与磷脂酰丝氨酸结合的Fc融合构建体及其治疗用途

与磷脂酰丝氨酸结合的Fc融合构建体及其治疗用途
【专利摘要】本发明公开了具有不寻常的特性组合的新型结合磷脂酰丝氨酸的构建体，及一系列的其诊断和治疗缀合物。所述新型构建体有效地结合疾病中的磷脂酰丝氨酸靶并增强其破坏，并还可以将所附着的成像或治疗剂特异性地递送至疾病位点。还公开了在肿瘤血管靶向、癌症诊断和治疗中使用所述新型构建体组合物、治疗缀合物及其组合以及用于治疗病毒感染和其他疾病的方法。
【专利说明】与磷脂酰丝氨酸结合的Fe融合构建体及其治疗用途
[0001] 本申请是申请日为2006年1月24日、申请号为200680007064. 8、发明名称为"与 磷脂酰丝氨酸结合的Fe融合构建体及其治疗用途"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 发明背景
[0003] 本申请要求于2005年1月24日提交的共同未决的美国临时申请系列号 60/646, 333的优先权，该临时申请的公开内容，包括说明书、权利要求、附图和序列，特别引 入本文作为参考而并未放弃。
[0004] 1.发明领域
[0005] 本发明涉及磷脂酰丝氨酸生物学领域，以及涉及治疗肿瘤和病毒感染。它提供了 不寻常的新构建体、组合物、方法和组合，其用于肿瘤血管靶向和癌症治疗，和用于治疗病 毒感染及其他疾病。本发明特别提供了具有不寻常的特性组合的新型结合磷脂酰丝氨酸的 构建体，及其诊断和治疗缀合物。所述新型构建体有效地结合磷脂酰丝氨酸疾病靶并增强 其破坏，并还可以将治疗剂递送至特定位点，因此提供了一系列用于治疗癌症、病毒感染和 其他疾病的方法。
[0006] 2?相关领域的描述
[0007] 肿瘤细胞对化学治疗剂的抗性在临床肿瘤学中是一个重要问题。在肿瘤治疗中要 解决的另一主要问题是期望"全部细胞杀死"，即，杀死所有能不受控制地生长并替代通过 治疗可去除的任何肿瘤块的所谓"克隆形成性"恶性细胞。尽管在此领域内有了一定的进 展，但这仍是为何许多普遍形式的人类癌症依然耐受有效的化学治疗干预的两个主要原 因。
[0008] 对于开发接近"全部细胞杀死"的疗法这一目的而言，某些类型的肿瘤比其他类型 更易受治疗的影响。例如，软组织肿瘤（例如淋巴瘤）以及血液和造血器官肿瘤（例如白 血病）通常比实体瘤（例如癌）对化学疗法更具有反应性。
[0009] 软组织肿瘤和基于血液的肿瘤对于化学疗法的易感性的一个原因是淋巴瘤和白 血病细胞对于化学治疗干预的更大的可达性。简而言之，大部分化学治疗剂到达实体瘤块 的所有细胞比到达软组织肿瘤和基于血液的肿瘤的所有细胞要难得多，因此完成全部细胞 杀死也要困难得多。增加化学治疗剂的剂量在大部分情况下常常会导致毒副作用，这通常 限制了常规抗肿瘤剂的效力。
[0010] 另一肿瘤治疗策略是使用"免疫毒素",其中用抗肿瘤细胞抗体将毒素递送至肿瘤 细胞。不过，和化学治疗方法一样，免疫毒素疗法在应用于实体瘤时也存在着明显的缺点。 例如，抗原阴性或抗原缺乏性细胞能存活并再恢复生成肿瘤或导致进一步的转移。实体瘤 对基于抗体的疗法有耐受性的另一原因是肿瘤块对于大分子试剂例如抗体和免疫毒素来 说通常是不能渗透的。肿瘤内的物理扩散距离和间质压力都是对此类型疗法的重要限制因 素。
[0011] 一种经改良的治疗策略是靶向实体瘤的血管结构。靶向肿瘤血管而非肿瘤细胞本 身具有一定的优越之处，即不太可能导致抗性肿瘤细胞的形成，而且被靶向的细胞容易接 近。此外，血管的破坏导致抗肿瘤效应的扩大，因为许多肿瘤细胞依赖单一血管来提供其氧 气和养分。示例性的血管靶向剂（VTAs)在美国专利号5, 855, 866、5, 965, 132、6, 261，535、 6, 051，230和6, 451，312中得到描述，这些文献描述了将抗细胞剂和毒素靶向递送至肿瘤 血管结构的标记物。
[0012] 另一有效的血管靶向方法是将凝血因子靶向在肿瘤血管结构或基质中表达 或吸附的标记物（Huang等人，1997 ;美国专利号6, 093, 399、6, 004, 555、5, 877, 289和 6, 036, 955)。将促凝剂而非毒素递送至肿瘤血管结构具有另外的优越之处，即降低了免疫 原性，并甚至减少了产生毒副作用的风险。如美国专利号5, 877, 289中所公开的，用于此类 肿瘤特异性"凝血配体（coaguligand) "中的优选凝血因子是截短形式的人凝血诱导蛋白 质，组织因子（TF)，其是血液凝固的主要起始因子。
[0013] 最近，磷脂酰丝氨酸（PS)被鉴别为肿瘤血管结构的特异性标记物（Ran等人， 1998)。这引起了对用于递送抗细胞剂、毒素和凝血因子至肿瘤血管的新型抗PS免疫缀合 物的开发（美国专利号6, 312, 694、6, 783, 760和6, 818, 213)。此外，还发现未缀合的针对 PS的抗体无需与治疗剂附着就可发挥抗癌作用，这已知为用于肿瘤血管靶向和治疗的磷脂 酰丝氨酸"裸露抗体"方法（美国专利号6, 406, 693)。
[0014] 尽管前述方法已促进了肿瘤治疗技术的发展，但仍需要开发另外的治疗和血管靶 向剂以扩展治疗选择的数目和功效。重要的进展将是鉴定具有抗癌特性及在其他系统例如 在治疗病毒感染中的疗效的一组治疗剂。产生可以由两种人组分制备的新型靶向构建体， 特别是不依赖于使用用于靶向的抗体的那些构建体，将是重要的发展，其提供了经改善的 安全性。设计和开发增强患者自身针对疾病的应答，即增加宿主效应器功能的新试剂，将在 治疗应答最大化中具有重大价值，特别是其中相同机制可以影响癌症及其他疾病例如病毒 感染和疾病。
[0015] 发明概沭
[0016] 本发明通过提供新型构建体、组合物、方法和组合用于肿瘤血管结构靶向和癌症 治疗和用于治疗病毒感染及其他疾病，从而解决了现有技术的前述和其他需要。本发明特 别提供了具有不寻常的特性组合的新型结合磷脂酰丝氨酸的构建体，它有效地结合疾病中 的磷脂酰丝氨酸靶并增强其破坏，例如通过增加宿主效应器功能。还提供了一系列的缀合 物组合物，其中所述新型构建体附着至其他的生物学试剂、诊断剂和治疗剂，它们可以被 特异地递送至疾病位点。本发明进一步提供了在肿瘤血管结构靶向、癌症治疗中使用所述 新型构建体和缀合物及其组合以及用于治疗病毒感染和其他疾病的有效方法。
[0017] 当用于整个申请文件各处时，术语"a"和"an"用于指"至少一种（个）"、"至少第 一种（个）"、"一种（个）或多种（个）"或"众多"的所提及的组分或步骤，除非在其后特 别说明了上限。因此，如本文所使用的，"a construct"指"至少第一种构建体"。正如任何 单一试剂的量一样，本领域普通技术人员根据本公开内容将了解各组合的可操作限度和参 数。
[0018] 受体-抗体（ReceptorBody)和P -抗体（BetaBody):本发明首先提供了一系列 结合磷脂酰丝氨酸的构建体组合物，其中所述构建体包含可操作地附着至至少第一种抗体 Fc区的至少第一种磷脂酰丝氨酸结合蛋白、多肽或受体。连接磷脂酰丝氨酸结合蛋白、多肽 或"受体"至"抗体" Fc区产生了术语"受体-抗体"，这在本文中用于指本发明的结合磷脂 酰丝氨酸的Fc构建体。
[0019] 本发明构建体或受体-抗体一般包含至少第一种抗体Fe区，其可操作地附着至至 少第一种磷脂酰丝氨酸结合蛋白或多肽、受体、配体或肽。在本文中简洁地使用的术语"磷 脂酰丝氨酸结合蛋白"指所有磷脂酰丝氨酸结合蛋白、多肽、受体、配体和肽。
[0020] 在许多实施方案中，"磷脂酰丝氨酸结合蛋白"在附着至抗体Fe区从而形成本发明 构建体时将保留磷脂酰丝氨酸结合特性。自然，磷脂酰丝氨酸结合功能的保留在希望用于 靶向暴露于疾病位点中的磷脂酰丝氨酸的那些构建体中是重要的。然而，不是本发明的所 有实施方案都局限于在附着至抗体Fe区时保留磷脂酰丝氨酸结合特性的磷脂酰丝氨酸结 合蛋白。
[0021] 值得注意的是，本发明包括了与"带切口的P 2-糖蛋白I"连接的抗体Fe区，其中 带切口的￠2-糖蛋白I不再结合磷脂酰丝氨酸（参见下文）。因为带切口的￠2-糖蛋白 I已知是血管发生的抑制剂（美国专利申请
【发明者】还考虑到由于最 初施加凝血配体所引起的凝血酶的产生有可能导致中枢血管上进一步的VCAM-I诱导作用 (Sluiter等人，1993)，从而产生扩大的信号并导致对肿瘤内区域的明显破坏。这种类型的 凝血配体诱导的其他可靶向标记物的表达以及由此产生的信号放大在美国专利6, 036, 955 中有所描述。
[0189] 正如本文所显示的，尽管通过施加抗VCAM-I凝血配体观察到其定位于小鼠心脏 和肺中表达VCAM-I的血管上，但此构建物并未在这样的非肿瘤部位诱发血栓形成。而且， 抗VCAM-I凝血配体对小鼠的毒性并不比具有无关特异性的对照凝血配体更大，再次表明 了 VCAM-I在心脏和肺血管上的组成性表达不会产生毒性。由于VCAM-I是人类肿瘤血管内 皮中天然存在的标记物，此结果对于当前凝血配体疗法的临床进展尤为重要。另一方面，此 现象还为
【发明者】提供了独一无二的视野，导致了不同的破坏肿瘤血管结构的方法。
[0190] A.发现用于肿瘤治疗的裸露的抗磷脂酰丝氨酸抗体
[0191]
【发明者】试图了解抗VCAM-I凝血配体能结合组成性表达于心脏和肺血管上的 VCAM-I却不会在那些血管中引起血栓形成这一现象背后的机制。对于此只凭经验观察到的 现象有许多科学的可能性解释，通常与肿瘤环境中的前血栓形成特性以及心脏和肺中任何 血纤维蛋白溶解诱因相关。
