多功能模块融合蛋白及其在提高蛋白质类药物口服生物利用度中的应用的制作方法
【专利摘要】多功能模块融合蛋白及其在提高蛋白质类药物口服生物利用度中的应用，属于生物技术制药及基因工程【技术领域】。多功能模块融合蛋白由小肠闭锁开启模块、连接肽模块、特定酶解位点模块、蛋白质药物分子模块pH依赖组装-去组装肽模块组成。其中各功能模块的排列顺序可以依据具体的蛋白质药物分子模块的空间结构特点进行调整，且其中连接肽模块和特定酶解位点模块的数目和位置可以根据蛋白质药物模块的结构性质和操作人员的意愿进行灵活选择。该多功能模块融合蛋白在体内依据自身结构和蛋白质的理化性质实现目标蛋白质药物分子的保护、定点释放及辅助蛋白质药物透过小肠黏膜，提高蛋白质类药物的口服生物利用度。
【专利说明】多功能模块融合蛋白及其在提高蛋白质类药物口服生物利用度中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术制药及基因工程【技术领域】，具体涉及一种具有蛋白质类药物分子、PH依赖组装-去组装肽、特定酶解位点肽、连接肽和小肠闭锁开启肽五种功能模块的多功能模块融合蛋白，通过口服该多功能模块融合蛋白，可以提高蛋白质类药物口服生物利用度。
【背景技术】
[0002]蛋白 质多肽类药物(如胰岛素、肿瘤抑制因子、降钙素等)在临床的应用越来越多，他们具有较好的发展前景。目前，蛋白质多肽药物主要是通过注射方式进行给药，频繁给药给患者带来不便于痛苦。口服给药时最简单和最方便的形式，患者也更易于接受口服剂型药物，可以用口服给药替代注射给药的方式进行给药。目前国内外市场上的蛋白质多肽药物主要是有环孢菌素A、去氨加压素、胸腺肽等。通常蛋白质多肽的口服给药的生物利用度低于1%，这限制了蛋白质多肽药物口服给药的研发。
[0003]蛋白质多肽类药物口服生物利用度低主要与如下因素有关:小肠黏膜上皮细胞屏障、蛋白酶解、环境PH值变性及肝的首过作用。下面对这些因素分别进行分析与阐述:
[0004]I小肠黏膜上皮屏障:人体内小肠黏膜上皮细胞间孔径为0.4nm,只能通过氨基酸、二肽、三肽，蛋白质多肽药物分子分子量较大、脂溶性差，难于透过膜孔进入血液循环。
[0005]为解决这一难题，目前人们主要采用Ca2+和Zn2+离子螯合剂降低肠道内这两种离子的浓度，使得肠道黏膜细胞之间的紧密连接开放，蛋白质多肽类药物分子可以再肠道黏膜细胞间紧密连接开放时穿过肠道黏膜进入血液，从而提高其生物利用度。
[0006]Fasano等人发现闭锁小带毒素蛋白可以作用于闭锁小带的肌动蛋白增加整个肠道细胞紧密连接的通透性，在不损害整个小肠的完整性与功能的前提下提高蛋白质多肽药物透过小肠黏膜的能力，闭锁小带毒素蛋白仅对小肠和十二指肠的受体有效而不作用于直肠和结肠，不影响全肠道功能的完整性或功能，它的细胞内作用具有时间、剂量依赖性和部位限定性，是安全可逆的。他们发现当闭锁小带毒素蛋白与目标蛋白质药物分子以5:2或2:1的比例物理混合时，实验动物呈现最大的蛋白质药物生物利用效率。
[0007]2酶解与酸性:胃酸pH值在I~2.5之间，许多肽类药物在这种条件下失去其生物活性，胃蛋白酶在此条件下可以降多数肽类药物降解成序列较短的肽，后者进入肠道后进一步被胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶等多种酶降解成小分子氨基酸，降解后肽类药物时期其生物活性。
[0008]为解决这一难题，目前人们主要使用聚丙烯酰胺衍生物卡波姆、聚卡波菲对消化道酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶等)的抑制效果，研究表明卡波姆和聚卡波菲是通过竞争性结合上述消化道酶执行其生物活性所必须的二价阳离子Zn2 +和Ca2 +来实现抑制这些消化道酶活性的。
[0009]3首过效应和吸收部位:肝脏、肠道的刷状缘、肠皮细胞溶酶体均参与首过效应，胆汁内容物、胃肠道表面的黏液层和不流动水层的机械屏障作用以及肽类药物自身构象的不稳定性都是导致多肽药物口服生物利用度低的原因。
