截短的pcv2型衣壳蛋白orf2病毒样颗粒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一系列N端截短的PCV2型ORF2基因、其病毒样颗粒及制备方法、含经过截短的病毒样颗粒的疫苗及其在预防断奶仔猪多系统衰竭综合征感染中的用途。本发明截短的PCV-ORF2基因组装而成的病毒样颗粒，具有良好的免疫原性和保护性。本发明的制备纯化过程中，没有使用变性剂，目的蛋白的活性得到了最大程度的保护。
【专利说明】截短的PCV2型衣壳蛋白0RF2病毒样颗粒及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学【技术领域】，具体涉及一种猪圆环病毒2型衣壳蛋白基因及载体、菌株及其表达方法，和含该病毒样颗粒的疫苗及其在预防断奶仔猪多系统衰竭综合征(特别是PCV2)感染的用途。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒2型PCV2属圆环病毒科，圆环病毒属，为无包膜的单链环状DNA病毒。此病毒在世界各国广泛流行，给世界养猪业造成了很大的经济损失。2型猪圆环病毒又包括两种亚型:PCV2a、PCV2b，近年来PCV2b在中国的流行范围最广，所占比例最大，而且PCV2b的毒性更强。
[0003]PCV20RF2蛋白为病毒的衣壳蛋白，分子量为25kDa，是PCV疫苗主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的0RF2可形成在形态结构与天然病毒颗粒相似的病毒样颗粒(Virus-Like-Particle, VLP)。该病毒样颗粒为二十面体立体对称结构。其保留了病毒颗粒的天然表位，具有较强的免疫原性，可诱导针对圆环病毒的中和抗体。此外，病毒样颗粒并不带有病毒核酸，无潜在致癌危险，具有良好的安全性。因此，VLP疫苗已成为兽用疫苗发展的主要方向。随着分子生物学技术越来越多的应用于疫苗的研制。病毒样颗粒组装技术已经成功并广泛的运用于现代疫苗研发与生产。PCV2疫苗研制的关键是能够大量高效制备VLP颗粒。
[0004]大肠杆菌表达 系统是目前应用最为广泛的基因工程表达系统之一。由于该表达系统具有易于培养，不需要复杂设备，安全性高的显著特点，因此被广泛应用生物制药行业中。此前也有众多的研究者尝试利用大肠杆菌表达系统进行PCV2 0RF2蛋白的表达，进而进行PCV2预防性疫苗的开发。但是众多的研究结果均表明，0RF2蛋白N端含有由41个氨基酸组成的核定位信号，这个信号肽由于密码子偏嗜性的原因，致使0RF2蛋白在E.coli中的表达量非常低，失去了大规模商业应用的可能。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种基于大肠杆菌来源的、抗原表位的选择符合中国猪圆环病毒特征的PCV2型的N端截短衣壳蛋白PCV2 0RF2基因。基于本实验室的技术，通过序列优化，对PCV2衣壳蛋白原核表达进行研究，发现N端截短一直到27个氨基酸的衣壳蛋白依然能组装成病毒样颗粒。
[0006]本发明要求保护的截短衣壳蛋白PCV2 0RF2基因具有如Seq ID N0.1、2、3、4、5、6、
7、8、9所示核苷酸序列。
[0007]根据本发明的一个技术方案，该基因表达的蛋白能够在大肠杆菌内自组装成病毒样颗粒。
[0008]本发明的第二方面，提供截短的PCV2 0RF2衣壳蛋白，具有如Seq IDN0.10、11、12、13、14、15、16、17、18所示的序列。其中，基因序列Seq ID N0.1对应于蛋白序列Seq IDN0.10 ;基因序列Seq ID N0.2对应于蛋白序列Seq ID N0.11 ;基因序列Seq ID N0.3对应于蛋白序列Seq ID N0.12 ;基因序列Seq ID N0.4对应于蛋白序列Seq ID N0.13 ;基因序列Seq IDN0.5对应于蛋白序列Seq ID N0.14 ;基因序列Seq ID N0.6对应于蛋白序列Seq ID N0.15 ；基因序列Seq ID N0.7对应于蛋白序列Seq ID N0.16 ;基因序列Seq ID N0.8对应于蛋白序列Seq ID N0.17 ;基因序列Seq ID N0.9对应于蛋白序列Seq ID N0.18。
[0009]本发明的第三方面，提供一种含有本发明截短的PCV2 0RF2基因的表达载体。