[0192] 一般而言，在凝血系统（纤维蛋白沉积）和纤溶系统（纤维蛋白被酶降解）之间 存在着生物学平衡。不过，在恶性病，尤其是肿瘤中，此平衡被破坏，导致了凝血的异常激活 (血凝过快或"前血栓形成状态")。尽管进行了大量的研究，直到最近才了解了肿瘤环境中 前血栓形成状态的明确分子机制。
[0193] 在详细分析许多可能后，
【发明者】推断抗VCAM-I凝血配体之所以不会在正常组织 血管内引起血栓形成是由于这些血管内腔表面缺乏磷脂酰丝氨酸（PS)。因此，为了证实这 一理论，不仅需要证明在这些正常血管上无磷脂酰丝氨酸，还需要证实它们存在于肿瘤相 关血管的内腔侧面上。
[0194] 因此，
【发明者】用免疫组织化学染色来确定静脉内注射入患肿瘤小鼠体内的单克隆 抗磷脂酰丝氨酸（抗PS)抗体的分布状态。这些研究显示，在心脏和肺中表达VCAM- 1的 血管缺乏PS，而在肿瘤中表达VCAM-I的血管也表达PS。
【发明者】还发现结合PS的膜联蛋白 V在体外和体内均阻断抗-VCAM-I *tTF凝血配体的作用，这进一步证实了在凝血配体的作 用中需要表面PS的表达。
[0195] 因此，至少在某种程度上，抗VCAM-I凝血配体在正常心脏和肺血管上无血栓形成 作用的原因可以解释为：由于缺乏磷脂酰丝氨酸，意味着正常血管上没有凝血复合物组装 所需要的前凝血表面。在缺乏表面PS的情况下，抗-VCAM-I *tTF与表达VCAM-I的心脏和 肺血管结合，但不会诱发血栓形成。相反，在肿瘤中表达VCAM-I的血管显示出同时表达了 表面PS。因此，凝血配体与肿瘤血管结合，并局部激活了凝血因子，从而形成了堵塞的血栓。
[0196] 除了描述抗VCAM-I凝血配体的肿瘤特异性血栓形成作用外，在肿瘤血管内腔表 面上磷脂酰丝氨酸的特异表达还使
【发明者】能够解释早期研究中观察到却不能理解的前血 栓形成表型。PS表达在肿瘤血管结构的前血栓形成状态中起了重要的作用。
[0197] 在他们发现代表性的氨基磷脂一磷脂酰丝氨酸特异地表达于肿瘤血管内腔表面 而不表达于正常血管中后，
【发明者】推断其他的氨基磷脂也具有作为治疗干预靶目标的可 能。
【发明者】因此以靶向于磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺（PE)这些氨基磷脂为基础开发了 肿瘤血管系统靶向和治疗方法。
[0198] -旦磷脂酰丝氨酸作为肿瘤血管结构特异标记物的发现得到证实，
【发明者】开始 开发一系列靶向磷脂酰丝氨酸的免疫毒素和凝血配体用于肿瘤治疗中。正如美国专利 6, 406, 693中所解释的，当研究在将毒素或凝血剂递送至肿瘤血管结构时利用磷脂酰丝氨 酸进行靶向的可能性时，
【发明者】意外的发现在未附加任何效应子的情况下裸露的抗PS抗 体对体内肿瘤血管具有破坏作用。抗氨基磷脂抗体既特异定位于肿瘤血管系统又发挥伴随 的破坏作用从而导致肿瘤坏死的能力是根本未曾预料到的。
[0199] 这些发现产生使用结合磷脂酰丝氨酸的未缀合的或"裸露的"抗体的肿瘤治疗，如 引入本文作为参考的美国专利6, 406, 693中描述的。尽管在本领域公认的动物模型中的 抗肿瘤效应在美国专利6, 406, 693中得到了证实，并在本文中进行了扩展，但从美国专利 6, 406, 693之前的研究不能预测氨基磷脂能够充当肿瘤血管系统的安全且有效的可靶向标 记物。
[0200] B.使用抗磷脂酰丝氨酸抗体的广泛的肿瘤治疗
[0201] 在不同细胞中磷脂酰丝氨酸通常被隔离至质膜双层的内表面（Gaffet等人， 1995 Julien等人，1995)，并且这种脂质隔离产生不对称的跨双层（Williamson和 Schlegel，1994)。本发明人在较早的时候证实了，PS移位至肿瘤血管内皮细胞表面，并 且至少在显著的程度上，这种现象的发生与凋亡或其他细胞死亡机制无关（美国专利 6, 406, 693)。因此，在肿瘤环境中PS的表面表达不是细胞死亡的结果，也不是由它引起了 即时的细胞破坏。尽管在各种实体瘤中在完整血管内皮细胞上始终可以检测到PS暴露，肿 瘤血管内皮却不是真正凋亡的，而是形态学上完好的（尽管不同于正常组织中的情形），并 且是代谢活跃的。这对于基于PS靶向的治疗方法来说是重要的，这意味着在肿瘤血管内皮 细胞中PS向外膜的移位对于PS用作成功治疗（利用裸露的抗体或治疗性缀合物）的可靶 向实体来说是足够稳定的。
[0202] 通过开发对不同磷脂具有强特异性的生物学工具，本发明人已确定阴离子磷脂在 肿瘤血管内皮细胞上也是上调的。因此，阴离子磷脂是肿瘤血管系统的特异且稳定的标记 物，这使得能够利用可与阴离子磷脂结合的裸露抗体和免疫缀合物二者进行治疗干预。
[0203] 在正常条件下，阴离子磷脂在静息哺乳动物细胞表面上基本上是不存在的。磷脂 酰丝氨酸是最丰富的质膜阴离子磷脂，其在正常条件下在大部分细胞类型中被紧密隔离于 质膜内表面（Williamson 和 Schlegel，1994 ;Zwaal 和 Schroit，1997)。另一种主要的阴离 子磷脂，磷脂酰肌醇（PI)，也主要位于质膜的内表面（Calderon和DeVires, 1997)。次要的 阴离子磷脂，磷脂酸（PA)和磷脂酰甘油（PG)，只在少数细胞类型中检测到，但它们也表现 出主要位于质膜的内表面（Hinkovska-Galcheva等人，1989)。另一种阴离子磷脂，心磷脂， 存在于线粒体膜上而不存在于质膜上（Daum，1985)。
[0204] 中性磷脂也不对称地分布于质膜内。磷脂酰乙醇胺（PE)这种中性氨基磷脂主要 位于内表面。含胆碱的中性磷脂，磷脂酰胆碱（PC)和鞘磷脂（SM)，主要位于外表面。
[0205] PS的不对称性通过ATP-依赖性转运蛋白即氨基磷脂移位酶（Mg2+ATP酶）来维持， 该酶催化氨基磷脂从质膜外表面向内表面转运（Seigneuret和Devaux, 1984)。PS不对称 性的丧失或崩溃是由于质膜内的这些磷脂向外运动所造成的，或者是由于对移位酶的抑制 (Bitbol等人，1987 ;Comfurius等人，1990)、PS转运蛋白的激活和/或爬行酶（Zhao等人， 1998)或ABC-I翻转酶（floppase) (Hamon等人，2000)的激活所引起的，所述爬行酶和翻转 酶是双向转运所有脂质的Ca2+依赖性酶。也可激活鞘磷脂酶以产生神经酰胺，其促进跨双 层的脂质转位（Contreras等人，2003)。
[0206] 在不同的病理和生理条件下都观察到了 PS不对称性的丧失，包括细胞损伤、程序 性细胞死亡和凋亡（Blankenberg等人，1998 ;Bombeli等人，1997)、细胞衰老（Herrmann和 Devaux，1990)、血小板活化（Rote 等人，1993 ;Zwaal 等人，1989)、损伤（Boyle 等人，1996) 和恶性转化（Sugimura等人，1994)。PS的暴露还在成肌细胞（Sessions和Horwitz, 1981) 与营养细胞（Adler等人，1995)的胞间融合、细胞迁移（Vogt等人，1996)和细胞脱粒（Demo 等人，1999)中起作用。内皮细胞对由凝血酶（Qu等人，1996)、|丐离子载体或佛波酯（Julien 等人，1997)、高脂血症（Lupu等人，1993)和非溶胞浓度的补体蛋白质C5b-9 (Christiansen 等人，1997)所诱导的Ca2+流量增加产生应答而将PS外在化。在无外源激活剂或细胞损伤 的情况下在恶性细胞内也观察到自发的PS暴露（Utsugi等人，1991)。
[0207] 膜PS暴露后产生几个主要的后果。有吞噬作用的巨噬细胞识别、附着并消灭PS阳 性的衰老和凋亡细胞（McEvoy等人，1986 ;Tait和Smith，1999)。PS还介导T淋巴细胞与凝 血酶活化的内皮细胞附着（Qu等人，1996)。补体系统被PS激活并促成PS阳性细胞的裂解 (Test和Mitsuyoshi，1997)。最后，PS的暴露通过为凝血复合物的装配和活化提供带负 电荷的脂质表面而促使前凝血剂移动至内皮上（WiIliamson和Schlegel, 1994 ;Bombeli等 人，1997)。长期以来已对肿瘤内皮的促血栓形成特征有所认识（Donati和Falanga，2001)。
[0208] 本发明人认识到肿瘤内皮的损伤和活化是由以下物质引起的：1)肿瘤来源的 细胞因子，例如白介素-1和肿瘤坏死因子，它们激活内皮并诱导细胞粘附分子的表达 (Shaughnessy等人，1989 ;0rr等人,2000) ;2)由粘附于内皮上的白细胞产生的活性氧类 别（ROS) (Orr等人，2000);和3)作为代谢副产物（Shaughnessy等人，1989 ;Soares等人， 1994)或作为暴露于低氧之后又复氧的结果（Zulueta等人，1995)由肿瘤细胞自身产生的 ROS。这些观察结果暗示，可能由肿瘤内皮中的这些应激产生Ca2+流量，接着通过爬行酶的 活化或氨基磷脂移位酶的抑制而引起PS暴露。
[0209] 为了检测细胞表面阴离子磷脂，本发明人创造了新的单克隆抗体9D2,它与阴离子 磷脂而非中性磷脂反应。9D2因此与普通的氨基磷脂结合剂区别开来，因为它与磷脂酰丝氨 酸这种阴离子氨基磷脂结合，而不与磷脂酰乙醇胺这种中性氨基磷脂结合。9D2抗体还比天 然配体膜联蛋白V更特异于阴离子磷脂，所述膜联蛋白V除了与阴离子磷脂结合外还强烈 结合 PE (Blankenberg 等人，1998)。