[0010]为了解决这些因素的影响，人们对多肽药物的亲脂性、电荷数、等电点、分子大小、化学稳定性以及载体的亲和力等等进行了改造。如:利用VB12与10个氨基酸残基一下的小肽连接，提高药物的通过受体介导促进吸收；利用脂类诸如胆酸、脂肪酸修饰多肽，提高多肽药物的脂溶性增加肽类与Caco-2细胞结合从而提高药物的口服利用率和生物利用度；将多肽药物与大分子如蛋白质和其它聚合物结合，在不改变上皮细胞机能的前体下提高药物分子的吸收。
[0011]除了对药物分子自身结构进行改造外，人们还对药物组成和配方进行了调节，t匕如在药物中添加吸收促进剂和酶抑制剂，这一研究领域主要是通过调整多肽药物的渗透性和可消化性来改善药物自爱胃肠道的吸收状况，具体内容在前文已经有所叙述。[0012]除了上述两点，人们还对药物进行了剂型研究:利用高分子物质做肠溶衣在口服多肽类药物中应用较为广泛。用Eudragit S100、用偶氮聚合物、马酸一乙交酯一丙交酯共聚物、壳聚糖及其衍生物等聚合物在蛋白质药物口服给药的研发中起到了显著的效果；
[0013]结肠定位给药技术，利用结肠面积大，药物停留时间长，蛋白水解酶含量低等优点，开发PH依赖型和时滞型定位给药系统。
【发明内容】
[0014]本发明的目的是提供一种仅依赖蛋白质自身结构和理化性质的提高蛋白质药物口服给药生物利用度的多功能模块融合蛋白，该多功能模块融合蛋白在体内依据自身结构和蛋白质的理化性质实现目标蛋白质药物分子的保护、定点释放及辅助蛋白质药物透过小肠黏膜，提高蛋白质类药物的口服生物利用度。
[0015]本发明所述的多功能模块融合蛋白是以连接肽模块连接蛋白质药物分子模块、小肠闭锁开启模块、PH依赖组装-去组装模块及特定酶解位点模块；以pH依赖组装-去组装肽模块实现多功能模块融合蛋白对蛋白质药物分子模块的保护及定点暴露；以特定酶解位点肽模块实现多功能模块融合蛋白在消化道特定区域水解释放多功能模块融合蛋白内部的蛋白质药物分子模块、小肠闭锁开启肽模块、PH依赖组装-去组装肽模块、连接肽模块；以小肠闭锁开启肽模块开启小肠粘膜细胞表面的特定细胞通路，打开小肠闭锁结构，辅助蛋白质药物分子模块进入小肠粘膜孔道，提高蛋白质药物的生物利用效率。本发明可以用于蛋白质类药物口服生物利用度的多功能模块融合蛋白的构建和应用。
[0016]与【背景技术】相比:
[0017]I)利用pH依赖组装-去组装肽模块实现多功能模块融合蛋白在胃酸性环境中，依据自身结构及理化性质，形成基于蛋白质多肽链间弱相互作用的组装体，组装体内部的多功能模块融合蛋白及多功能模块融合蛋白内的蛋白质药物分子模块不受环境PH值影响而变性和不受胃蛋白酶降解，提高蛋白质药物口服给药时的生物利用度；
[0018]利用pH依赖组装-去组装肽模块实现多功能模块融合蛋白经胃形成的组装体在肠道内的去组装，使得多功能模块融合蛋白分子从前述组装体内解离开来，使得多功能模块融合蛋白内部的特定酶解位点肽模块得以充分暴露；
[0019]pH依赖组装-去组装肽模块用以实现多功能融合模块融合蛋白的pH依赖型和时滞型定位给药功能。
[0020]2)利用连接肽模块连接其它各个功能模块区域构建多功能模块融合蛋白，连接肽的存在保证了多功能模块融合蛋白中各个功能模块在蛋白质生物合成和折叠过程中以自身固有的折叠及组装规律进行二级、三级结构的实现，以单独的结构域存在在多功能模块融合蛋白结构中；
[0021]3)利用特定酶解位点肽模块实现多功能模块融合蛋白在小肠内通过蛋白水解酶内肽酶(meprin) (EC.3.4.24.18)进行水解，水解后释放多功能模块融合蛋白中小肠闭锁开启肽模块和蛋白质药物分子，通过特定酶解位点肽模块与内肽酶之间的相互作用，拉近多功能模块融合蛋白与小肠黏膜的距离，增加小肠闭锁开启肽模块接触小肠闭锁通道信号通路的概率，拉近药物分子与小肠闭锁通道的距离，提高蛋白质药物口服给药时的生物利用度；
