盐析和部分溶解洗涤法纯化IFN-τ包涵体蛋白的方法
【专利摘要】本发明涉及一种依靠盐析和部分溶解洗涤法纯化IFN-τ包涵体蛋白的方法，通过盐析、部分溶解盐析沉淀、复性即可获得高纯度高活性的蛋白质，不需要再进行诸如离子交换色谱、分子筛等既繁琐费事又成本高昂的精纯化操作，蛋白纯度即可高达90％以上，达精纯化标准，目的蛋白损失量小，蛋白活性良好。该方法具有成本低廉、操作简单、重复性好、快速高效的优点，适于大规模工业化生产。
【专利说明】盐析和部分溶解洗涤法纯化IFN-τ包涵体蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白质纯化【技术领域】，具体涉及一种依靠盐析和部分溶解洗涤法纯化IFN- τ包涵体蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质纯化要利用不同蛋白质间内在的相似性与差异，利用各种蛋白质间的相似性来除去非蛋白质的污染，而利用各种蛋白质间的差异将目的蛋白质从其他蛋白质中纯化出来。每种蛋白质间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将目的蛋白质从混合物如包涵体蛋白中提取出来。
[0003]目前蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。经过粗分离阶段后还需要利用离子交换色谱、分子筛精纯化方法才能达到90%以上纯度的精纯化标准，步骤繁琐费事，成本高昂。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种依靠盐析和部分溶解洗涤法纯化IFN- τ包涵体蛋白的方法，成本低廉、操作简单、重复性好、目的蛋白损失量小，仅凭借此方法即可达到90%以上纯度的精纯化标准，从而不需要再进行诸如离子交换色谱、分子筛等精细纯化操作。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种以盐析和部分溶解洗涤法纯化IFN- τ包涵体蛋白的方法,包括以下步骤:
[0006]I)表达蛋白质的工程菌发酵后，收集、裂解菌体，然后收集、洗涤包涵体，并用包涵体溶解液溶解包涵体，再以40%饱和度硫酸铵溶液进行盐析沉淀；
[0007]2)取用盐析沉淀的同体积的包涵体溶解液，以部分溶解方式溶解盐析沉淀，离心后检测上清中的目的蛋白纯度，丢弃上清，留取沉淀；
[0008]3)将所留沉淀重复进行步骤2)操作，重复2-4次，最后将剩余沉淀充分溶解并复性，即可获得高纯度高活性的蛋白质。
[0009]具体地,所述步骤I)中溶解包涵体的包涵体溶解液成分为:Bis_Tris (二(2_轻乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷)20mM、Urea (尿素)8M、EDTA(乙二胺四乙酸)10mM、DTT (二硫苏糖醇)IOmM用去离子水溶解，然后用盐酸调pH值到5.8。
[0010]具体地，所述步骤I)硫酸铵溶液配制如下:以包涵体溶解液为溶剂配制饱和硫酸铵溶液，加Bis-Tris至浓度30mM,浓硫酸调pH值至5.8。
[0011]具体地，所述步骤2)中的部分溶解方式为包涵体溶解液的用量不足以使盐析沉淀完全溶解，仅使其部分溶解。
[0012]具体地，所述步骤3)中的重复次数由上清中目的蛋白的纯度(即目的蛋白占总蛋白的百分比)来决定，如果纯度下降，则丢弃上清，留取沉淀。因为随着重复次数的增多，上清中的目的蛋白纯度会逐渐升高，使得在部分溶解与完全溶解的这两种情况下，上清中蛋白纯度的差值减小，这样情况下纯化效果会变差，且造成目的蛋白的丢失。所以，实验者可根据自己的实验目的自行决定合适的重复次数。