[0210] 正如本申请所详述的，本发明人发现9D2和膜联蛋白V在经静脉内注射到带有各 种类型实体瘤的小鼠中后特异地定位于肿瘤内皮。这个发现证实了本发明人的假设，即磷 脂酰丝氨酸和阴离子磷脂通常在肿瘤血管内皮表面变得暴露，且可用作肿瘤治疗（和成 像）的靶分子。
[0211] 从本发明中显现的主要发现之一是磷脂酰丝氨酸和阴离子磷脂暴露在肿瘤内皮 的表面上（实施例VI ;Ran和Thorpe, 2002 ;Ran等人，2002b)。此现象通过使用下列两种选 择性结合阴离子磷脂的独立试剂得到证明：单克隆抗体9D2,这是本发明人特别为了证明 这点而开发的，以及膜联蛋白V。
[0212] 9D2抗体和膜联蛋白V以高亲和力和特异性结合磷脂酰丝氨酸和阴离子磷脂，它 们作为脂质体被吸附至塑料，或者被呈现在体外活化或凋亡内皮细胞的膜表面上。9D2与 PS、PA和CL强烈结合，但与PI和PG的结合则弱得多。正如过去所发现的，膜联蛋白V除 了结合 PS、CL、PA、PI 和 PG 之外，还结合 PE(Andree 等人，1990 ;Schla印fer 等人，1987 ; Boustead等人，1993 ;Blackwood和Ernst, 1990)。9D2抗体对磷脂酰丝氨酸和阴离子磷脂 的识别在血清存在或不存在的情况下都是相同的，这表明结合不需要血清辅因子。9D2与阴 离子磷脂的结合不需要Ca 2+离子，而膜联蛋白V的结合则需要Ca2+。
[0213] 在经PS包被的平板上的交叉阻断研究显示，9D2和膜联蛋白V不会相互阻断与 PS的结合。这表明所述两种试剂识别PS分子上的不同表位，或更有可能识别不同包装形 式的PS。膜联蛋白V被认为结合平坦的PS表面，而抗PS抗体则被认为结合六角形包装的 PS (Rauch和Janoff，1990)。两种形式都可能存在于经PS包被的平板上。这些实际的交叉 阻断研究（实施例VI)还用于表明，一旦提供参照抗体（例如9D2)，就能容易地鉴别出有效 地竞争结合阴离子磷脂的抗体，即与参照抗体结合基本上相同表位的抗体。
[0214] 本申请还显示，9D2抗体和膜联蛋白V特异性地定位于肿瘤血管和定位于在体内 检测的所有肿瘤的坏死区域内和周围的肿瘤细胞（实施例VI)。肿瘤中15 - 40%的血管具 有磷脂酰丝氨酸阳性内皮。相反，正常组织中没有血管具有可检测的外在化阴离子磷脂。表 达PS的肿瘤内皮细胞是有活力的。它们缺乏细胞凋亡标记物（活性胱天蛋白酶-3，TUNEL)， 在形态学上是完整的并且是代谢活跃的，并且血管有输送血液和溶解物的功能。
[0215] 9D2对肿瘤血管系统的染色特异性通过以下几点得到证明：1)用对照大鼠 IgM则 无肿瘤血管的染色；2)用由阴离子磷脂制备的脂质体可以阻断体外9D2或膜联蛋白V与经 H2O2处理的内皮细胞的结合，而由中性磷脂制备的脂质体则不能；3)发现用去污剂或有机 溶剂从肿瘤切片提取出磷脂就消除了染色；和4)9D2或膜联蛋白V都不定位于正常器官中 的静止内皮上。
[0216] 肿瘤血管系统中由9D2或膜联蛋白V定位的主要阴离子磷脂是磷脂酰丝氨酸， 因为它是最丰富的阴离子磷脂，并且它在细胞表面上的暴露受环境变化或损伤的调控。为 了检验肿瘤内皮细胞上阴离子磷脂暴露的机制，进行了一系列的研究，其中用已知存在于 肿瘤微环境中的各种因子和条件来处理体外的内皮细胞（实施例VII)。低氧后复氧、酸性 和凝血酶使PS在活内皮细胞上的暴露提高至当所有细胞均凋亡时所观察到的水平的10 - 22%。炎性细胞因子（TNFa和IL-1)也会微弱但明确地诱发PS暴露。
[0217] 这些发现与下列可能性相一致：在肿瘤中，低氧/复氧结合炎性细胞因子、凝血酶 和酸性会诱导磷脂酰丝氨酸暴露于血管内皮上。尽管对于实施本发明来说并不需要了解 确切的机制，但肿瘤细胞可能以作为代谢的副产物或对低氧的响应而产生R〇S(Zulueta等 人，1995)。肿瘤细胞释放的细胞因子可能诱导了内皮上的白细胞粘附分子，其介导活化的 巨噬细胞、多形核细胞和血小板与肿瘤内皮粘附，和进一步的ROS分泌。然后，ROS可能通 过含巯基的转运分子的氧化或脂质的过氧化来诱导PS移位（Herrmann和Devaux, 1990)，这 可能通过引起Ca2+流入或从细胞内I&备中释放Ca2+而实现（Wang和Joseph, 2000)。事实 上，过氧化物已显示可在体外通过涉及谷胱甘肽氧化和/或脂质过氧化而不是细胞凋亡的 机制来诱导活内皮细胞上的PS暴露（van Gorp等人，1999)。
[0218] PS和其他阴离子磷脂的暴露在某种程度上解释了长久以来认识到的肿瘤内皮的 促凝血状态（Donati和Falanga, 2001)。阴离子磷脂提供了用于凝血因子聚集和装配的表 面（Bevers等人，1985 ;Dachary_Prigent等人，1996)。它还为帮助白细胞浸润入肿瘤中的 循环性巨噬细胞（McEvoy等人，1986)、T淋巴细胞（Qu等人，1996)和多形核细胞提供了附 着位点。
[0219] 在本文中所详细描述的进一步研究中，本发明人创造并表征了称为3G4的单克隆 抗体，其针对磷脂酰丝氨酸和阴离子磷脂。这种抗体还显示出特异性定位于肿瘤中的血管 内皮细胞，减少肿瘤的血管供应（vascularity)和血浆容量并且延缓肿瘤生长。
[0220] 在血清或P 2-糖蛋白I存在下，3G4抗体以高亲和力结合吸收在塑料上的阴离子 磷脂，以及在激活或凋亡的细胞表面上的阴离子磷脂。细胞上的3G4结合模式与针对阴离 子磷脂的膜联蛋白A5或9D2抗体的模式没有区别。所有3种试剂结合类似于膜泡的质膜 簇，这与在用H 2O2处理的内皮细胞上的其他观察一致（van Gorp等人，1999)。如同9D2,3G4 识别所测试的所有阴离子磷脂，包括对氧化有抗性的具有饱和脂肪酸的合成磷脂，和溶血 磷脂。
[0221] 不像9D2,3G4与阴离子磷脂的结合在血清完全不存在下被部分抑制，并且当添加 32-糖蛋白I时恢复。因此，3G4识别脂质-￠2-糖蛋白I复合物中的表位。无关地，3G4 当施用于动物时显示是安全的，并且与在文献中报道的与抗磷脂综合征（APS)有关的抗体 的病理学效应不相关。
[0222] 在注射到带有同位人乳腺MDA-MB-435肿瘤的小鼠中后，3G4特异地定位于肿瘤血 管以及定位于在肿瘤坏死区域内和周围的肿瘤细胞。平均40± 10%的血管被3G4结合。染 色模式类似于本文报道的使用9D2和膜联蛋白A5时的那些。正常组织中的血管内皮不被 染色。在这点上，3G4与识别肿瘤血管标记物的其他抗体不同。大多数肿瘤血管标记物存在 于在卵巢（生理性血管发生的部位）中或在肾和胰岛（其中血管具有高渗透性）中的血管 上（Thorpe,2004)。
[0223] 磷脂酰丝氨酸是主要被3G4检测的阴离子磷脂。PS是最丰富的阴离子磷脂， 并且是其暴露最熟知受环境条件或损伤调节的阴离子磷脂（Zwaal和Schroit，1997 ; Balasubramanian和Schroit，2003)。在体内，肿瘤血管上暴露的PS很可能与血清组分例如 3 2-糖蛋白I复合，并且3G4很可能结合这些复合物。如本研究自始自终所指明的，在未处 理的小鼠中的PS阳性肿瘤血管看起来是完整的并且是有功能的。它们输送血液并且是可 灌注的。PS阳性血管的血管内皮不显示晚期凋亡的标记物（活性胱天蛋白酶3，TUNEL)，是 形态学完整的，并且是代谢活跃的，如通过快速周转蛋白（rapidly turned over protein) VCAM-I的共表达所判断的。
[0224] 使用3G4的治疗延缓了各种鼠类模型中的肿瘤生长，包括已建立的（0. 6 - 0. 7cm 直径）同位人MDA-MB-231和MDA-MB-435乳癌，大的（1cm直径）皮下L540人何杰金氏肿 瘤，和小的同系Meth A纤维肉瘤。3G4治疗导致这些肿瘤的生长分别延缓75%、65%、50% 和90%。在本申请中的其他研究证实，这些肿瘤被具有暴露的阴离子磷脂的血管系统滋养。
[0225] 3G4的抗肿瘤效应至少部分通过损害肿瘤血管系统介导。来自用3G4处理的小鼠 的同位MDA-MB-231肿瘤的组织学检查显示，肿瘤的血管密度和血浆含量明显减少。3G4至 肿瘤血管的定位在巨噬细胞结合肿瘤血管、血管功能损害和坏死发生之前。血管关闭和坏 死模式与该首要效应位于肿瘤血管上相一致。观察到肿瘤中心性坏死，而周围边缘的肿瘤 细胞存活。这种模式的肿瘤细胞杀死是VTAs的特征（美国专利5, 855, 866 ;Thorpe，2004)。 认为VTAs针对肿瘤内部血管是最有效的，因为在这些区域中的高间隙压促使血管崩溃。相 反，许多直接作用的肿瘤疗法则针对在富氧的肿瘤外周中快速分裂的肿瘤细胞是最有效 的。本发明人因此期望，将3G4与抗增殖的抗肿瘤疗法组合将会产生另外的或甚至协同的 抗肿瘤活性，如在实验性实体瘤中用其他VTAs已观察到的（美国专利5, 855, 866 ;Burr〇WS 和 Thorpe，1993 ;Siemann 等人，2002 ;Sum 等人，2004)。
[0226] 如同本文使用的其他抗体一样，3G4疗法在用治疗剂量（在小鼠中4mg/kg，一周3 次）重复治疗的带有肿瘤的动物中是良好耐受的。小鼠保留正常的体征、凝血参数、骨髓细 胞构成、白细胞计数和组织学。没有观察到APS的表现，这与使用抗心磷脂抗体所观察到的 那些相反（Matzinger，1998 ;Fadok 等人，1998 ;Fadok 等人，2001a ;b)。尽管高浓度 3G4 的 效应可部分抑制磷脂依赖性凝血途径，但在治疗剂量和延长体内凝血时间的剂量之间存在 基本安全范围。
