冻干形式重 构的液体形式。通过本领域已知的冷冻干燥方法，制备"低压冻干形式"。所述冻干粉剂经 常具有约〇. 1-5% (w/w)的残余含水量，且作为粉末或物理上稳定的饼状物存在。通过在加 入重构介质以后的快速溶解，可以从冻干粉剂得到"重构形式"。合适的重构介质包括、但不 限于：注射用水（WFI)、抑制细菌注射用水（BWFI)、氯化钠溶液（例如0. 9% (w/v)NaCl)、葡 萄糖溶液（例如5 % (w/v)葡萄糖）、含有表面活性剂的溶液（例如0.01 % (w/v)聚山梨酯 20和pH缓冲溶液（例如磷酸盐缓冲溶液）。
[0153] 抗体的生产
[0154] 从杂交瘤细胞系、尤其是从杂交瘤细胞系hu-Mab〈P_选择蛋白〉LC1004_001(抗 体 HuMab 001)、hu-Mab〈P-选择蛋白〉LC 1004-002 (抗体 HuMab 002)和 hu-Mab〈P-选择 蛋白〉LC 1004-017(抗体HuMab 017)(它们在国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩 斯条约下于2004年3月30日保藏在德国的德意志微生物保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)，并分别在保藏号 DSM ACC2640、DSM ACC2641和DSM ACC2642下得到），可以生产对于本发明特别有用的针对P-选择蛋白的抗 体。
[0155] 具体地，通过重组方式生产对于本发明特别有用的抗体。这样的方法是在现有 技术中广泛已知的，并且描述在例如以下综述文章中：Makrides，S. C. , Protein Expr. Purif. 17(1999) 183-202 ；Geisse, S.,等人，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ; Kaufman, R.J. , Mol. Bio techno 1. 16 (2000) 151-161 ;或 Werner, R.G.，Drug Res. 48(1998)870-880。所述方法包括在原核和真核细胞中表达蛋白，随后分离抗体多肽， 并经常纯化至药学上可接受的纯度。为了表达蛋白，通过标准方法将编码轻链和重链或其 片段的核酸插入表达载体中。使用常规操作，容易地分离编码抗体的DNA和RNA并测序。 杂交瘤细胞可以充当所述DNA和RNA的来源。可以使用常规方法容易地对这样的核酸进行 分离和测序（例如，通过使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探 针）。在适当的原核或真核宿主细胞如CH0细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞或C0S 细胞中进行表达，并通过标准技术从细胞（裂解以后的上清液或细胞）回收抗体。通过常 规免疫球蛋白纯化操作，例如，使用蛋白A-琼脂糖的柱色谱法、羟基磷灰石色谱法、凝胶电 泳、透析或亲和色谱法，适当地从培养基中分离出抗体。
[0156] 在本申请中公开的氨基酸序列：
[0157] SEQ ID NO :1 HuMab 001的轻链可变结构域
[0158] SEQ ID NO :2 HuMab 001的重链可变结构域
[0159] SEQ ID NO :3 HuMab 002的轻链可变结构域
[0160] SEQ ID NO :4 HuMab 002的重链可变结构域
[0161] SEQ ID NO :5 HuMab 003的轻链可变结构域
[0162] SEQ ID NO :6 HuMab 003的重链可变结构域
[0163] SEQ ID NO :7 HuMab 004(1)的轻链⑴可变结构域
[0164] SEQ ID NO :8 HuMab 004(1)的重链⑴可变结构域
[0165] SEQ ID NO :9 HuMab 004(11)的轻链（II)可变结构域
[0166] SEQ ID N0 :10 HuMab 004(11)的重链（II)可变结构域
[0167] SEQ ID N0 :11 HuMab 005的轻链可变结构域
[0168] SEQ ID N0 :12 HuMab 005的重链可变结构域
[0169] SEQ ID N0 :13 HuMab 010(1)的轻链可变结构域
[0170] SEQ ID N0 :14 HuMab 010(1)的重链可变结构域
[0171] SEQ ID N0 :15 HuMab 010(11)的轻链可变结构域
[0172] SEQ ID N0 :16 HuMab 010(11)的重链可变结构域
[0173] SEQ ID N0 :17 HuMab 010(111)的轻链可变结构域
[0174] SEQ ID N0 :18 HuMab 010(111)的重链可变结构域
[0175] SEQ ID N0 :19 HuMab 011的轻链可变结构域
[0176] SEQ ID NO :20 HuMab 011的重链可变结构域
[0177] SEQ ID NO :21 HuMab 017的轻链可变结构域