[0010]根据本发明的一个技术方案，所述表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。
[0011]本发明的第四方面，提供一种含本发明截短的PCV2 0RF2基因的表达载体的细胞。
[0012]本发明的第五方面，提供一种制备纯化截短的PCV2 0RF2基因表达的衣壳蛋白的方法，包括如下步骤:
[0013](I)在大肠杆菌表达系统中可溶表达截短的PCV2 0RF2基因，
[0014](2)将表达了截短的PCV2 0RF2衣壳蛋白的大肠杆菌破碎，分离得到上清液，
[0015](3)用含有氯化钾的硫酸铵分级分离，结合色谱层析纯化目的蛋白。
[0016]根据本发明的一个技术方案，所述步骤(3)用硫酸铵分级分离为先用含有氯化钾的30%硫酸铵沉淀除去部分杂蛋白，然后用含有氯化钾的50%硫酸铵沉淀粗目的蛋白，最后，将上述目的蛋白在150mM — 2500mM盐溶液中重新溶解，离心沉淀得到目的蛋白。
[0017]根据本发明的一 个技术方案，将盐溶液的重悬上清液通过滤膜过滤，进一步通过色谱层析纯化目的蛋白。
[0018]本发明的第六方面，提供一种经过N端截短的PCV2 0RF2类病毒颗粒，其中该类病毒颗粒含有本发明PCV2 0RF2基因表达的N端截短的蛋白。
[0019]本发明的第七方面，提供一种用于预防PCV2感染的疫苗，其包括:PCV2病毒样颗粒及疫苗用赋形剂或载体。
[0020]本发明的第八方面，提供一种预防PCV2感染的方法，其包括将含预防有效量的本发明N端截短的PCV2 0RF2基因表达的衣壳蛋白或病毒样颗粒疫苗给予需要预防PCV2感染的猪。
[0021]本发明提供一种基于大肠杆菌来源的、抗原表位的选择符合中国猪圆环病毒特征的PCV2b型别的衣壳蛋白高效表达的方法。基于本实验室的技术，通过截短N端序列，对原核表达PCV 0RF2蛋白进行研究，发现N端截短一直到27个氨基酸的衣壳蛋白依然能组装成直径约15-20nm的病毒样颗粒，
[0022]本发明的制备纯化N端截短的PCV2 0RF2基因表达的衣壳蛋白的方法，利用硫酸铵分级分离沉淀的方法对目的蛋白进行初步纯化。与其它的沉淀方法相比，该方法较为温和，一般认为不会对蛋白质的结构造成破坏。此外，在目的蛋白复溶时，也采用了不含变性剂的复溶液，这也进一步保持了 N端截短的0RF2蛋白的天然活性。通过沉淀，复溶两个步骤，目的蛋白得到显著富集纯化，其占总蛋白的含量从20%上升到了 50%左右，为进行色谱精纯奠定了良好的基础。而且，在上述初步纯化的过程中，没有使用诸如尿素等变性剂，目的蛋白的活性得到了最大程度的保护。在色谱纯化过程中，整个工艺流程简单，无需进行缓冲液置换等步骤，也无需特殊的色谱介质，并且两步色谱的回收接近30%，使得以工业化规模可溶性表达纯化N端截短的PCV 0RF2蛋白成为可能，而且整个工艺过程中，均未涉及到变性剂，纯化过程和组装过程均不会对蛋白的构象产生影响和破坏病毒样颗粒的中和表位，这样生产的病毒样颗粒具有高度的免疫原性，免疫机体后会诱导产生高滴度的中和抗体，对免疫动物起到很好的保护性效果。
[0023]本研究在大肠杆菌中以可溶性表达N端截短的PCV2 0RF2蛋白，并在此基础上，建立了一套高效、适宜放大的PCV2疫苗中试生产工艺。建立了一套N端截短的PCV2 VLP疫苗质量研究体系，并通过动物实验对大肠杆菌来源的N端截短的PCV2 VLP疫苗的有效性，稳定性进行了评价。
[0024]本发明中相关术语的说明及解释
[0025]根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的，在此举例但不限于:GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR (DE3)。
[0026]根据本发明，术语“载体”一词指的是，可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括:质粒，噬菌体，柯斯质粒等等。
[0027]根据本发明，术语“疫苗用赋形剂或载体”是指选自一种或多种，包括但不限于:pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。举例但不限于:TWeen-80。佐剂举例但不限于氢氧化铝，氟氏完全佐剂。离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。