[0227] 本发明人已考虑了关于在非恶性损伤（例如动脉粥样硬化病变、炎症部位）中PS 是否会变得暴露在血管内皮上的问题，在所述非恶性损伤中细胞因子、低氧和ROS可能诱 导PS转位（Moldovan等人，1994)。这发生了，那么这可能可以导致伴随抗PS抗体的某些 毒性，从而使得排除具有来自治疗的这些状况的患者是合适的。然而，本发明人的其他研究 显示，用嵌合形式的3G4抗体治疗动脉粥样硬化的家兔不会加重主动脉的动脉粥样硬化病 变。
[0228] 采用药物或凝血剂的血管靶向剂已显示高度有效，并且有时治愈具有大实体瘤的 小鼠 （Huang 等人，1997 ;Nilsson 等人，2001 ;美国专利 5,660,827、5,776,427、5,855,866、 5, 863, 538、5, 965, 132、6, 004, 554、6, 051，230、6, 261，535、6, 093, 399、6, 004, 555、 5, 877, 289和6, 036, 955)。本发明人提供了针对磷脂酰丝氨酸的裸露抗体和血管靶向剂以 用于在人类癌症的诊断和治疗中靶向肿瘤血管系统。
[0229] 尽管不需要对针对磷脂酰丝氨酸的裸露抗体如何在肿瘤治疗中发挥作用有准确 的分子水平的了解以便实践治疗，本发明人还是考虑了可能造成所观察到的内皮细胞杀死 现象的几种机制。最可能的机制（尤其是对于本文所述的3G4抗体来说）是Fc结构域介 导的免疫效应器功能，例如抗体依赖性细胞毒性（ADCC)、补体依赖性细胞毒性（CDC)和抗 体介导的吞噬作用。细胞介导的细胞毒性、补体介导的细胞裂解和/或凋亡、抗体诱导的细 胞信号传导和/或对细胞骨架的扰乱也可能涉及在内。
[0230] 针对磷脂酰丝氨酸的完整抗体，尤其是3G4,与血管内皮细胞表面的结合意味着抗 体的Fc部分突入血管的内腔中。由于抗体Fc片段激活了补体途径，所以观察到的细胞破 坏可能是补体指导的细胞裂解的结果。因此抗体结合激活了补体依赖性凝血级联反应，弓丨 起多组分复合物进行装配并最终产生能穿透靶细胞的裂解复合物。"补体激活的ADCC"还 可在破坏中起作用，其中补体与被抗体包被的靶细胞结合，并且其中具有补体受体的细胞， 如嗜中性粒细胞，会裂解靶细胞。
[0231] 当裸露或未缀合的抗体，包括其抗原结合片段，与在肿瘤血管内皮细胞表面的磷 脂酰丝氨酸结合时，它们将在内腔表面上形成抗体包被层。这可以起到吸引免疫效应细胞 例如细胞毒性T细胞和/或天然杀伤（NK)细胞的这样作用,然后免疫效应细胞将在血管内 皮细胞上发挥细胞介导的细胞毒性效应。
[0232] 与磷脂酰丝氨酸结合的抗体还可诱导肿瘤血管内皮细胞中的细胞凋亡。尽管尚无 关于与PS结合的抗体真正诱导凋亡的已知报道（而非PS是由凋亡产生的标记物），本发明 人仍考虑这可能是所观察到的抗肿瘤效应的另一可能机制。
[0233] 还可能的是，抗体与肿瘤血管内皮细胞表面上的磷脂酰丝氨酸结合可引起细胞的 细胞骨架组织紊乱。由于细胞骨架在表面膜的组织中起着重要的作用，且由于抗体结合可 能扰乱（或进一步扰乱）膜，所以抗体与磷脂酰丝氨酸的结合可能将变化传递至与双分子 层相互作用的细胞骨架蛋白。已知细胞骨架蛋白的空间结构控制膜的稳定性和细胞形状， 并且有可能某些细胞骨架平衡状态的扰动可能对细胞的完整性具有深远的影响。
[0234] 本发明另一种作用机制可能是所述抗体与内皮细胞表面上的磷脂酰丝氨酸结合 可能通过目前未确定的途径起始信号转导。抗体结合还可能扰乱已知的信号转导途径，例 如通过改变膜受体、信号转导蛋白、膜通道等的构象和/或相互作用。关于细胞破坏（凋 亡）的信号可能被引发或模拟，和/或保护/内环境稳定的信号可能被抑制。
[0235] 尽管存在科学方面的意义，但实施本发明无需确定针对磷脂酰丝氨酸的裸露抗体 所造成的血管破坏的确切性质。既然这些抗体的施用已显示在体内有利地产生了特异性抗 肿瘤效应，那么该疗法就能应用，而不管造成此现象的分子机制是什么。因此，结合磷脂酰 丝氨酸的裸露抗体的应用代表了肿瘤疗法中的一个重要进展，其在制备和成本上都具有优 势。
[0236] C. 3G4抗体的详细分析
[0237] 如本文所示，3G4是有效且良好耐受的抗肿瘤剂，其通过导向肿瘤血管上的磷脂 酰丝氨酸并引起宿主细胞介导的抗肿瘤效应起作用。因为PS在人和小鼠中是相同分子， 并且在这两个物种中具有相同的细胞分布、调节和通过ROS的诱导（Balasubramanian和 Schroit, 2003 ;Whitworth等人，1990)，所以这些研究进一步支持结合磷脂酰丝氨酸的抗 体和其他构建体在人类中治疗癌症的用途。实际上，已制备了嵌合和人源化形式的3G4用 于这个及其他目的。
[0238] 结合磷脂酰丝氨酸的抗体及其他配体因此可以用于靶向、成像和/或治疗肿瘤 血管。由于下列几个原因，磷脂酰丝氨酸作为肿瘤靶血管是吸引人的：它是丰富的（PS以 3X IO6分子/细胞的量存在）；它在肿瘤内皮的内腔表面上，对于通过血液中的血管靶向剂 的结合来说其是可直接接近的；它在不同实体瘤中在较大百分比的肿瘤内皮细胞上存在； 并且它在所有正常组织的内皮上基本上不存在。
[0239] 3G4抗体已显示特异性地定位于肿瘤中的血管内皮细胞，减少肿瘤血管供应和血 浆容量，并延缓肿瘤生长（本文的实施例；Ran等人，1998 ;Ran和Thorpe，2002 ;Ran等人， 2002b ;Ran 等人，2005 ;Huang 等人，2005)。
[0240] 正在进行的研究已显示，3G4治疗抑制了鼠类肿瘤同种异体移植物和人肿瘤异种 移植物的生长（本文的实施例；Ran等人，2005)，包括同位人乳腺肿瘤（实施例XX ;Huang 等人，2005)和同位人胰腺肿瘤（实施例XX ;Beck等人，2005)。3G4还抑制这些肿瘤的转移 扩散和生长（实施例XX5Huang等人，2005 ;Beck等人，2005)。当组合使用时，3G4增强了分 别用于治疗乳腺肿瘤和胰腺肿瘤的化学治疗药物多西他赛和吉西他滨的治疗效用（实施 例 XX ;Huang 等人，2005 ;Beck 等人，2005)。
[0241] 如同本文使用的其他抗体一样，3G4疗法在用治疗剂量（在小鼠中4mg/kg，一周3 次）重复治疗的带有肿瘤的动物中是良好耐受的。小鼠保留正常的体征、凝血参数、骨髓细 胞构成、白细胞计数和组织学。尽管非常高浓度的3G4的效应可部分抑制磷脂依赖性凝血 途径，但在治疗剂量和延长体内凝血时间的剂量之间存在基本安全范围。3G4因此是有效 且良好耐受的抗肿瘤剂，其通过导向肿瘤血管上的阴离子磷脂并引起宿主细胞介导的抗肿 瘤效应起作用。3G4与在文献中对于与抗磷脂综合征有关的抗体所报道的致病效应没有关 联。
[0242] 抗磷脂综合征（APS)与称为"抗心磷脂"抗体和"狼疮抗凝剂抗体"的自身抗体有 关。这些综合征与向着静脉和动脉血栓栓塞、血小板减少症和许多神经学综合征的倾向相 关联。这些患者中的抗磷脂抗体因此是"致病抗体"。在人群中此类抗磷脂抗体存在于全 身性红斑狼疮中（Branch 等人，1987 ;Staub 等人，1989 ;Drouvalakis 和 Buchanan，1998 ; Smirnov等人，1995 ;Rauch等人，1986 ;Rauch和Janoff，1990)，并且习惯性自然流产相关 (Rote 等人，1995 ;Rote，1996 ;Vogt 等人，1996 ; 1997 ;Katsuragawa 等人，1997)。
[0243] 尽管作为"抗磷脂抗体"和"抗PS抗体"被描述了多年，但此类致病抗体事实上 识别结合心磷脂、PS或两者的蛋白质辅因子，而不是磷脂本身（Galli等人，1990 ;1993 ; McNeil等人，1990 ;Rote，1996)。在致病抗体中存在相当大的异质性。已报道某些抗心磷 脂抗体识别￠2-糖蛋白I上的特定区域，而狼疮抗凝剂抗体识别凝血酶原。类似地，在疾 病状态下出现的抗PE抗体结合与蛋白质组合的PE，所述蛋白质为例如低和高分子量激肽 原（HK)、前激肽释放酶和因子 XI (Sugi 和 Mchityre，1995 ;1996a ;1996b)。
[0244] 因此，在选择用于作为治疗剂进行施用的抗体时，认为此类抗体应当基于不结合 与蛋白质辅因子组合的磷脂酰丝氨酸来进行鉴定，而应当寻找相当"真正的"抗磷脂酰丝氨 酸抗体（W0 2004/006847)。
[0245] 然而，3G4抗体的进一步体外研究显示，与9D2不同，3G4与磷脂酰丝氨酸和阴离子 磷脂的结合在血清完全不存在下被部分抑制。此外，当添加￠2-糖蛋白I(P2GPI)时发 现结合恢复。这促使本发明人相信，3G4识别脂质-P 2GPI复合物中的表位，从而使得3G4 和PS之间的相互作用依赖于P2GPI (于2005年1月24日提交的美国临时申请序列号 60/646, 333 ;Ran等人，2005)。本发明人推断，在体内肿瘤血管上暴露的PS很可能与血清 组分例如P 2GPI复合，并且3G4很可能结合这些复合物。
[0246] 3G4结合PS-P 2GPI复合物的潜力是非常惊人的，不是至少因为3G4在众多研究 中当施用于动物时已显示是安全的，且在文献中对于与APS有关的抗体所报道的致病效应 不相关，那种抗体已知结合磷脂-血清蛋白质复合物，包括PS-P 2GPI复合物。在任何3G4 治疗中没有观察到APS的表现，这与使用针对P2GPI的抗心磷脂抗体所观察到的那些相 反（Matzinger，1998 ;Fadok等人，1998 ;Fadok等人，2001a ;b)。在延长的时期内用高剂量 的3G4治疗的小鼠显示凝血能力没有改变，然而当小鼠注射抗心磷脂或狼疮抗凝剂抗体时 有APS应答。
