一种海洋微藻来源的血管紧张素转化酶抑制肽的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种新型的血管紧张素转化酶抑制肽，即从球等鞭金藻中制备得到的一种ACE酶抑制肽，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO：1。本发明提供了一种海洋微藻来源的高活性血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法。目前血管紧张素转化酶抑制剂的来源主要是食品，以及紫菜等大型海藻，从饵料微藻中未见报道。本发明获得的一种具有独特结构的活性多肽，其结构为Tyr--Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys。该结构新颖，具有分子量小，易被人体吸收的特点。
【专利说明】一种海洋微藻来源的血管紧张素转化酶抑制肽
【技术领域】
[0001]本发明属于活性多肽筛选【技术领域】，具体涉及一种血管紧张素转化酶抑制肽，SP一种从海洋微藻球等鞭金藻中分离得到的血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽。
【背景技术】
[0002]血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme, ACE)是一种锌金属蛋白酶，是羧基二肽酶，是肾素-血管紧张素系统中重要的蛋白酶之一。对人体血压调节有着重要的作用，通过作用于血管紧张素I的末端去掉His-Leu生成血管紧张素II，它能够使动脉血管平滑肌收缩，迅速引起血压上升。抑制ACE活性是一种使血压下降的有效的方法。当前治疗高血压的药物大多是化学合成品，存在一些不良反应，如咳嗽、味觉功能紊乱及皮疹等副作用。食源性蛋白为原料制得的ACE抑制肽由于具有安全性高、毒副作用小等优点，是降压药物研发的重要方向。[0003]食品来源的ACE抑制剂由于其原料易得，一直受到人们的关注。如高冬芳等(食品科学，2011,32 (7):7)利用螺旋藻制备ACE抑制肽其IC5tl值为74.6 μ g/mL,但具体结构未知。刘淑集等(食品科学，2011，32(2):213)利用坛紫菜制备ACE抑制肽，其IC5tl值为
0.67mg/mL，其氨基酸结构也不确定。但是针对海洋微藻，特别是饵料微藻来源的ACE抑制肽方面的研究还未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种新型的血管紧张素转化酶抑制肽，即从球等鞭金藻中制备得到的一种ACE酶抑制肽，从而弥补现有技术技术的不足。
[0005]本发明首先提供一种多肽，其氨基酸序列为Tyr-Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys (SEQID NO:1)；
[0006]上述多肽作为血管紧张素转化酶抑制肽的应用，包括用于制备治疗高血压的制品;
[0007]所述的制品为包含有药理有效浓度的上述多肽的食品或药品；
[0008]本发明的多肽是从球等鞭金藻中分离的，具体分离步骤如下:
[0009](I)球等鞭金藻蛋白的制备:
[0010]将球等鞭金藻按照1:15加入到1.5%氯化钠溶液中，调整为pH为6.0-8.0，超声波提取，破碎后4°C、5000r/min离心15min,分离上清液；沉淀的藻泥加入氯化钠溶液超声波再提取2次，合并上述提取的上清液，冷冻干燥即为粗蛋白；
[0011]⑵酶解:
[0012]将步骤(1)中粗蛋白，按照酶和粗蛋白比为6:100加入酶，溶液pH调整为8.0，在温度为50°C的条件下进行酶解，酶解时间为3-6h ;酶解完成后在90°C下灭活酶lOmin，然后取上清液；
[0013](3)分离:[0014]取步骤(2)中酶解得到得上清液，用0.45μπι微孔滤膜过滤，将样品上样于平衡好的S印hadex G-25凝胶色谱柱(:φ2.6Χ 70 em )，用醋酸-醋酸钠缓冲液洗柱至220nm处吸收峰回到基线，用醋酸-醋酸钠缓冲液对样品进行洗脱，洗脱的流速是0.5mL/min。收集各个成分进行冷冻干燥并检测活性，在-20°C条件下保存；