[0178] SEQ ID NO :22 HuMab 017的重链可变结构域
[0179] SEQ ID NO 23 HuMab 002 IgG4vl 的轻链
[0180] SEQ ID NO 24 HuMab 002 IgG4vl 的重链
[0181] 实施例
[0182] 如下开发根据本发明的用于静脉内（i. v.)施用的液体药物产品制剂。
[0183] 实施例1 :用于初步制剂筛诜的液体制剂的制各
[0184] 以50mg/ml的蛋白浓度，制备在表1中列出的huMAb P-选择蛋白液体制剂F1至 F24。
[0185] 以大约20mg/mL的浓度，在20mM组氨酸缓冲液（pH为大约5. 5)中提供如在 W02005/100402中所述制备和得到的huMAb P-选择蛋白抗体。在本实施例中使用的huMAb P-选择蛋白抗体是包含SEQ ID NO :24的重链和SEQ ID NO :23的轻链的人抗体。
[0186] 为了制备液体制剂，将huMAb P-选择蛋白在含有预期的缓冲液组成的渗滤缓冲液 中进行缓冲液交换，并通过超滤浓缩至大约80mg/mL的抗体浓度。超滤操作结束以后，将赋 形剂（例如海藻糖、甲硫氨酸）作为储备溶液添加到抗体溶液中。然后加入作为125倍储 备溶液的表面活性剂。最后，用缓冲液将蛋白浓度调至大约50mg/mL的最终huMAb P-选择 蛋白浓度。
[0187] 将所有制剂穿过0. 22 μ m低蛋白结合过滤器无菌过滤，并无菌填充进无菌6mL玻 璃管形瓶中，所述玻璃管形瓶用ETFE (乙烯和四氟乙烯的共聚物）包被的橡胶塞和铝钳口 盖（alucrimp cap)封闭。填充体积为大约2. 4mL。将这些制剂在不同气候条件（5°C、25°C 和40°C )下存储不同的时间段，并通过摇动（在5°C和25°C以ΖΟΟπ?ιΓ1摇动频率摇动1周） 和冻融应激方法（在_80°C /+5°C进行5个循环）施加应激。
[0188] 表 1
[0189]
[0190]

【权利要求】
1. 一种稳定液体药物制剂，其包含： -40mg/ml至200mg/ml的针对P-选择蛋白的抗体； -0.01 %至0. 1 %的泊洛沙姆； -5mM至lOOmM的缓冲液； -100mM至500mM的至少一种稳定剂； 其pH在4. 5-7.0的范围内。
2. 根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述针对P-选择蛋白的抗体的浓度在40mg/ ml至100mg/ml的范围内，特别是50mg/ml。
3. 根据权利要求1或2所述的药物制剂，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
4. 根据权利要求1-3中的任一项所述的药物制剂，其中所述泊洛沙姆以在0.01%至 0. 05%范围内、特别是0. 02%的浓度存在。
5. 根据权利要求1-4中的任一项所述的药物制剂，其中所述缓冲液是组氨酸缓冲液， 特别是组氨酸乙酸盐缓冲液。
6. 根据权利要求1-5中的任一项所述的药物制剂，其中所述缓冲液具有在10-30mM范 围内、特别是20mM的浓度。
7. 根据权利要求1-6中的任一项所述的药物制剂，其中所述制剂的pH在5. 0-6. 0的范 围内，特别是5. 5。
8. 根据权利要求1-7中的任一项所述的药物制剂，其中至少一种稳定剂选自糖或氨基 酸。
9. 根据权利要求1-8中的任一项所述的药物制剂，其中至少一种稳定剂以在 140-250mM范围内、特别是在210-230mM范围内的浓度存在。
10. 根据权利要求8或9所述的药物制剂，其中所述稳定剂选自由海藻糖、蔗糖、山梨糖 醇和精氨酸盐酸盐组成的组。
11. 根据权利要求1-11中的任一项所述的药物制剂，其中所述针对P-选择蛋白的抗体 是人抗体或人源化抗体。
12. 根据权利要求1-11中的任一项所述的药物制剂，其中所述针对P-选择蛋白的抗体 包含可变区，所述可变区独立地选自由下述组成的组： l) 由SEQ ID NO :2的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID NO :1的氨基酸 序列限定的轻链可变结构域； m) 由SEQ ID NO :4的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID NO :3的氨基酸 序列限定的轻链可变结构域； η)由SEQ ID NO :6的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID NO :5的氨基酸 序列限定的轻链可变结构域； 〇)由SEQ ID NO :8的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID NO :7的氨基酸 序列限定的轻链可变结构域； P)由SEQ ID N0:10的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0:9的氨基酸 序列限定的轻链可变结构域； q)由SEQ ID N0:12的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0:11的氨基 