[0247] 本发明解决了这个矛盾，阐明了对于结合具有暴露的PS的内皮细胞所需的3G4和 3 2GPI的相互作用，并解释了 3G4如何能够结合PS-P 2GPI复合物，而不屈从于与以前已知 的致病抗体相关的毒性。
[0248] 如实施例XXX中所示，3G4和PS之间的相互作用依赖于P 2GPI。尽管P 2GPI在 生理条件下微弱结合阴离子磷脂，但本发明显示，3G4极大地增强了 P 2GPI与PS阳性内皮 细胞的结合。数据显示，二价3G4/P2GPI复合物是增强结合所需的，因为3G4Fab'片段不 结合具有暴露的PS的内皮细胞。还证实了，人工二聚P2GPI构建体无需3G4即可结合具 有暴露的PS的内皮细胞。总之，这些数据暗示，通过经由形成二价3G4/P 2GPI复合物而增 加@ 2GPI对PS的亲和力，3G4靶向PS阳性细胞，包括肿瘤内皮细胞。
[0249] 实施例XXX还显示，3G4结合P 2GPI的结构域II。这是重要的，因为来自APS患者 的识别0 2GPI结构域II的抗体不是致病的。相反，一个重要的近期研究证实，从APS患者 分离的致病性抗P 2GPI抗体通常识别P 2GPI的结构域I (de Laat等人，2005a)。3G4抗体 无需结合P 2GPI结构域I而结合PS-P 2GPI复合物的能力对于缺乏抗体所显示的毒性方 面是重要的。0 2GPI还可与载脂蛋白E受体2'（apoER2'）相互作用（Lutters等人，2003)。 另一项近期研究指出，0 2GPI的结构域V与ap〇ER2'相互作用并且涉及血小板的激活，这 导致血小板至胶原的沉积增加 （van Lummel等人，2005)。
[0250] 因此，通过不结合结构域I或结构域V，3G4抗体可以结合PS-P2GPI复合物， 并根据在各种动物模型中进行的广泛毒理学研究仍显示没有毒性。根据这些发现，结合 PS-P 2GPI复合物的其他抗体现在已制备并在各种病状例如癌症和病毒感染的治疗中安全 使用。选择不显著结合0 2GPI结构域I的抗体目前是主要需求，并且设想选择不显著结合 3 2GPI结构域I或P 2GPI结构域V的抗体以提供另外的优点。
[0251] 在回顾中，新研究已表征了 3G4抗体及其主要阴离子磷脂靶（磷脂酰丝氨酸）之 间的相互作用。数据证实3G4和PS之间的相互作用是血清依赖性的。P 2GPI被鉴别为介 导3G4-PS相互作用所需的血清因子。
[0252] 3G4最初通过用鼠类内皮细胞免疫小鼠而产生，所述鼠类内皮细胞用H2O 2处理以 诱导PS暴露（Example IV ;Ran等人，2005)。细胞生长在含FBS的培养基中并可能注射少量 牛@ 2GPI，导致产生抗PS/ P 2GPI抗体。在牛血清存在下就与PS的反应性筛选初始抗体。 稍后的筛选在血清不存在下进行，但如本文所指出的，从SCM纯化的抗体与P 2GPI抗原一 起共纯化。因此，由于存在污染性的牛0 2GPI，"纯化的"抗体在血清不存在下可以结合PS。 只有当3G4在不含血清的培养基中生长并从中纯化时，才能鉴定出血清依赖性。其他团体 已报道了关于获得不含P 2GPI的抗P 2GPI抗体制剂的类似关注（Roubey等人，1995)。因 此，很可能被报道直接结合磷脂的许多所谓的"抗磷脂抗体"实际上识别对磷脂具有亲和力 的血清蛋白质。
[0253] P2GPI是50-kDa的糖蛋白，其以?200iig/mL(4iiM)的浓度存在于血浆中 (Cleve等人，1969)。该蛋白质是补体调控蛋白（CCP)家族的成员（Steinkasserer等人， 1991)。P 2GPI具有5个CCP重复，其中第1个一第4个结构域是由?60个氨基酸组成的有 规律的重复。第5个结构域不同于其他4个结构域，因为它具有82个氨基酸，包括一串带正 电荷的氨基酸（282 - 287)和负责P 2GPI与阴离子磷脂结合的保守性疏水区（311 - 317) (Steinkasserer 等人，1992 ;Hunt 和 Krilis，1994 ;Sheng 等人，1996 ;Mehdi 等人，2000 ;各 自引入本文作为参考）。
[0254] 关于P 2GPI的正常生物学功能知之甚少。提出的功能包括促进凋亡细胞清除 (Balasubramanian 等人，1997b ;Balasubramanian 等人，2005)、血小板功能的调节（Nimpf 等人，1985 ;Nimpf 等人，1987)和凝血的抑制（Nimpf 等人，1986 ;Schousboe，1985);然而， 在缺乏P 2GPI的小鼠或患者中没有观察到确定的表型（Miyakis等人，2004 ;Yasuda等 人，2000)。
[0255] 相反，众所周知P2GPI涉及自身免疫性病症APS，在其中它已被鉴定为对于所 谓的抗磷脂（aPL)抗体与阴离子磷脂表面结合所需的血浆辅因子（de Laat等人，2004a; Bevers等人，2004)。抗磷脂抗体已知与各种血清蛋白质相互作用，但识别0 2GPI的aPL抗 体与APS的临床症状的关联性最强（de Laat等人，2004b)。因此，已广泛研究了 P 2GPI、抗 3 2GPI抗体和阴离子磷脂膜表面之间的相互作用（Bevers等人，2004)。
[0256] 本研究还检查了 3G4结合经PS包被的微量滴定板和具有暴露的PS的内皮细胞的 特征。使用活细胞结合测定法，确定3G4和P2GPI都不结合具有暴露的PS的内皮细胞， 除非两种分子同时存在（实施例XXX)。这个观察结果与基于ELISA的发现一致，所述发 现证实3G4在结合至阴离子磷脂表面方面依赖于P2GPI。此外，这个观察结果支持了关于 3 2GPI在生理条件下对阴离子磷脂膜具有低亲和力的报道（Willems等人，1996 ;Bevers等 人，2004 fevers等人，2005)，并暗示了 3G4的存在极大地增强了亲和力。
[0257] 数据还证实，3G4经由形成二价P 2GPI复合物增强了 P 2GPI对阴离子磷脂表面的 亲和力。当P 2GPI浓度保持不变并且3G4浓度增加时，3G4/P 2GPI与具有暴露的PS的内 皮细胞的结合在3G4与P2GPI的比率为2:1时到达峰值。在3G4浓度更高时，结合增加。 钟形曲线暗示单价和二价复合物之间有竞争，导致总体3G4/P 2GPI复合物结合减少。对于 血栓形成模型中的抗P 2GPI抗体已报道了钟形曲线关系（Jankowski等人，2003)。在其他 研究中，3G4Fab片段在P 2GPI存在下不结合具有暴露的PS的内皮细胞，这证实单价3G4/ 3 2GPI复合物不能结合阴离子磷脂表面。
[0258] 还证实了人工二聚P 2GPI构建体无需3G4就可结合具有暴露的PS的内皮细胞。 因此，抗P 2GPI抗体通过交联两个P 2GPI分子，形成二价P 2GPI复合物，而增加了 P 2GPI 对阴离子磷脂表面的亲和力。
[0259] 重要地，尽管3G4/ P 2GPI复合物与PS的相互作用很类似来自APS患者的aPL抗 体，但3G4在测试的任何动物模型中都不引起APS的临床表现。aPL引起APS的机制大部分 仍是未知的。某些研究提出，aPL/P2GPI可以结合并激活静止的内皮细胞（其不暴露PS)， 导致它们采取更具有血栓形成性的表型（Simantov等人，1995 ;Pierangeli等人，1999)。 更近期的研究证实，P 2GPI和aPL/P 2GPI复合物不能结合和完全激活内皮细胞除非它们 已"预激活"（Chen等人，2004)。预激活导致内皮细胞暴露PS，从而提供了用于结合aPL/ 3 2GPI复合物的合适的阴离子磷脂表面。
[0260] 在活细胞测定法中3G4不结合静止的ABAE细胞或HUVEC。此外，3G4不激活静止 的HUVEC或用低浓度LPS预激活的HUVEC。近期研究报道了识别患者血清中的P 2GPI结构 域I的aPL抗体存在与APS临床症状之间的高度相关性（de Laat等人，2005)，并且构象变 化可能是抗体结合所需的（de Laat等人，2005b)。还在患者血清中检测到识别0 2GPI的 其他结构域的抗体，但其与发病机理无关。重要地，本发明证实了 3G4识别P2GPI的结构 域II，这可能解释了体外内皮细胞激活的缺乏以及体内毒性的缺乏。
[0261] 小鼠 P2GPI的结构域II在60个氨基酸中只有7个不同于大鼠、狗、牛、黑猩猩和 人3 2GPI的结构域II。因此，3G4不能在小鼠血清存在下结合PS或不能通过免疫印迹检 测鼠类0 2GPI是出人意料的，尤其是考虑到已证明的3G4在小鼠中的抗肿瘤活性（本文的 实施例；Ran等人，2005 ;Huang等人，2005 ;Beck等人，2005)。重要地，使用由SCM纯化的 3G4进行这些研究。如本文所示，由于牛P2GPI的共纯化，3G4SCM能够结合PS。当3G4SCM 在SDS-PAGE凝胶上电泳、转移至膜支持物并就牛P 2GPI的存在进行探测时，50kDa的条带 是清晰可见的。此外，在注射3G4SCM后从小鼠收集的血清中存在的3G4结合PS。因此，牛 3 2GPI能够介导3G4与PS在小鼠血浆中的结合并可能促进3G4的抗肿瘤效应。使用3G4 在小鼠中进行的所有肿瘤研究应当补充牛或人0 2GPI以确保靶向具有暴露的PS的肿瘤内 皮细胞。