[0015]⑷纯化:
[0016]取步骤(3)冷冻干燥的粉末，进过AKTA purifier纯化。流动相A相:纯水；B相:甲醇，从0-100%梯度洗脱，流速为l.0ml/min。检测波长为220nm，收集各个组分，冷冻干燥并检测活性。收集保留时间约为24min的色谱峰，冷冻干燥，得到氨基酸序列为Tyr-Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys的血管紧张素转化酶抑制肽。
[0017]本发明所述的一种血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法。与现有技术相比，本发明具有如下的优点:(I)本发明提供了一种海洋微藻来源的高活性血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法。目前血管紧张素转化酶抑制剂的来源主要是食品，以及紫菜等大型海藻，从饵料微藻中未见报道。(2)本发明获得的一种具有独特结构的活性多肽，其结构为Tyr--Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys。该结构新颖,具有分子量小，易被人体吸收的特点。
【专利附图】
【附图说明】[0018]图1:本发明血管紧张素转化酶抑制肽对原发性高血压大鼠(SHR)的治疗效果比较图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例进一步阐明本发明。
[0020]实施例1血管紧张素转化酶抑制肽的分离纯化
[0021](I)球等鞭金藻蛋白的制备:
[0022]将球等鞭金藻按照1:15(1克藻粉加入15毫升氯化钠溶液中)加入到1.5% (w/V)氯化钠溶液中，调整pH为7.0，超声波提取，破碎后高速冷冻离心41:、50001'/1^11离心15min，离心分离上清液，沉淀的藻泥加入氯化钠溶液超声波再进行破碎2次间隔时间为ls，合并上述破碎后所得的全部上清液，冷冻干燥即为粗蛋白。
[0023](2)酶解:
[0024]将步骤⑴中粗蛋白，按照酶和粗蛋白比为6:100加入酶活性为10000U/g的trypsin，溶液pH调整为8.0，底物蛋白的浓度为5.5g/100ml，在温度为50°C的条件下进行酶解，酶解时间为3h。酶解完成后在90°C下灭酶活lOmin，然后取上清液。
[0025](3)分离:
[0026]取步骤(2)中酶解得到得上清液，用0.45μπι微孔滤膜过滤，将样品上样于平衡好的Sephadex G-25凝胶色谱柱(φ2.6Χ70 cm ),用醋酸-醋酸钠缓冲液洗柱至220nm处吸收峰回到基线，用醋酸-醋酸钠缓冲液对样品进行洗脱，洗脱的流速是0.5mL/min。收集保留时间约为24min的色谱峰，冷冻干燥，得到血管紧张素转化酶抑制肽。
[0027](4)纯化:
[0028]取步骤(3)冷冻干燥的粉末,经过AKTA purifier纯化。流动相,A相:纯水；B相:甲醇，从0-100%梯度洗脱，流速为1.0ml/mino检测波长为220nm，收集各个组分，冷冻干燥并检测活性。
[0029](5)活性检测:
[0030]将ACE 底物 Hip-His-Leu 溶于 0.lmol/L 的硼酸盐缓冲液(含 0.3M NaCl, pH8.3)，配置成5mM的浓度。取50 μ L上述溶液与20 μ L ACE抑制肽混合，在37 °C恒温水浴中预热5min。随后加入10μ L上述ACE溶液，37°C反应30min。加入100 μ LlM HCl溶液终止反应，并加入硼酸盐缓冲液至0.5mL。所有测定都重复三次。ACE的抑制程度按如下公式计算:[0031 ] ACE 抑制活性 ％ = (Ab-Aa) / (Ab-Ac) X 100 %
[0032]式中:Aa:ACE及ACE抑制肽都存在的条件下的吸光度；Ab:ACE抑制肽不参与反应的条件下测得的吸光度'K =ACE不参与反应的条件下的吸光度。最终测定得到血管紧张素转化酶抑制肽的体外ACE抑制IC5tl为36.1 μ M0