[0028]根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于:离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。
[0029]根据本发明，在本发明获得的N端截短的PCV2 0RF2蛋白的方法中，缓冲液是指可在一定范围内维持PH值稳定的溶液，包括但不限于，Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。
[0030]根据本发明，所述原核宿主细胞破碎包括但不限于通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现。
[0031]根据本发明，在本发明获得的N端截短的PCV2 0RF2蛋白的方法中，所用的盐包括但不限于是中性盐，特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐，硫酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCl、KC1、NH4C1、(NH4)2SO4中的一种或几种，优选NaCl。
[0032]根据本发明，N端截短的PCV2 0RF2蛋白类病毒颗粒如下获得:将上述纯度至少50% N端截短的PCV2 0RF2蛋白溶液通过例如色谱层析进一步分离，得到纯化的N端截短的PCV2 0RF2蛋白溶液。N端截短的PCV2 0RF2的类病毒颗粒组装的方式包括但不限于本领域已知技术，例如，透析，超滤或者层析等。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]下面结合附图对本发明作进一步描述:
[0034]图1为各个截短的PCV2 0RF2蛋白经过纯化后的SDS-PAGE结果。I，经本发明纯化所得PCV2N3C蛋白上样2 μ I ;2，经本发明纯化所得PCV2N6C蛋白上样2 μ I ;3，经本发明纯化所得？(^2_(:蛋白上样2 4 1 ;4，经本发明纯化所得PCV2N12C蛋白上样2μ I ;5，经本发明纯化所得PCV2N15C蛋白上样2 μ I ;6，经本发明纯化所得PCV2N18C蛋白上样2 μ I ;7，经本发明纯化所得PCV2N21C蛋白上样2μ I ;8，经本发明纯化所得PCV2N24C蛋白上样2 μ I ;9，经本发明纯化所得PCV2N27C蛋白上样2 μ I。
[0035]图2为本发明所得的PCV2N3C VLPs病毒样颗粒透射电镜观察(40，000倍)结果。视野中可见大量半径为9nm左右的病毒样颗粒，颗粒实际大小与理论大小相符，表观状态均匀一致。
[0036]图3为本发明所得的PCV2N6C VLPs病毒样颗粒透射电镜观察(40，000倍)结果。视野中可见大量半径为9nm左右的病毒样颗粒，颗粒实际大小与理论大小相符，表观状态均匀一致。
[0037]图4为本发明所得的PCV2N9C VLPs病毒样颗粒透射电镜观察(40，000倍)结果。视野中可见大量半径为9nm左右的病毒样颗粒，颗粒实际大小与理论大小相符，表观状态均匀一致。
[0038]图5为本发明所得的PCV2N12C VLPs病毒样颗粒透射电镜观察(40，000倍)结果。视野中可见大量半径为9nm左右的病毒样颗粒，颗粒实际大小与理论大小相符，表观状态均匀一致。
[0039]图6为本发明所得的PCV2N15C VLPs病毒样颗粒透射电镜观察(40，000倍)结果。视野中可见大量半径为9nm左右的病毒样颗粒，颗粒实际大小与理论大小相符，表观状态均匀一致。
[0040]图7为本发明 所得的PCV2N18C VLPs病毒样颗粒透射电镜观察(40，000倍)结果。视野中可见大量半径为9nm左右的病毒样颗粒，颗粒实际大小与理论大小相符，表观状态均匀一致。
[0041]图8为本发明所得的PCV2N21C VLPs病毒样颗粒透射电镜观察(40，000倍)结果。视野中可见大量半径为9nm左右的病毒样颗粒，颗粒实际大小与理论大小相符，表观状态均匀一致。
[0042]图9为本发明所得的PCV2N24C VLPs病毒样颗粒透射电镜观察(40，000倍)结果。视野中可见大量半径为9nm左右的病毒样颗粒，颗粒实际大小与理论大小相符，表观状态均匀一致。
[0043]图10为本发明所得的PCV2N27C VLPs病毒样颗粒透射电镜观察(40，000倍)结果。视野中可见大量半径为9nm左右的病毒样颗粒，颗粒实际大小与理论大小相符，表观状态均匀一致。