[0262] 将P 2GPI鉴定为3G4和PS之间相互作用所需的重要辅因子极大地增强了这种独 特的肿瘤血管靶向剂的了解。通过经由形成二聚0 2GPI复合物而增强P2GPI对阴离子 磷脂表面的亲和力，3G4靶向具有暴露的PS的肿瘤内皮细胞。除了阐明这些特性外，本研 究现在允许开发第三代抗体，其结合在具有血清蛋白质的复合物中的氨基磷脂和阴离子磷 月旨，而不复制致病抗体的特性。
[0263] 总之，现在可以选择在除P 2GPI结构域I内以外的位置处，或者在除P 2GPI结 构域I或结构域V内以外的位置处结合PS和P 2GPI的优选的"第三代"或"非致病性 PS-P 2GPI抗体"。根据本文的数据，目前最优选的抗体是在结构域II内结合P 2GPI的那 些。根据本文描述的方法和筛选技术，例如使用图18A和图18B中的序列信息和实施例XXX 中的结合测定法可以制备一系列非致病性PS-P 2GPI抗体。此类抗体及其免疫缀合物可以 有利地用于病毒感染的安全且有效的治疗以及用于癌症和其他疾病治疗中。
[0264] D?受体-抗体和抗体
[0265] 3G4抗体的前述详细分析以及特别是3G4与P2GPI的相互作用（其与WO 2004/006847中所阐述的形成对比）还促使本发明人开发出本发明的受体-抗体。重要地， 这个发明还提供了称为"受体-抗体"的一系列构建体，其结合磷脂酰丝氨酸并唤起宿主效 应器功能。受体-抗体开发的方面在下文描述。
[0266] 本文呈现的数据显示，用针对磷脂酰丝氨酸的抗体靶向肿瘤血管系统在肿瘤治疗 中是有效的。针对磷脂酰丝氨酸的抗体也显示出在治疗病毒感染中是有效的。考虑肿瘤研 究作为例子，本文显示肿瘤微环境中的应激条件诱导肿瘤血管内皮上的磷脂酰丝氨酸暴露 (实施例VII、实施例II、实施例V和实施例VI)。暴露的磷脂酰丝氨酸提供了用于成像和 治疗的肿瘤血管系统的选择性标记（实施例IX、实施例X、实施例XI和实施例XX)。
[0267] 与肿瘤治疗相关联，针对磷脂酰丝氨酸的抗体损害肿瘤内的血管并引起白细胞浸 润（例如，图1)。此外，此类抗体的施用将巨噬细胞募集到肿瘤内。例如，在使用3G4抗体 的肿瘤治疗研究中，可见血液单核细胞与肿瘤血管内皮的广泛结合以及巨噬细胞大量浸润 到肿瘤间质中（例如实施例XXVII ;图6A、图6B、图6C和图6D)。
[0268] 巨噬细胞浸润到接受治疗的肿瘤中，以及3G4以Fc依赖性方式使骨髓衍生小鼠巨 噬细胞在体外对表达PS的细胞的吞噬速率增加5倍这一发现，是与抗体例如3G4激起巨噬 细胞对于肿瘤血管或肿瘤细胞的细胞毒性相一致的。此外，3G4不直接抑制表达PS的内皮 细胞或肿瘤细胞增殖，或在体外介导细胞的补体裂解，这暗示该抗体不是直接细胞毒性的。
[0269] 因此，本发明人提出了巨噬细胞介导的对于肿瘤血管或肿瘤细胞的损害的两种可 行机制。首先，抗体例如3G4结合肿瘤血管和肿瘤细胞上的阴离子磷脂（主要是磷脂酰丝氨 酸）和血清蛋白质的复合物。随后，抗体经由Fcy受体刺激单核细胞和巨噬细胞的结合， 从而增强抗体依赖性细胞毒性（ADCC)和抗体依赖性巨噬细胞吞噬作用。激活的巨噬细胞 已长久地被认为具有直接的杀肿瘤活性（Whitworth等人，1990)。在对于这一点的支持方 面，Manfredi等人（1998)已报道，抗磷脂抗体可以促进具有TNF-a分泌的大量诱导的清 道夫巨噬细胞对于表达PS的细胞的调理作用。尽管巨噬细胞具有PS受体并且可以结合和 吞食表达 PS 的细胞（Balasubramanian 和 Schroit，2003 ;Utsugi 等人，1991 ;Fadok 等人， 2001a)，但单独的PS暴露不足以刺激吞食（Devitt等人，2003)。
[0270] 其次，抗体例如3G4可以阻断来自表达PS的肿瘤内皮细胞的由PS介导的"静止 期"信号，这通常将会抑制由结合肿瘤血管和肿瘤细胞的巨噬细胞所作出的炎症应答（图 7)。认为类似机制可以解释巨噬细胞谱系细胞对凋亡细胞缺乏炎症应答（Henson等人， 2001 ;Matzinger，1998 ;Gallucci 和 Matzinger，2001 ;Fadok 等人，2001b)。因此，抗体例如 3G4可以通过激起巨噬细胞分泌TNF-a、IL-I及其他炎性细胞因子来引起肿瘤血管损害， 所述细胞因子直接损害肿瘤内皮（图7)并将更多的宿主细胞募集到肿瘤中（Fadok等人， 1998)。
[0271] 理想地，上述可能机制中的每一个应当符合于肿瘤相关的巨噬细胞可以诱导肿瘤 血管发生这一建议，所述肿瘤血管发生促进肿瘤生长（例如Sunderkotter等人，1994)。 因此，本发明人推断，在巨噬细胞的促血管生成效应和其对肿瘤血管和肿瘤细胞的直接 细胞毒性效应之间存在平衡，这通过肿瘤微环境中的局部条件（例如低氧，TGF-￠)确定 (Breier等人，2002)。目前设想，抗体例如3G4以有利于来自巨噬细胞的直接细胞毒性应答 的方式改变肿瘤微环境。
[0272] 考虑到磷脂酰丝氨酸的生物学，和任选地根据本文呈现的关于巨噬细胞在肿瘤治 疗中的行为的数据，本发明人从而提供了一系列有利的结合磷脂酰丝氨酸并任选结合其他 阴离子磷脂的构建体或"受体-抗体"，和相关缀合物以及使用方法。
[0273] 本发明的此类构建体或受体_抗体一般将包括识别并结合磷脂酰丝氨酸并且任 选结合其他阴离子磷脂的结合蛋白或多肽、受体、配体或肽，所述结合蛋白或多肽、受体、配 体或肽连接至抗体或免疫球蛋白Fc区或结构域。Fc区修饰所述结合蛋白或多肽、受体、配 体或肽以增加其生物学半衰期，但更重要的是，提供具有刺激宿主效应器功能的所得构建 体以增强疾病治疗。
[0274] 本发明的受体-抗体可以在任何这样的实施方案中使用，在所述实施方案中可以 使用针对磷脂酰丝氨酸的抗体。此类受体-抗体因此具有多重应用，包括结合肿瘤血管和 肿瘤细胞上的磷脂酰丝氨酸，导致对肿瘤的由宿主细胞介导的抗血管和抗细胞效应，和结 合在病毒或受病毒感染的细胞上的磷脂酰丝氨酸，导致动物中的抗病毒效应。
[0275] 本发明的这些方面的一个优点是，所述受体-抗体使用天然的磷脂酰丝氨酸结合 蛋白、多肽或受体以达到特异性结合。尽管在本文中显示出使用针对磷脂酰丝氨酸的抗体 在许多治疗实施方案中是有效的，但受体-抗体可以具有比抗PS抗体更高的亲合力或特异 性。通过在Fc免疫球蛋白区域上二聚化磷脂酰丝氨酸结合蛋白或多肽（特别是P2GPI)， 构建体达到更佳的亲合力、稳定性、更长的体内半衰期，并且可能更好地定位于表达磷脂酰 丝氨酸的组织，以及刺激体内宿主效应器功能。抗PS抗体在本文中显示出在施用给动物 (包括猴子）时是有效且安全的。同样地，包含天然配体的受体-抗体将是有效且安全的， 并且不会引起抗磷脂综合征。因此，本发明的受体-抗体是简单的、人的、特异的和安全的 治疗剂，其可以用于治疗一系列肿瘤和病毒感染。
[0276] DL磷脂酰丝氨酸结合蛋白
[0277] 受体-抗体中的结合蛋白或多肽、受体、配体或肽可以是几种磷脂酰丝氨酸结合 蛋白中的任何一种，包括细胞来源的受体、因子V、凝血酶原（因子II)等等。使用￠2-糖 蛋白I是更优选的。
[0278] 凝血级联反应中的某些因子也结合磷脂酰丝氨酸并且因此可以用于本发明的受 体-抗体中。例如，因子V和凝血酶原（因子II)结合磷脂酰丝氨酸。在凝血酶原酶复合 物中，因子Va与阴离子脂质表面的结合促进因子Xa的Ca 2+依赖性结合，所述因子Xa将凝 血酶原转化为凝血酶。在两种复合物中，磷脂酰丝氨酸是最有效的阴离子磷脂。因此可以 使用蛋白质C、蛋白质S、因子II/IIa、因子V/Va、因子VII/VIIa、因子IX/IXa和因子X/Xa 这些磷脂酰丝氨酸结合蛋白。
[0279] Fadok等人（2000,特别引入本文作为参考）报道了直接结合凋亡细胞的PS受体 的克隆。这种受体表达于许多细胞类型中，包括巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞。使用抗 体和PS小泡的研究指明，该受体的确识别细胞表面上的磷脂酰丝氨酸。因此，这是PS特异 性受体、"PS受体"或"PSr"（登录号AF304118)。这种受体存在于吞噬细胞例如巨噬细胞 上，以及还存在于其他细胞类型上。Fadok等人（2000,特别引入本文作为参考）的PS受体 因此可以用于本发明的受体-抗体中。
[0280] 可以用于本发明的受体-抗体中的其他磷脂酰丝氨酸结合蛋白描述 在Balasubramanian和Schroit, 2003 (特别引入本文作为参考）中，特别地，参见 Balasubramanian和Schroit, 2003,表2,以及描述在本文引用的参考文献中，其全部特别 引入本文作为参考。这些磷脂酰丝氨酸结合蛋白包括，例如，CD14 ;整合素，例如a 50 3(玻 连蛋白，CD51/CD61)和 a 50 3/CD36 ;几种清道夫受体，例如 SRB(CD36)、SRC(L0X-1、SRCL)、 SRD(CD68、巨噬涎蛋白）和PSOX ;补体受体，例如CR3(CDllb/CD18)(登录号NM000632)、 CR4(CDllc/CD18)(登录号 NM000887)和 CD93(cClqr，钙网蛋白）/CD91(a 2-巨球蛋白受 体）；及其他受体，例如对于表达PS的凋亡细胞的Mer/Gas6吞噬细胞识别配偶体（登录号 AH010001)。
[0281] 尽管膜联蛋白例如膜联蛋白V可以用作受体-抗体中的磷脂酰丝氨酸结合蛋白， 但其用途不是本发明的通用部分。因此，在某些实施方案中，本发明提供了其中磷脂酰丝氨 酸结合蛋白不是膜联蛋白的构建体。但是，提供下列信息用于其中考虑了膜联蛋白的那些 实施方案中。此外，在特别引入本文作为参考的膜联蛋白专利文件中的技术信息，例如关于 表达和缀合的信息，可以用于支持本发明的其他Fc-磷脂酰丝氨酸结合蛋白构建体。