酸序列限定的轻链可变结构域； r) 由SEQ ID NO :14的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID NO :13的氨基 酸序列限定的轻链可变结构域； s) 由SEQ ID N0:16的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0:15的氨基 酸序列限定的轻链可变结构域； t) 由SEQ ID N0:18的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0:17的氨基 酸序列限定的轻链可变结构域； u) 由SEQ ID N0:20的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID N0:19的氨基 酸序列限定的轻链可变结构域；和 v) 由SEQ ID NO :22的氨基酸序列限定的重链可变结构域和由SEQ ID NO :21的氨基 酸序列限定的轻链可变结构域。
13. 根据权利要求1-12中的任一项所述的药物制剂，其中所述针对P-选择蛋白的抗体 的重链可变结构域包含SEQ ID NO :4的氨基酸序列，且所述针对P-的抗体的轻链可变结构 域包含SEQ ID NO : 3的氨基酸序列。
14. 根据权利要求1-13中的任一项所述的药物制剂，其中所述针对P-选择蛋白的抗体 是包含SEQ ID NO :24的重链氨基酸序列和SEQ ID NO :23的轻链氨基酸序列的人抗体。
15. 根据权利要求1所述的稳定液体药物制剂，其包含： 50mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID NO :24的重链氨基酸 序列和SEQ ID NO :23的轻链氨基酸序列；和 (i) 0.02 %的泊洛沙姆188， 230mM海藻糖，和 pH5. 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者 (ii) 0.02%的泊洛沙姆188， 210mM鹿糖，和 pH5. 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者 (iii) 0. 02%的泊洛沙姆188， 145mM精氨酸盐酸盐，和 pH5. 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者 (iv) 0.02 %的泊洛沙姆188， 230mM山梨糖醇，和 pH5. 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液。
16. 根据权利要求1所述的稳定液体药物制剂，其包含： (a) 40mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID NO :24的重链氨基 酸序列和SEQ ID NO :23的轻链氨基酸序列， 〇. 01 %的泊洛沙姆188， 210mM鹿糖，和 pH5. 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者 (b) 60mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID NO :24的重链氨基 酸序列和SEQ ID NO :23的轻链氨基酸序列， 〇. 01 %的泊洛沙姆188， 210mM鹿糖，和 pH5. 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者 (c) 40mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID NO :24的重链氨基 酸序列和SEQ ID NO :23的轻链氨基酸序列， 0. 03%的泊洛沙姆188， 210mM鹿糖，和 pH5. 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者 (d) 60mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID NO :24的重链氨基 酸序列和SEQ ID NO :23的轻链氨基酸序列， 0. 03%的泊洛沙姆188， 210mM鹿糖，和 pH5. 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者 (e) 40mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID NO :24的重链氨基 酸序列和SEQ ID NO :23的轻链氨基酸序列， 〇. 01 %的泊洛沙姆188， 210mM鹿糖，和 pH6. 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者 (f) 60mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID NO :24的重链氨基 酸序列和SEQ ID NO :23的轻链氨基酸序列， 〇. 01 %的泊洛沙姆188， 210mM鹿糖，和 pH6. 