[0022]4)利用小肠闭锁开启肽模块实现开启小肠闭锁通道，该模块的肽链是来自闭锁小带毒素蛋白，E265-F399，是闭锁小带毒素蛋白结合肠道闭锁小带肌动蛋白开启小肠黏膜细胞间紧密连接通道的核心功能区域，该模块在融合蛋白中的作用在于实现提高蛋白质药物分子进入体内的效率。小肠闭锁开启肽模块具有安全、稳定、严格化学剂量比的优点，不会引发腹泻、发烧及肠胃不适。
[0023]5)多功能模块融合蛋白的基因可以通过基因合成公司化学合成，在多功能模块融合蛋白基因的启动子及基因两侧的多克隆酶切位点可以随着具体的科研和生成需求，按照所选用的基因载体、表达宿主的设计需求进行选择，具体的选择规则及方法参见各个载体及宿主的使用说明书。基因载体的选择同时受到多功能模块融合蛋白基因的大小限制，多功能模块融合蛋白中目的蛋白质药物分子的串联重复次数与基因载体的装载量有关，基因载体装载量限制参见载体自身说明书。
[0024]6)在蛋白质药物分子模块与连接肽模炔基因序列间可以引入限制性内切酶位点，限制性内切酶位点的引入可以方便用新的蛋白质药物分子的基因替换现有的蛋白质药物分子的基因，限制性内切酶的选择及酶解位点的引入是本领域为人所熟知的知识和技术，相关信息可以在基因工程技术手册和相关文献中获得。
[0025]如图1所示，本发明所述的多功能模块融合蛋白由小肠闭锁开启模块、连接肽模块、特定酶解位点模块、连接肽模块、蛋白质药物分子模块、连接肽模块、特定酶解位点模块、连接肽模块和PH依赖组装-去组装肽模块组成，蛋白质药物分子模块的序列与具体的蛋白质药物分子的氨基酸序列有关。其中各功能模块的排列顺序可以依据具体的蛋白质药物分子模块的空间结构特点进行调整，且其中连接肽模块和特定酶解位点模块的数目和位置可以根据蛋白质药物模块的结构性质和操作人员的意愿进行灵活选择。
[0026]其中pH依赖组装-去组装肽模块的序列为(SEQ ID NO: 2)η，η值是该pH依赖组装-去组装肽模块的串联重复次数，n=2~6，η值与目标蛋白质药物分子的分子量大小有关，目标蛋白质药物分子的分子量越大，η值越大。
[0027]连接肽模块的序 列为(SEQ ID Ν0:4) ^,πι值是连接肽模块的串联重复次数，m=2~10，m值与目标蛋白质药物分子的分子量大小有关，目标蛋白质药物分子的分子量越大，m值越大。
[0028]特定酶解位点模块的肽序列为SEQ ID NO: 3，该序列是内肽酶的高选择偏好性底物，内肽酶在人类的肠道和肾脏含量较高，肠道中定位于肠道黏膜。
[0029]本发明中所说蛋白质药物分子模块是指由核酸编码的、且由核糖体合成的蛋白质-多肽药物，具体包括:生长素、重组P53蛋白、胰岛素、肿瘤坏死因子、各种单克隆抗体、蛋白质结构的疫苗、受体-抗体融合蛋白、神经生成因子、血管内皮抑制素、凋亡素等国内及国际上已批准上市的蛋白质多肽类药物。
[0030]蛋白质药物分子模块中，蛋白质药物分子序列的串联重复次数与基因载体的外源DNA序列装载量有关，一般说来大于20kb的质粒很难导入受体细胞，即，编码本发明所述的多功能融合蛋白基因的核苷酸数目与基因载体自身的核苷酸数目的总和需要小于20kb，具体到个别的基因载体上会有细节的差别，基因载体的装载量是本领域所熟知的，可在载体的说明书和相关基因工程技术手册上获得。
[0031]进一步，还可以蛋白质药物分子模块与连接肽模块的基因序列间引入核酸限制性内切酶的酶切位点，该酶切位点有助于用新的蛋白质药物分子的基因序列置换现有的蛋白质药物分子的基因序列，限制性酶切位点的选择和引入与具体的蛋白质药物分子模块的氨基酸序列、融合蛋白基因所要引入的基因载体有关，是本领域所熟知的技术，可以在基因工程技术手册和相关文献中获得。
[0032]小肠闭锁开启肽模块，肽序列为SEQ ID NO: 1，该序列的作用在于开启小肠闭锁通路，使得肠道内的目的蛋白药物分子可以穿过肠道进入血液。