[0282] 在哺乳动物组织中已鉴定出膜联蛋白家族的至少9个成员（膜联蛋白I至膜联蛋 白IX)。在这些之中目前优选的是膜联蛋白V(也称为PAP-I)。关于膜联蛋白的蛋白质和 DNA序列是本领域已知的，这促进了容易地生产在本发明这些方面中使用的重组融合蛋白。
[0283] 引入本文作为参考的美国专利5, 658, 877描述了膜联蛋白I、膜联蛋白I的有效量 及其药物组合物。还描述了治疗动物以预防或减轻内毒素在肺中的不利作用的方法，其包 括将安全量的33kDa膜联蛋白I片段施用到动物的气道中。
[0284] 膜联蛋白V包含一个游离巯基并且不具有任何附着的糖链。由cDNA序列推导出 的膜联蛋白V -级结构显示，膜联蛋白V包括4个内部重复单元（美国专利4, 937, 324 ;引 入本文作为参考）。美国专利5, 296, 467和WO 91/07187也各自引入本文作为参考，因为它 们提供了包含膜联蛋白的药物组合物。
[0285] WO 91/07187提供了膜联蛋白的天然、合成或遗传制备的衍生物和类似物。提供了 具有320个氨基酸的特定膜联蛋白，其包含不同氨基酸以及任选地在316-Cys和2-Ala之 间包含二硫桥。
[0286] 美国专利5, 296, 467整体引入本文作为参考，包括所有附图和序列，用于更进一 步描述膜联蛋白及其药物组合物的目的。美国专利5, 296, 467描述了膜联蛋白克隆、重组 表达和制备。还公开了两个或更多个膜联蛋白的聚集物，所述膜联蛋白例如通过在各自膜 联蛋白上的一个或多个半胱氨酸基团之间的二硫键而连接起来。适合的膜联蛋白起始材料 的另一例子由WO 95/27903(引入本文作为参考）提供，其提供了用于检测凋亡细胞的膜联 蛋白。
[0287] 美国专利6, 197, 278特别引入本文作为参考，用于下列目的：进一步使得能够获 得和提供书面描述以支持一般意义上的膜联蛋白、其安全且有效的体内施用和成像实施方 案。至它们清楚地描述用于制备本发明构建体的合适膜联蛋白起始材料的程度，美国专利 5,627,036 ;TO 95/19791 ;W0 95/27903 ;W0 95/34315 ;W0 96/17618 ;和 WO 98/04294 的诊 断方法中的每一种也特别引入本文作为参考。这些不同文件还涉及有用的重组表达载体。
[0288] 还提供了美国专利5, 632, 986,用于进一步描述从组织提取物中分离的膜联蛋白 (美国专利号4, 937, 324 ;同样引入本文作为参考）和通过重组方法生产的膜联蛋白的目 的。美国专利号5, 632, 986的cDNA克隆和表达载体因此各自引入本文作为参考。
[0289] 美国专利5, 632, 986也特别引入本文作为参考，用于进一步描述膜联蛋白分子的 突变体和变体的目的，所述突变体和变体在一个或多个氨基酸残基上再分或改变，只要磷 脂结合能力基本上不降低。用于使用的合适膜联蛋白因此可以是截短的，例如，以包括一个 或多个结构域或者包含比天然蛋白质更少的氨基酸残基，或者可以包含置换的氨基酸。任 何改变都是可接受的，只要突变蛋白或第二代膜联蛋白分子不包含对于氨基磷脂基本上减 少的亲和力。相同推论应用于除膜联蛋白外的其他蛋白质。
[0290] 膜联蛋白和其他试剂的化学交联也描述在引入本文作为参考的美国专利 5, 632, 986中。简单地通过用血栓溶解剂置换本文描述的Fc区，可以调整所有此类技术以 适合其用途。因此可以使用脂肪族二胺；琥珀酰亚胺酯；杂双官能偶联剂，例如SPDP ;马来 酰亚胺化合物；含间隔物的接头，等等。这些试剂还可与除膜联蛋白外的其他蛋白质一起使 用。
[0291] 更进一步地，美国专利5, 632, 986被特别引入本文作为参考，用于描述包含膜联 蛋白的缀合物的重组生产的目的。因此，将合适的核酸序列连接以产生嵌合编码序列，其从 而产生嵌合蛋白。示例性的表达载体是pKK233-2(大肠杆菌（E. coli))、DPOT (酵母）和 pDSPl. IBGH(哺乳动物）。此类教导通过本文提供的进一步信息得到补充。
[0292] 美国专利6, 312, 694、6, 783, 760和6, 818, 213各自特别引入本文作为参考，以用 于下列目的：进一步使得能够获得和提供书面描述以支持一般意义上的磷脂酰丝氨酸结合 蛋白及其安全且有效的体内施用。这些专利公开了结合性配体组合物，其中治疗剂可操作 地附着至靶向剂，所述靶向剂结合磷脂酰丝氨酸，优选暴露在血管化肿瘤的血管内腔表面 上的磷脂酰丝氨酸，以及使用此类结合性配体及其组合的癌症治疗方法。尽管这些专利没 有教导或提出连接至Fc区的磷脂酰丝氨酸结合蛋白，但将其涉及磷脂酰丝氨酸结合蛋白、 所附着的治疗剂以及安全且有效的体内治疗方法的公开内容特别引入本文作为参考。
[0293] 美国专利6, 312, 694、6, 783, 760和6, 818, 213特别涉及结合性配体，其中治疗剂 可操作地附着至至少第一种磷脂酰丝氨酸结合蛋白。尽管这些专利中的蛋白质连接至治疗 剂并用于递送不含Fc区的治疗剂至肿瘤血管系统，因而不诱发宿主细胞效应器功能，这些 专利特别引入本文作为参考，用于进一步使得能够获得和描述蛋白质缀合物及其安全且有 效的体内施用（包括治疗癌症）的目的。使用这些专利中的信息以及本公开内容中的教导， 从而可以制备一系列受体-抗体，其中磷脂酰丝氨酸结合蛋白或其磷脂酰丝氨酸结合性片 段，现在被连接至Fc区或结构域。
[0294] P 2-糖蛋白1(0 2GP1)目前是在本发明的受体-抗体中使用的优选磷脂酰丝氨酸 结合蛋白质。P 2GP1，也称为载脂蛋白H，是50kDa血浆糖蛋白，其通过其C末端结合带负 电荷的磷脂（Wurm，1984,特别引入本文作为参考）。提供下列登录号：人B2GPI(NP000033， AAP72014 和 1C1ZA)和小鼠 B2GPI(AAH53338, NP038503, CAA69401， BAB2721)。体外 和体内证据表明，02GPI在表达PS的凋亡细胞的清除中起作用（Chonn等人，1995; Balasubramanian 等人，1997 ;Balasubramanian 和 Schroit，1998)。0 2GPI 与吞噬细胞的 相互作用在性质上是静电的，并且蛋白质糖基化对于吞噬细胞识别来说不是关键的。因此， 对于在受体-抗体中使用的0 2GPI的重组生产没有明显障碍。
[0295] 当使用本发明中的@ 2GPI蛋白质、多肽或肽时，所得到的Fc-@ 2GPI构建体称为 " 3 -抗体"。如本文图18A和图18B中所示，P -抗体将优选包括来自P 2GPI结构域V的 脂质结合区。包含整个结构域V的构建体可能是优选的以确保脂质结合。结构域V可以单 独使用，或与其他4个结构域中的一个或多个一起使用。尽管使用全长P2GPI蛋白质是方 便的，但不包含0 2GPI结构域I的￠-抗体在某些方面可以是优选的，因为来自APS患者 的抗体通常识别P 2GPI的结构域I (de Laat等人，2005a)。
[0296] 其他优选的P -抗体是其中两个P 2GPI多肽在Fc区上二聚化的那些。此类P -抗 体在本文显示出在结合在平板上和暴露在细胞表面上的磷脂酰丝氨酸中是有效的。然而， 提供了制备二聚化和多聚化的3 _抗体的其他方法，例如纳米颗粒、脂质体及其他分子支 架。
[0297] D2. Fc 区
[0298] Fc区将被附着、连接或缀合至磷脂酰丝氨酸结合蛋白或多肽、受体、配体或肽，从 而使得所得到的受体-抗体的所需活性基本上不会由于附着Fc区而被破坏。可以采用本 领域已知的任何缀合或接头技术，例如在本文相关部分描述的那些。需要时，可以使用分子 生物学技术来制备融合蛋白，其现在对于本领域技术人员来说是标准作业，如本文再次示 例的。因此，可以将受体-抗体制备为化学缀合物或融合蛋白。
[0299] 在免疫球蛋白的重链内，氨基末端结构域是可变结构域（VH)。重链和轻链的可变 结构域在抗原结合中共同发挥作用。在重链中，可变结构域之后为下列3个恒定结构域： CH1、CH2和羧基末端的CH3。在某些抗体中，存在第4个恒定结构域C H4。短的伸展部分，转 换体（switch)，连接重链可变区和恒定区。铰链连接CH2和C H3 (Fe片段）与抗体的其余部 分（Fab片段）。
[0300] 恒定区的性质决定了除抗原结合以外的各种作用机制。基于其恒定区结构和免疫 功能，抗体分为5个主要类别：IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。相应于不同免疫球蛋白类别的重 链恒定结构域分别称为U、Y、a、S和e。
[0301] 考虑到Fc区提供的效应器功能（Bruggemann等人，1987 ;Riechmann等人，1988 ; Clark，1997 ;Padlan，1994 ;各自特别引入本文作为参考），目前优选的Fc区是用于临床使 用的人IgGl ( Y 1)和人IgG3 ( Y 3)，以及用于在小鼠中的临床前测试的小鼠 IgG2a U 2a)和 小鼠 IgG2b(Y2b)。认为y2是沉默的，因此将不选择来提供效应器功能，尽管它仍是用作 二聚化结构域的有用的人蛋白质。尽管是根据效应器功能而被选择出的，但免疫球蛋白的 Fc片还有助于延长的半衰期，这可以由抗体在肾内的主动再吸附而产生。