[0044]图 11 为 PCV2N3C VLPs, PCV2N6C VLPs, PCV2N9C VLPs, PCV2N12C VLPs, PCV2N15CVLPs，PCV2N18C VLPs，PCV2N21C VLPs，PCV2N24C VLPs，PCV2N27C VLPs 接种兔后不同阶段血清总抗体滴度。在初免三个星期后，总抗滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到IO7的高水平。
[0045]注:PCV2_N3C表示N端截短3个氨基酸表达的病毒样颗粒；PCV_N6C表示N端截短6个氨基酸表达的病毒样颗粒；以此类推，PCV-N9C、PCV-N12C、PCV-N15C、PCV-N18C、PCV-N21C、PCV-N24C、PCV-N27C，分别表示 N 端截短 9、12、15、18、21、24、27 个氨基酸表达的
的病毒样颗粒。【具体实施方式】
[0046]以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0047]材料及试剂:本发明中涉及基因合成的由上海博亚生物技术有限公司合成，pET载体购于Novagen公司，50L发酵罐购于上海保兴生物公司，其它试剂及药品为普通市售产品O
[0048]实施例1:具有序列1-9的N端截短的PCV2 0RF2基因的蛋白表达
[0049]1.1用做模板的PCV2 0RF2基因片段的制备
[0050]经过大肠杆菌密码子优化的PCV2 0RF2基因全长由上海博亚生物技术有限公司合成。所合成的基因片段全长为702bp。在此人工合成的PCV2 0RF2基因片段的基础上制备本发明N端截短的PCV2 0RF2基因的模板。
[0051]1.2N端截短的PCV2 0RF2基因的非融合表达载体的构建
[0052]以前一步骤所合成的PCV2 0RF2全长基因片段用做PCR反应的模板。分别以PCV2-N3F, PCV2-N6F, PCV2-N9F, PCV2-N12F, PCV2-N15F, PCV2-N18F, PCV2-N21F, PCV2-N24F 和PCV2-N27F为正向引物，以PCV2-R为反向引物，扩增获得N端截短的PCV2 0RF2基因。正向弓丨物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中Nde I位点序列为CATATG，ATG为大肠杆菌系统中的 起始密码子；反向引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。
[0053]
【权利要求】
1.一系列N端截短的PCV2 0RF2基因，其经过优化后的核苷酸序列如Seq ID N0.1、2、3、4、5、6、7、8、9 所示。
2.根据权利要求1所述的截短的PCV20RF2基因，其中该基因表达的蛋白能够在大肠杆菌内自组装成病毒样颗粒。
3.九种截短的PCV2 0RF2 衣壳蛋白，具有如 Seq ID N0.10、11、12、13、14、15、16、17、18所示的序列。
4.含有权利要求1所述基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体,所述表达载体为适于在大肠杆菌中表达的载体。
6.含有权利要求4表达载体的细胞。
7.一种制备纯化截短PCV2 ORF2基因表达的衣壳蛋白的方法，包括如下步骤: (1)在大肠杆菌表达系统中可溶表达截短的PCV2-ORF2基因， (2)将表达了截短的PCV2ORF2衣壳蛋白的大肠杆菌破碎，分离得到上清液， (3)用含有氯化钾的硫酸铵分级分离，结合色谱层析纯化目的蛋白。
8.九种经过截短的PCV2ORF2类病毒颗粒，其中该类病毒颗粒含有权利要求1或2基因表达的蛋白或者包含权利要求3的蛋白。
9.一种用 于预防PCV2感染的疫苗，其包括:(I)权利要求8的PCV20RF2病毒样颗粒，及疫苗用赋形剂或载体。
10.一种预防PCV2感染的方法，其包括将含预防有效量的权利要求1-2任一项的PCV2ORF2衣壳蛋白或权利要求8的病毒样颗粒的疫苗或预防有效量的权利要求9的疫苗给予需要预防PCV2感染的猪。
【文档编号】C07K1/30GK104017813SQ201410243261
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】袁于人, 莫小兵 申请人:斯澳生物科技（苏州）有限公司