[0033]按照上述操作步骤，构建多功能模块融合蛋白的氨基酸序列，按照核酸编码氨基酸的密码子翻译多功能 模块融合蛋白的基因序列，根据所要选择的蛋白表达宿主及基因载体体系说明书和相关标准教材的指导，选择宿主物种偏好的遗传密码子进行基因序列的优化。
[0034]多功能模块融合蛋白的基因经合成公司化学合成整合到所需的基因载体中，并转入所需的宿主。常见基因载体为PET系列、pUC系列、pBR系列、pGEX系列、pBEn系列、pSEn系列、pPIC系列、pACYC系列、PSV系列、PCMV系列、pMT系列、pMK系列、pSB**5系列、BBa系列、pSAM系列、T1、pSLPl、pSAM2等，常见宿主为大肠杆菌、链霉菌、运动发酵单孢菌、枯草杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞及植物细胞等。
[0035]按照上述宿主及载体的使用说明书及相关文献，进行目的多功能模块融合蛋白的表达及纯化。
[0036]将目标蛋白药物分子与多功能模块融合蛋白分子分别进行口服给药，依据目标蛋白质药物分子的生物活性检测方法进行生物利用度检测，计算多功能模块融合蛋白口服时，目标药物分子的生物利用度。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1:本发明所述的多功能模块融合蛋白的结构示意图；
[0038]图2:实施例1所述的多功能模块融合绿色荧光蛋白的结构示意图；
[0039]图3:实施例1中涉及的pGFPuv-WG-GFPuv质粒双酶切验证图；其中，1:双酶切产物，M:DL2000o
[0040]图4:实施例1中所述的多模块融合绿色荧光蛋白基因的正向测序谱图；
[0041]图5实施例1中所述的多模块融合绿色荧光蛋白基因的反向测序图:[0042]图6:实施例1中涉及的GFPuv、多模块融合绿色荧光蛋白、小肠闭锁开启肽模块蛋白的蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；分离胶浓度为12%，浓缩胶5%。I至6分别是小肠闭锁开启肽模块蛋白、GFPuv蛋白、表达小肠闭锁开启肽模块蛋白的菌裂解液、表达融合蛋白的菌裂解液、宽分子量蛋白 MakeKBroad range protein molecular weight marker)和多模块融合绿色荧光蛋白。
[0043]图7:实施例1中所述的GFPuv蛋白的荧光光谱。
[0044]图8:实施例1中所述的GFPuv蛋白509纳米处的荧光强度强度与蛋白含量的关系曲线。
【具体实施方式】
[0045]实施例1:
[0046]多模块融合绿色荧光蛋白及绿色荧光蛋白口服给药生物利用度比较[0047]绿色荧光蛋白(GFPuv，绿色荧光蛋白GFP最早是在水母中发现的，GFPuv是人工改造的GFP蛋白，它在原核生物中表达量高，我们用的GFPuv是pGFPuv质粒上带有的)在紫外光照射下具有绿色荧光，一定浓度范围内，荧光信号强度与蛋白质的含量成正比，本实施列以绿色荧光蛋白(GFPuv)作为目标药物蛋白分子，研究多功能模块融合蛋白替代目的蛋白药物分子给药时，蛋白质药物口服生物利用度的变化。
[0048]多模块融合绿色荧光蛋白的一级序列排布方式及相对位置如图2所示，其中，
[0049]I)小肠闭锁开启肽模块SEQ ID NO:1 ；
[0050]2) pH依赖组装-去组装肽模块(SEQ ID NO: 2) n的η值重复次数为2 ；
[0051 ] 3)特定酶解位点模块SEQ ID NO:3 ；
[0052]4)连接肽模块(SEQ ID NO:4) m的m值重复次数为6 ；
[0053]5)蛋白质药物分子模块选择绿色荧光蛋白GFPuv，GFPuv与其它蛋白质药物分子的共性为它们都是核酸编码的，经由核糖体合成的蛋白质，优点在于，GFPuv同时具有荧光光谱性质，可以在极低的浓度下，较为便捷的检测。GFPuv的氨基酸其序列为SEQ ID NO:5 ；