[0013]具体地，所述步骤3)中将剩余沉淀充分溶解的溶解液为包涵体溶解液。
[0014]本发明具有以下有益效果:本发明是一种仅仅依靠盐析和部分溶解洗涤法即完成IFN- τ包涵体蛋白纯化的方法，不需要再进行诸如离子交换色谱、分子筛等既繁琐费事又成本高昂的精纯化操作，蛋白纯度即可高达90%以上，达精纯化标准，目的蛋白损失量小，蛋白活性良好。该方法具有成本低廉、操作简单、重复性好、快速高效的优点，适于大规模工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是实施例1中盐析和部分溶解法纯化IFN- τ过程中的SDS-PAGE图谱。
[0016]图2是图1经Bandscan5.0软件分析后的图谱。
[0017]图3是图1经Bandscan5.0软件分析后，软件生成的以表格形式显示的各样品目的蛋白纯度。
【具体实施方式】
[0018]以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
[0019] 实施例1
[0020]以干扰素-τ包涵体蛋白(IFN-τ )的纯化为例。
[0021]①IFN-τ诱导表达:
[0022]本发明所用重组蛋白的工程菌是由含有IFN- τ基因的温控型重组质粒pBV220转化E.coli BL21获得。培养温度为30°C，诱导温度为42°C。
[0023]②菌体裂解和包涵体的洗涤:
[0024]常规方法进行。
[0025]③盐析沉淀液配制:
[0026]以包涵体溶解液稀释盐析沉淀液至其蛋白浓度于25_30mg / mL。其中包涵体溶解液成分:Bis-Tris20mM、Urea8M、EDTAlOmM、DTTlOmM去离子水配置，用盐酸调pH值到5.8。
[0027]④配制饱和硫酸铵溶液配制:
[0028]以包涵体溶解液为溶剂配制饱和硫酸铵溶液。加Bis-Tris至浓度30mM，浓硫酸调pH值至5.8。
[0029]⑤盐析步骤:
[0030](TC条件下，以步骤③所配制蛋白溶液作为盐析沉淀液，向此溶液中缓慢添加步骤④所配置硫酸铵溶液，边加边搅拌，使硫酸铵终浓度达45%饱和度(硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的体积百分数表示，称为百分饱和度)。加完后继续搅拌30min，0°C放置3小时以上，以形成较大沉淀而易于分离。1000Og离心lOmin，收集沉淀。
[0031]⑥部分溶解法纯化:
[0032]取用盐析沉淀的相同体积的包涵体溶解液，部分溶解盐析沉淀，离心后丢弃上清，留取沉淀。再将所留的沉淀重复进行以上操作，重复3次。[0033]⑦溶解剩余沉淀:
[0034]用包涵体溶解液(最少需用沉淀体积的4-5倍的溶解液)将剩余沉淀完全溶解。
[0035]⑧复性及纯化产物活性测定:
[0036]透析复性后，进行重组IFN- τ的活性测定。
[0037]在常规方法纯化IFN- τ的实验中，我们意外地发现了一个现象:某次实验中，因操作失误，取用溶剂不足，未将蛋白沉淀完全溶解，此情况下SDS-PAGE蛋白电泳显示上清中干扰素_τ (21KD分子量位置)含量只占总蛋白的大约15%。而正常操作，即取用足量的溶解液使沉淀充分溶解时，上清中干扰素-τ可达到约50%。这说明:当溶剂体积不足时，溶出的上清中的各种蛋白的构成比发生了巨大变化。推测其原因:溶剂足够时重组蛋白和杂蛋白都能得以充分溶解，溶解度的差异不能直接得以体现；而溶剂体积不足的情况下，各种蛋白间的溶解度差异得以体现，即溶解度较大的蛋白受溶剂不足因素影响不明显，可以顺利溶出，而溶解度较小的蛋白的溶出会受到较大影响，不易溶出。