[0033]实施例2血管紧张素转化酶抑制肽的序列分析
[0034]取实施例1制备得到的血管紧张素转化酶抑制肽，首先进行了该活性多肽的氨基酸成分分析，结果表明其主要氨基酸为Met、Lys> Leu三种氨基酸，也含有Tyr、Gly、Asp等。采用MALD1-T0F/T0F-MS/MS分析多肽的氨基酸序列，分析得到活性多肽分子量为839.4061Da,测定氛基酸序列为:Tyr-Met-Gly-Leu-Asp-Leu_Lys。对该结构进行了 De novo测序分析，结果与以上数据吻合，确认该多肽为Tyr-Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys (SEQ IDNO:1)，为新型的活性多肽结构。
[0035]实施例3血管紧张素转化酶抑制肽的效果
[0036]将实施例1中所获得的海洋微藻来源的降压肽直接灌胃到原发性高血压大鼠(SHR)，检测其对SHR血压的影响。实验选用大鼠24只，体重240 ± 20克，大鼠随机分成3个组，每组8只，其中设空白对照组(注射同样体积的生理盐水)、ACE酶抑制组和合成降压药卡托普利的阳性对照组。实验温度20°C，相对湿度70%，预饲养I周。给药剂量为IOmg/kg，时间24天，在第0、2、4、6、8h测定一次尾动脉收缩压。结果表明，ACE抑制肽组和空白对照组相比效果显著(P〈0.05)。对照组的大鼠血压基本稳定在180-190mmHg,而在实验组和阳性对照组大鼠的血压降低到165mmHg和155mHg ;结果表明本发明制备的血管紧张素转化酶抑制肽具有治疗高血压的效果。而且，采用人工合成方式合成的多肽(氨基酸序列为SEQ ID NO:1)对原发性高血压大鼠(SHR)也具有明显的治疗效果(图1)。
[0037]因此，本发明从球等鞭金藻中提取纯化制备得到具有血管紧张素转化酶抑制活性的多肽，具有很好的抗血压活性，并且安全性能高，具有广阔的应用前景。
【权利要求】
1.一种多肽，其特征在于，所述的多肽的其氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
2.权利要求1所述的多肽作为血管紧张素转化酶抑制肽的应用。
3.权利要求1所述的多肽在制备治疗或预防高血压的制品中的应用。
4.一种治疗或预防高血压的制品，其特征在于，所述的制品为包含有药理有效浓度的权利要求1所述的多肽的食品或药品。
5.权利要求1所述的多肽是从球等鞭金藻中分离的。
6.权利要求1所述的多肽的制备方法，其步骤如下: 1)球等鞭金藻蛋白的制备: 将球等鞭金藻按照1:15加入到1.5%氯化钠溶液中，调整为pH为6.0-8.0，超声波提取，破碎后4°C、5000r/min离心15min,分离上清液；沉淀的藻泥加入氯化钠溶液超声波再提取2次，合并上清液，冷冻干燥即为粗蛋白； 2)酶解: 将步骤I)中粗蛋白，按照酶和粗蛋白比为6:100加入酶，溶液pH调整为8.0，在温度为50°C的条件下进行酶解，酶解时间为3-6h ;酶解完成后在90°C下灭活酶lOmin，然后取上清液； 3)分离: 取步骤2)中酶解得到得上清液，用0.45 μ m微孔滤膜过滤，将样品上样于平衡好的Sephadex G-25凝胶色谱柱,用醋酸-醋酸钠缓冲液洗柱至220nm处吸收峰回到基线,用醋酸-醋酸钠缓冲液对样品进行洗脱，洗脱的流速是0.5mL/min ;收集各个成分进行冷冻干燥并检测活性，在-20°C条件下保存； 4)纯化: 取步骤3)冷冻干燥的粉末,进过AKTA purifier纯化,流动相A相:纯水；B相:甲醇，从0-100%梯度洗脱，流速为l.0ml/min，检测波长为220nm，收集各个组分，收集保留时间约为24min的色谱峰，冷 冻干燥完成制备。
【文档编号】C07K7/06GK103923177SQ201410172674
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月26日 优先权日:2014年4月26日
【发明者】徐年军, 吴昊, 孙雪, 余虹 申请人:宁波大学