[0054]6)根据所要选择的蛋白表达宿主及基因载体体系说明书和相关标准教材的指导，选择宿主物种偏好的遗传密码子进行基因序列的优化。序列优化后的基因序列如SEQ IDN0:6所示(外源蛋白想要在宿主中表达，就需要采用宿主的遗传密码子以及宿主偏好的遗传密码子，这个选择宿主偏好的密码子和宿主的密码子的过程就是优化，不经过优化的基因序列在宿主中很难正确表达成目标蛋白质的)。
[0055]7)基因构建完成后通过基因合成公司合成并转入pGFPuv载体中构建成含有融合蛋白基因和PGFPuv载体的重组表达载体pGFPuv-WG-GFPuv，将重组表达载体pGFPuv-WG-GFPuv通过电转染方法导入感受态大肠杆菌BL21 (DE3)，利用大肠杆菌DH5 α对目的蛋白进行表达。
[0056]本实施例中使用大肠杆菌BL21 (DE3)细胞为宿主菌细胞，重组表达载体pGFPuv-WG-GFPuv可转化大肠杆菌BL21 (DE3)细胞，并使用硫酸卡那霉素筛选出能稳定表达的单克隆细胞株，获得表达多功能模块融合绿色荧光蛋白的基因工程菌株。具体操作:
[0057]将1.0微克的重组表达载体pGFPuv-WG-GFPuv加入到100微升大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，混匀冰浴30分钟，42摄氏度水浴中保温I分钟，立即取出放置在冰浴中冷却2分钟，加入800微升37摄氏度预热的LB液体培养基，37摄氏度下150转每分钟培养60分钟，取100微升培养液涂布于含硫酸卡那霉素的LB琼脂培养皿上，37摄氏度培养16小时后获得单转化菌落，挑取单转化菌落进行测序及双酶切验证。
[0058]从单转化菌落调菌放入20毫升加入了 20g/L葡萄糖，25ug/L硫酸钠卡那霉素和200ug/L氨苄青霉素的LB培养基中，37摄氏度240转每分钟培养，培养至600纳米光吸收值达到0.6,取5毫升菌液利用普洛麦格质粒小提试剂盒(PureYield?Plasmid MiniprepSystem目录号A1223)进行质粒提取，5 μ I质粒，加入I微升限制性内切酶Hind III和I微升限制性内切酶Xba I，加入2微升10倍浓度缓冲液，11微升双蒸水，混匀后在37摄氏度水浴中反应I小时后，电泳检测酶切产物。如图3可知，条带M为DL2000分子量标准，条带I为质粒双酶切结果，从电泳图中可以看到质粒双酶切后在1000bp到2000bp间能看到一个明亮的条带，该条带对应的分子大小与本发明中多功能模块融合绿色荧光蛋白基因(SEQID NO:6)大小相同，说明此质粒已构建完成。
[0059]基因正向测 序测序结果见图4，从测序文件第40位碱基开始到第740个碱基截止这个范围的核酸序列测序结果与SEQ ID NO:6序列从第I位碱基开始至701位相似性达到100% ;基因反向测序测序结果见图5，从测序文件第68位碱基开始到第755位碱基截止这个范围的核酸序列测序结果与SEQ ID NO:6序列从639位碱基开始至1326位碱基相似性达到100%。这说明pDFPuv-WG-FGPuv质粒中多模块融合绿色荧光蛋白的序列是本专利实施例I中的SEQ ID NO:6序列。
[0060]挑取经双酶切和测序证明目的基因转入宿主的菌体，进行扩增表达目的蛋白。
[0061 ] 小肠闭锁开启肽模块蛋白纯化流程
[0062]1、接载有小肠闭锁开启蛋白模块(SEQ ID NO:1)蛋白质基因的pQE30质粒的大肠杆菌BL21 (DE)3于LB培养基中加入20g/L葡萄糖，25ug/L硫酸钠卡那霉素和200ug/L氨苄青霉素，37摄氏度240转每分钟培养，直到600纳米光吸收值达到0.7到0.9。
[0063]2、加入2mM IPTG诱导外源蛋白表达，37摄氏度240转每分钟，2小时培养。4°C，相对离心力为4000，离心20分钟收集菌体。测沉淀细胞质量。
[0064]3、按照5到8毫升每克比例降宿主菌细胞与裂解液混合。裂解液组成(6Mguanidine-HCl, 0.1M sodiumphosphate, 0.01M Tris-HCl, ρΗ8.0)。揽拌子 + 电磁揽拌器,室温条件下搅拌I小时进行裂菌。4°C，10，OOOg离心30分钟，收集上清液。