[0038]利用此现象，我们发明了依靠盐析和部分溶解洗涤法纯化IFN- τ包涵体蛋白的方法。本发明方法中，目的蛋白及杂蛋白的溶解要比单纯的盐析沉淀的复溶更复杂:因为本方法中引入了溶剂不足这一影响因素，使目的蛋白与杂蛋白的溶解度差异在上清和沉淀的分配上得到体现，从而可以用分离上清和沉淀的方法分离杂蛋白和目的蛋白，提高目的蛋白纯度。
[0039]实验证明此发 明方法简单有效，经过三次部分溶解法洗涤沉淀后，目的蛋白纯度由44.1%升至90.3%,目的蛋白损失量小。结果如下:
[0040]将以上各步骤获得的沉淀进行SDS-PAGE电泳，得到图1所示的SDS-PAGE图谱，其中条带最明显处对应的是21KD的位置，即目的条带。图中共有5个泳道，分别对应:1:硫酸铵沉淀前的包涵体蛋白溶液；2:45%百分饱和度硫酸铵盐析所获沉淀；3:将泳道2沉淀部分溶解后弃上清所余沉淀；4:将泳道3沉淀部分溶解后弃上清所余沉淀；5:将泳道4沉淀部分溶解后弃上清所余沉淀(注:以上泳道样品是是各沉淀以8Μ尿素充分溶解并离心后所获上清)。将图1SDS-PAGE图谱用Bandscan5.0软件分析得到图2，软件中点击图中目的条带，得到图3，图3以表格形式显示了各泳道中目的蛋白纯度。各泳道名称、目的蛋白纯度及所余沉淀体积变化如表1总结所示。表1可以看出，经常规硫酸铵沉淀后，目的蛋白纯度由沉淀前的30.5%升至44.1 %，而用包涵体溶解液将沉淀经过3次部分溶解法纯化后，目的蛋白纯度由44.1 %逐步升至58.6%, 74.0%,90.3%。结合沉淀体积分析显示:此发明方法目的蛋白损失量小。
[0041 ] 表1SDS-PAGE图谱中各泳道的目的蛋白纯度及所余沉淀体积变化[0042]
【权利要求】
1.盐析和部分溶解洗涤法纯化IFN-τ包涵体蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)表达蛋白质的工程菌发酵后，收集、裂解菌体，然后收集、洗涤包涵体，并用包涵体溶解液溶解包涵体，再以40%饱和度硫酸铵溶液进行盐析沉淀； 2)取用盐析沉淀同体积的包涵体溶解液，以部分溶解方式溶解盐析沉淀，离心后检测上清中的目的蛋白纯度，丢弃上清，留取沉淀； 3)将所留沉淀重复进行步骤2)操作，重复2-4次，最后将剩余沉淀充分溶解并复性，即可获得闻纯度闻活性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的盐析和部分溶解洗涤法纯化IFN-τ包涵体蛋白的方法，其特征在于，所述步骤I)中溶解包涵体的包涵体溶解液成分为:Bis-Tris20mM、Urea8M、EDTAlOmM、DTTlOmM用去离子水溶解，然后用盐酸调pH值到5.8。
3.根据权利要求2所述的盐析和部分溶解洗涤法纯化IFN-τ包涵体蛋白的方法，其特征在于，所述步骤I) 40%饱和度硫酸铵溶液配制如下:以包涵体溶解液为溶剂配制饱和硫酸铵溶液，加Bis-Tris至浓度30mM，浓硫酸调pH值至5.8。
4.根据权利要求1所述的盐析和部分溶解洗涤法纯化IFN-τ包涵体蛋白的方法，其特征在于，所述步骤2)中的部分溶解方式为包涵体溶解液的用量不足以使盐析沉淀完全溶解，仅使其部分溶解。
5.根据权利要求1所述的盐析和部分溶解洗涤法纯化IFN-τ包涵体蛋白的方法，其特征在于，所述步骤3)中的重复次数由上清中目的蛋白的纯度来决定。
6.根据权利要求1所述的盐析和部分溶解洗涤法纯化IFN-τ包涵体蛋白的方法，其特征在于，所述步骤3)中将剩余沉淀`充分溶解的溶解液为包涵体溶解液。
【文档编号】C07K1/30GK103724421SQ201410013433
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】吕丽燕 申请人:吕丽燕