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者 (g) 40mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID NO :24的重链氨基 酸序列和SEQ ID NO :23的轻链氨基酸序列， 0. 03%的泊洛沙姆188， 210mM鹿糖，和 pH6. 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者 (h) 60mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID NO :24的重链氨基 酸序列和SEQ ID NO :23的轻链氨基酸序列， 0. 03%的泊洛沙姆188， 210mM鹿糖，和 pH6. 0的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液；或者 (i) 50mg/ml的针对P-选择蛋白的人抗体，所述人抗体包含SEQ ID N0:24的重链氨基 酸序列和SEQ ID NO :23的轻链氨基酸序列， 0. 02%的泊洛沙姆188， 210mM鹿糖，和 pH5. 5的20mM组氨酸乙酸盐缓冲液。
17.根据权利要求1-16中的任一项所述的稳定液体药物制剂，其用于预防或治疗炎 性疾病和血栓性疾病以及由炎性过程和/或血栓性过程驱动的血管疾病病状，特别是用于 预防或治疗具有基础性动脉粥样化血栓形成和血管狭窄的血管疾病，诸如冠状动脉疾病 (CAD)、急性冠状动脉综合征（ACS)、周围动脉疾病（PAD)、周围动脉闭塞性疾病（PAOD)、重 症肢体缺血（CLI)、冠状动脉旁路移植术（CABG)后狭窄、冠状静脉移植物疾病、经皮冠状动 脉介入（PCI)后再狭窄、透析分流狭窄、透析分流阻塞以及动脉和深静脉血栓形成和血栓 性血小板减少性紫癜（TPP)，用于预防和治疗由心肌梗死、脑缺血事件（例如卒中）、肾梗 死、急性肾损伤、器官移植排斥和急性白细胞介导的肺损伤造成的缺血后组织损伤，用于治 疗脓毒性休克、变应性病症、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD)、移植血管病变、急性胰腺炎、 炎性肠病、类风湿性关节炎、特应性皮炎、银屑病、镰状细胞病，和用于预防肿瘤转移。
18. 根据权利要求1-16中的任一项所述的稳定液体药物制剂用于制备药物的用途，所 述药物用于预防或治疗炎性疾病和血栓性疾病以及由炎性过程和/或血栓性过程驱动的 血管疾病病状，特别是用于预防或治疗具有基础性动脉粥样化血栓形成和血管狭窄的血管 疾病，诸如冠状动脉疾病（CAD)、急性冠状动脉综合征（ACS)、周围动脉疾病（PAD)、周围动 脉闭塞性疾病（PAOD)、重症肢体缺血（CLI)、冠状动脉旁路移植术（CABG)后狭窄、冠状静脉 移植物疾病、经皮冠状动脉介入（PCI)后再狭窄、透析分流狭窄、透析分流阻塞以及动脉和 深静脉血栓形成和血栓性血小板减少性紫癜（TPP)，用于预防和治疗由心肌梗死、脑缺血事 件（例如卒中）、肾梗死、急性肾损伤、器官移植排斥和急性白细胞介导的肺损伤造成的缺 血后组织损伤，用于治疗脓毒性休克、变应性病症、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD)、移植血 管病变、急性胰腺炎、炎性肠病、类风湿性关节炎、特应性皮炎、银屑病、镰状细胞病，和用于 预防肿瘤转移。
19. 一种方法，其用于预防或治疗炎性疾病和血栓性疾病以及由炎性过程和/或血栓 性过程驱动的血管疾病病状，特别是用于预防或治疗具有基础性动脉粥样化血栓形成和血 管狭窄的血管疾病，诸如冠状动脉疾病（CAD)、急性冠状动脉综合征（ACS)、周围动脉疾病 (PAD)、周围动脉闭塞性疾病（PAOD)、重症肢体缺血（CLI)、冠状动脉旁路移植术（CABG)后 狭窄、冠状静脉移植物疾病、经皮冠状动脉介入（PCI)后再狭窄、透析分流狭窄、透析分流 阻塞以及动脉和深静脉血栓形成和血栓性血小板减少性紫癜（TPP)，用于预防和治疗由心 肌梗死、脑缺血事件（例如卒中）、肾梗死、急性肾损伤、器官移植排斥和急性白细胞介导的 肺损伤造成的缺血后组织损伤，用于治疗脓毒性休克、变应性病症、哮喘、慢性阻塞性肺疾 病（COPD)、移植血管病变、急性胰腺炎、炎性肠病、类风湿性关节炎、特应性皮炎、银屑病、镰 状细胞病，和用于预防肿瘤转移，所述方法包括施用根据权利要求1-16中的任一项所述的 稳定液体药物制剂。
【文档编号】C07K16/28GK104105506SQ201380008162
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年3月7日 优先权日:2012年3月8日
【发明者】米夏埃尔·阿德勒, 乌拉·格劳施奥夫, 汉斯-克里斯蒂·马勒 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司