[0065]4、按照I克菌体湿重采用I毫升柱料的比例进行上清液与柱料的混合，室温下混合I小时。
[0066]柱料和上清液的混合液装入柱子，柱子规格是长5厘米，内径1.5厘米。
[0067]5、配制溶液
[0068]柱子用裂解液(6Mguanidine-HCl, 0.1M sodium phosphate, 0.01MTris-HCl, pH8.0)> bufferB(8M urea, 0.1M sodium phosphate, 0.01MTris-HCl, pH8.0), buffer C(8M urea, 0.1M sodium phosphate, 0.01M Tris-HCl, pH6.3)?用每个缓冲液洗涤柱子的时候，当流出液的0D280小于0.01时更换缓冲液。
[0069]6、用 250mM 咪唑 buffer D(250mM 咪唑，8M urea, 0.1M sodium phosphate, 0.01MTris-HCl, pH6.3)洗涤并收集小肠闭锁开启肽模块蛋白。
[0070]7、将小肠闭锁开启肽模块蛋白溶液加入截留分子量3000道尔顿的透析袋中，在5L磷酸钠缓冲液(pH6.3)中分别加入6M、4M、2M、0M尿素，梯度透析。
[0071]上述蛋白液经过4°C，相对离心力为10，000，离心30分钟，收集上清液。最终获得小肠闭锁开启肽模块蛋白。蛋白纯度及分子量见图6，从蛋白质SDS-PAGE电泳图上可知，条带5是宽分子量蛋白标准分子量，条带I是小肠闭锁开启肽模块蛋白，其分子量在标准分子量条带5的IOKD条带附近，这与该模块蛋白的大小，147个氨基酸残基(SEQ ID N0:1)相对应，从条带3即表达小肠闭锁开启肽模块蛋白的菌裂解液中可以看出，此时菌体中大量表达了目标蛋白，在电泳图中对应的条带颜色较深，条带较粗。
[0072]多功能模块融合绿色光蛋白纯化流程
[0073]1、接载多功能模块融合绿色荧光蛋白基因(SEQ ID N0:6)的pGFPuv-WG-GFPuv质粒的大肠杆菌BL21 (DE) 3于LB培养基中，加入20g/L葡萄糖，25ug/L硫酸钠卡那霉素和200ug/L氨苄青霉素，37摄氏度240转每分钟培养，直到600纳米光吸收值达到0.7到0.9。
[0074]2、加入2mM IPTG诱导外源蛋白表达，37摄氏度240转每分钟，2小时培养。4摄氏度下，相对离心力为4，000g，离心20分钟收集菌体。测沉淀细胞质量。
[0075]3、按照5到8毫升每克比例混合宿主菌细胞与裂解液混合。裂解液组成(6Mguanidine-HCl, 0.1M sodiumphosphate, 0.01M Tris-HCl, ρΗ8.0)。100 转每分钟，室温条件下搅拌I小时进行裂菌。4摄氏度，相对离心力为10，000，离心30分钟，收集上清液。
[0076]4、按照I克菌体湿重采用I毫升柱料的比例进行上清液与柱料的混合，室温下混合I小时。
[0077]柱料和上清液的混合液装入柱子，柱子的规则是长5厘米，内径1.5厘米。
[0078]配制溶液
[0079]柱子用裂解液(6Μguanidine-HCl, 0.1M sodium phosphate, 0.01MTris-HCl, pH8.0)> bufferB (8M urea, 0.1M sodium phosphate, 0.01M Tris-HCl, pH8.0), >buffer C (8M urea, 0.1M sodium phosphate, 0.01M Tris-HCl, pH6.3).每个缓冲液洗漆的时候保证0D280低于0.01
[0080]6、用 250mM 咪唑 buffer D(250mM 咪唑，8M urea, 0.1M sodium phosphate, 0.01MTris-HCl, pH6.3)洗涤并收集融合蛋白。
[0081]7、将融合蛋 白溶液加入截留分子量3000道尔顿的透析袋中，在5升磷酸钠缓冲液(pH6.3)中分别加入6M、4M、2M、0M尿素，梯度透析。
[0082]上述蛋白液经过4°C，10，OOOg离心30分钟，收集上清液。最终获得多功能模块融合绿色光蛋白。蛋白纯度及分子量见图6。蛋白纯度及分子量见图5，从蛋白质SDS-PAGE电泳图上可知，条带5是宽分子量蛋白标准分子量，条带6是多功能模块融合绿色荧光蛋白，其分子量在标准分子量条带5的51KD条带附近，这与该模块蛋白的大小，1326个碱基即442个氨基酸残基(SEQ ID NO:6)相对应，从条带4即表达多功能模块融合绿色荧光蛋白的菌裂解液中可以看出，此时菌体中大量表达了目标蛋白，在电泳图中对应的条带颜色较深，条带较粗。
[0083]GFPuv纯化流程
[0084]1、收菌及裂菌
[0085]接载有GFPuv蛋白基因(SEQ ID NO: 5)的pGFPuv质粒的大肠杆菌BL21 (DE)3于LB培养基中，加入20g/L葡萄糖，25ug/L硫酸钠卡那霉素和200ug/L氨苄青霉素，37摄氏度240转每分钟培养，直到600纳米光吸收值达到0.7到0.9。
[0086]2、加入2mM IPTG诱导外源蛋白表达，37摄氏度240转每分钟，2小时培养。4摄氏度下，相对离心力为4000g，离心30分钟，收集菌体。测沉淀细胞质量。
[0087]3、按照5到8毫升每克比例将菌体加入0.1摩尔每升的pH为7.4的磷酸缓冲液中，超声裂菌20分钟。再于4摄氏度，相对离心力为10000，离心30分钟，收集上清。
[0088]4、硫酸铵分级沉淀
[0089]于上述裂菌液中，缓缓加入硫酸铵粉末，使得硫酸铵终饱和度为40%，置于4摄氏度中静置2小时后，4摄氏度，相对离心力为10000，离心30分钟，取上清液。在该上清液中继续缓缓加入硫酸铵粉末，使得硫酸铵终饱和度为80%，置于4摄氏度中静置2小时，4摄氏度，相对离心力为10000，离心30分钟，弃上清，将沉淀以0.1摩尔每升的pH7.4的磷酸缓冲液溶解。
[0090]5、透析除盐
[0091]将上述蛋白液装入活化的透析袋中，置于I升0.1摩尔每升pH7.4的磷酸缓冲液中，透析3小时，重复一次，再将透析两次后的蛋白液置于3升0.1摩尔每升pH7.4的磷酸缓冲液中，透析过夜。
[0092]6、DEAE阴离子交换层析及蛋白液浓缩
[0093]装柱后，以0.1摩尔每升pH7.4磷酸缓冲液平衡过夜，约消耗3个柱体积的缓冲液。将层析柱与检测器连接后，开始上样，上样体积约为25毫升。再以起始缓冲液平衡一个柱体积。随后增加氯化钠浓度，使其浓度3小时内，从O摩尔每升线性增加为2摩尔每升。收集洗出峰对应的样品管。荧光检测，荧光检测条件为，经Shimadzu RF-5301PC荧光光谱仪，在Ex=385nm，Em=509nm, Ex/Em=3/5条件下测定，确保缓冲过柱的平衡缓冲液中无荧光信号。
[0094]收集样品后，以截留分子量为3000道尔顿的超滤离心管浓缩所收集样品至3ml。
[0095]7、S-100凝胶过滤层析
[0096]装柱后，以0.1摩尔每升pH7.4磷酸缓冲液平衡24小时。平衡后，打开上盖，待液体下降至于柱面相切时，缓慢加入1.5毫升浓缩后的蛋白液，待其下降至与柱面再次相切时，多次加入缓冲液，使样品缓缓进入柱中而尽量不被过分稀释。将层析柱与检测器连接，以起始缓冲液洗柱。收集洗出峰对应的样品管。
[0097]荧光检测，确保所收集样品管有在395nm紫外光激发下，在509nm处显示出很强的荧光信号(见图7)，荧光的强度与蛋白质的量成正比(见图8)，y=5.lOx+156.59R2=0.99，y是荧光强度，X是蛋白含量。这一点与文献报道一致，荧光蛋白的分子量见图6，从蛋白质SDS-PAGE电泳图上可知，条带5是宽分子量蛋白标准分子量，条带2是GFPuv蛋白，其分子量在标准分子量条带5的25KD条带附近，这与该模块蛋白的大小，258个氨基酸残基(SEQID NO: 5)相对应，因GFPuv具有较强的荧光光谱信号，所以GFPuv蛋白在宿主菌内的表达不需要通过对菌裂解液做电泳进行验证。
[0098]将绿色荧光蛋白、多模块融合绿色荧光蛋白通过口服给药的方式给SD大鼠进行给药:体重大于300克的SD雄性大鼠30只，正常给食水饲养3天后，随即分为2组，用灌胃器采用经口给药方式进行给药。一组为融合蛋白组，用本发明制备的多模块融合绿色荧光蛋白进行给药，用药量为5.06mg/kg，平均每只实验动物接受的多模块融合蛋白为3.735 X 10_8摩尔，相当于绿色荧光蛋白给药量为3.735 X 10_8摩尔；一组为单纯蛋白组，用绿色荧光蛋白自身直接给药，用药量为3.llmg/kg，平均每只实验动物给予3.735X 10_8摩尔绿色突光蛋白。经 Shimadzu RF-5301PC 突光光谱，在 Ex=385nm, Em=509nm, Ex/Em=3/5 条件下测定，根据图7中所示的GFPuv蛋白509纳米处的荧光强度强度与蛋白含量的关系曲线所示荧光蛋白含量和荧 光强度关系曲线计算，可知多模块融合绿色荧光蛋白给药时，绿色荧光蛋白在大鼠体内的量为给药量的18.6%，即通过多功能模块融合蛋白给药，绿色荧光蛋白的生物利用度为18.6%，远优于单纯蛋白给药(<1%)。
[0099]综上，本发明中涉及的多功能模块融合蛋白可以极大的提高蛋白质药物的口服生物利用度，其作用效果远高于蛋白直接口服给药，也优于简单物理混合给药。具有较高的经济价值与社会价值。
【权利要求】
1.一种多功能模块融合蛋白，其特征在于: 由小肠闭锁开启模块、连接肽模块、特定酶解位点模块、连接肽模块、蛋白质药物分子模块、连接肽模块、特定酶解位点模块、连接肽模块和PH依赖组装-去组装肽模块组成， pH依赖组装-去组装肽模块的序列为(SEQ ID NO: 2) η，η值是该pH依赖组装-去组装肽模块的串联重复次数，n=2~6 ; 连接肽模块的序列为(SEQ ID N0:4) m，m值是连接肽模块的串联重复次数，m=2~10 ； 特定酶解位点模块的肽序列为SEQ ID NO:3 ； 蛋白质药物分子模块是指由核酸编码的、且由核糖体合成的蛋白质-多肽药物； 小肠闭锁开启肽模块，肽序列为SEQ ID ΝΟ:1 ； 并按照核酸编码氨基酸的密码子翻译上述多功能融合蛋白的基因序列，根据所要选择的蛋白表达宿主及基因载体，选择宿主物种偏好的遗传密码子进行基因序列的优化。
2.如权利要求1所述的一种多功能模块融合蛋白，其特征在于:基因载体为PET系列、pUC系列、pBR系列、pGEX系列、pBEn系列、pSEn系列、pPIC系列、pACYC系列、pSV系列、pCMV 系列、pMT 系列、pMK 系列、pSB**5 系列、BBa 系列、pSAM 系列、T1、pSLPl 或 pSAM2 ;表达宿主为大肠杆菌、链 霉菌、运动发酵单孢菌、枯草杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。
3.如权利要求1所述的一种多功能模块融合蛋白，其特征在于:编码所述多功能融合蛋白基因的核苷酸数目与基因载体自身的核苷酸数目的总和小于20kb。
4.如权利要求1所述的一种多功能模块融合蛋白，其特征在于:在蛋白质药物分子模块与连接肽模炔基因间引入限制性内切酶位点。
5.如权利要求1所述的一种多功能模块融合蛋白，其特征在于:蛋白质药物分子模块为生长素、重组P53蛋白、胰岛素、肿瘤坏死因子、各种单克隆抗体、蛋白质结构的疫苗、受体-抗体融合蛋白、神经生成因子、血管内皮抑制素、凋亡素或蛋白质多肽类药物。
6.权利要求1-5任何一项所述的多功能模块融合蛋白在提高蛋白质类药物口服生物利用度中的应用。
【文档编号】C07K19/00GK103923216SQ201410165869
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】吕明, 郑璐, 周杰, 刘艳, 吴家安, 杨少林 申请人:吉林大学