[0302] 尽管Fc区和结合构建体的重组表达是方便的，但此类片段还可以通过完整的免 疫球蛋白的蛋白水解而获得，优选通过木瓜蛋白酶这种非特异性巯基蛋白酶。木瓜蛋白酶 消化产生两个相同的抗原结合片段，称为"Fab片段"，它们各自具有单个抗原结合部位，以 及剩余的"Fc片段"。
[0303] 木瓜蛋白酶首先应通过还原在含有半胱氨酸、2-巯基乙醇或二硫苏糖醇的活性位 点中的巯基来激活。贮存的酶中的重金属应当通过用EDTA(2mM)螯合来去除以确保最大酶 活性。酶和底物通常以1:100的重量比混合在一起。孵育后，反应可以通过用碘乙酰胺不 可逆地烷基化巯基或简单地通过透析来中止。消化的完全性应当通过SDS-PAGE进行监控， 并且各个级分通过A蛋白-Sepharose或离子交换层析进行分离。
[0304] 在某些实施方案中，可以使用两个Fc片段，优选两个人Fc片段。在这样的方面，两 个结合蛋白、受体或配体可以与两个Fc片段相组合以制备另一种类型的二价受体-抗体。 对于制备用于人施用的受体-抗体来说，人Fc片段将是优选的。事实上，这是本发明的优 点，因为产生完全人的治疗性构建体。因此，Fc-P 2GPI构建体包括完全人的￠-抗体治疗 剂。
[0305] D3.其他构建体和载体
[0306] 尽管连接Fc区至磷脂酰丝氨酸结合蛋白或多肽是所述受体-抗体发明的优选实 施方案，但磷脂酰丝氨酸结合蛋白还可连接至惰性载体以将长寿命赋予生物活性分子。像 这样，本发明进一步提供了包含可操作地附着至至少第一种惰性载体的至少第一种氨基磷 脂结合蛋白（包括0 2GPI)的构建体。
[0307] 如本领域已知的，载体蛋白质可以用于增加生物学半衰期，并且示例性蛋白质是 白蛋白和球蛋白，例如中性抗生物素蛋白（neutravidin)和链霉抗生物素蛋白。非蛋白质 载体也可用于增加生物学半衰期，例如天然或合成的聚合物，包括多糖和PEG。任何这样的 惰性载体可以附着至本文描述的任何磷脂酰丝氨酸结合蛋白。
[0308] 本发明的其他方面涉及通过除使用Fc区以外的方法制备的P 2GPI二聚体组合 物，以及涉及各种使用方法。本发明特别提供了治疗癌症的方法和治疗病毒感染的方法，包 括向有此需要的动物施用治疗有效量的0 2GPI二聚体。
[0309] 本发明的再进一步方面是脂质体，其包含P 2GPI多肽（无论是否为二聚体形式）， 和包含除附着至Fc区的那些以外的其他P2GPI多肽。像这样，本发明涉及包含至少第一 种3 2GPI多肽的纳米颗粒、脂质体、脂质载体、复合物、混合物、超分子结构、多分子聚集物 或基于脂质的药物递送系统。P 2GPI多肽可以是二聚体，但不必一定是二聚体。P 2GPI多 肽可以附着或不附着至另外的治疗剂。此类脂质体将优选是隐蔽的脂质体，并且在脂质体 核心中可以包含治疗剂。
[0310] 本发明的再进一步的方面涉及P2GPI多肽（除附着至Fc区的P2GPI多肽以外） 的组合物，其中所述P 2GPI多肽可操作地附着至至少第一种治疗剂，以及涉及各种使用方 法。特别优选的是其中0 2GPI多肽可操作地附着至至少第一种细胞因子例如TNFa、IL_2 或IFNa的组合物。在某些实施方案中，所述0 2GPI多肽将是二聚体，并且二聚的P2GPI 多肽将可操作地附着至至少第一种治疗剂，例如细胞因子。特别考虑将任何此类0 2GPI 细胞因子构建体或缀合物用于治疗疾病，包括病毒感染。
[0311] 因此，本发明进一步提供了治疗癌症的方法和治疗病毒感染的方法，包括向有此 需要的动物施用治疗有效量的构建体，所述构建体包含可操作地附着至至少第一种细胞因 子优选TNFa、IL-2或IFNa的P 2GPI多肽。所述P 2GPI多肽可以是二聚的P 2GPI多 肽。
[0312] E.另外试剂的缀合物
[0313] 本发明的构建体和受体-抗体还可用于递送附着的治疗剂至特定靶，例如肿瘤和 肿瘤内血管系统、肿瘤细胞、受病毒感染的细胞和病毒颗粒。尽管不涉及含有Fc区的构建 体，但美国专利6, 312, 694、6, 783, 760和6, 818, 213各自特别引入本文作为参考，以为了获 得其关于附着至治疗剂的氨基磷脂结合蛋白的一般教导。因为本发明的构建体和受体-抗 体还可在安全且有效的抗病毒疗法中使用，所以这些构建体还可有利地连接至一系列已知 的抗病毒剂。
[0314] 在本发明的这些方面，本发明的任何构建体、受体_抗体或P _抗体可以用于制备 缀合物。在此类缀合物中使用的试剂优选包括抗细胞剂或细胞毒性剂、细胞因子、趋化因 子、V型ATP酶抑制剂、蛋白质合成抑制剂、化学治疗剂、抗血管生成剂、细胞凋亡诱导剂、抗 微管蛋白药物、放射性同位素、凝血剂或抗病毒剂。在抗病毒缀合物中，不需要使用第二种 抗病毒剂作为附着的试剂。
[0315] EL抗细胞剂和细胞毒性剂
[0316] 在某些应用中，治疗剂是细胞毒性剂或药理活性剂，尤其是能杀死细胞（特别是 肿瘤内皮细胞、肿瘤细胞或受病毒感染的细胞）或者抑制其生长或分裂的细胞毒性剂、细 胞抑制剂、或者抗细胞剂。
[0317] 抗细胞药剂的范例包括化疗剂，以及细胞毒素。可以使用的化疗剂包括：激素,诸 如类固醇；抗代谢物，诸如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、或氨基喋呤；蒽环霉素；丝裂霉 素 C ;长春花生物碱；秋水仙胺；依托泊苷；普卡霉素；抗肿瘤烷化药剂，诸如苯丁酸氮芥或 苯丙氨酸氮芥。其他实施方案可以包括诸如细胞因子等药剂。基本上可以使用任何抗细 胞药剂，条件是它能够以某种方式成功地缀合至构建体从而能够在靶向的细胞（如内皮细 胞）位点处向血液成分进行靶向、内在化、释放、和/或呈递。
[0318] 可能会有这样的情况，比如靶抗原没有通过与有毒化合物的有效去毒一致的途径 发生内在化，需要靶向化疗剂，诸如抗肿瘤药物、细胞因子、抗代谢物、烷化剂、激素、等等。 目前多种化疗剂和其他药理活性剂已经成功地缀合，并显示药学功能，包括多柔比星、道诺 霉素、氨甲蝶呤、长春花碱、新制癌菌素、大分子霉素、三乙烯亚胺苯醌、和a _鹅膏蕈碱。
[0319] 在其他情况中，可以通过使用DNA合成抑制剂来消除来自基于细胞毒素疗法的任 何潜在副作用，诸如道诺霉素、多柔比星、阿霉素等等。因此这些药剂是用于本发明某些方 面的抗细胞药剂的优选范例。至于抑制细胞的药剂，这些化合物通常扰乱靶细胞的正常细 胞周期，优选使得细胞退出细胞周期。
[0320] 已知多种细胞毒性剂可以缀合。范例包括大量有用的植物、真菌、或细菌衍生毒 素，例如包括各种A链毒素，特别是蓖麻毒蛋白A链；核糖体灭活蛋白，诸如皂草素或白树 毒蛋白；a -帚曲菌素；曲霉素；局限曲霉菌素；核糖核酸酶，诸如胎盘核糖核酸酶；白喉毒 素；和假单胞菌外毒素等等。
[0321] 在此特别地引入众所周知的由Arthur E. Frankel所编的1992毒素书籍 "Genetically Engineered Toxins"（包括附录）作为参考以进一步描述或使得能够在目 的构建体中使用毒素，所述书籍包括大量毒素的一级氨基酸序列。
[0322] 在毒素中，优选使用白树毒蛋白和蓖麻毒蛋白A链。利用白树毒蛋白作为可与标 记结合的免疫缀合物的效应物或毒素部分在美国专利6, 051，230(特别引入本文作为参 考）以及美国专利6, 451，312 (它特别涉及与作为靶向剂的VEGF连接的白树毒蛋白）中有 描述，其中所述标记是血管化肿瘤的肿瘤内血管中表达的，或易于接近而结合它，吸附或定 位在其上。
[0323] 对于篦麻毒素 A链来说，更优选的毒素部分常常是经处理而修饰或除去碳水化 合物残基的蓖麻毒蛋白A链，即所谓的"脱糖基A链"（dgA)。脱糖基蓖麻毒蛋白A链是优 选的，因为它极有效力、半衰期较长，而且进行临床等级和规模的制造在经济上是可行的。
[0324] 从制药学的立场出发，可能希望采用尽可能小的分子而又提供适当的生物学应 答。由此可能希望采用提供适当的抗细胞应答的较小A链肽。为了这个目标，已经发现蓖 麻毒蛋白A链可以通过Nagarase (Sigama)除去30个N末端氨基酸而"截短"，但仍保留适 当的毒素活性。建议需要时可以将这种截短的A链用于本发明的缀合物中。
[0325] 或者，可发现对毒素 A链部分应用重组DNA技术可以提供本发明的额外好处。实 现了有生物学活性的蓖麻毒蛋白A链的克隆和表达后，现在有可能鉴定并制备仍展示适当 毒素活性的更小的肽或变体肽。此外，蓖麻毒蛋白A链已被克隆的事实使得能够应用定点 诱变，由此容易的制备并筛选A链衍生肽，获得可用于本发明的其他有用部分。
[0326] E2?细胞因子
[0327] 细胞因子和趋化因子是可与本发明的构建体、受体_抗体或￠-抗体连接的药 剂的特定实例。可以使用一系列的细胞因子，包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、 IL-11、IL-13、TGF- P、M-CSF、G-CSF、TNF P、LAF、TCGF、BCGF、TRF、BAF、BDG、MP、LIF、0SM、 丁]\^、正^〇、1呖-3。更优选的细胞因子包括11-1〇、11-13、11-2、11-6、11-10、61-〇5卩、 IFN- Y、单核细胞化学吸引蛋白-I (MCP-I)、血小板衍生生长因子-BB (TOGF-BB)和C-反应 蛋白（CRP)等等。尤其优选的例子是TNFa、TNFa诱导物、IL-2、IL-12、IFN-a、INF-3、 IFN-Y 和 LEC。
[0328] TNFa增加了血管的通透性。此药剂预计可用于附着本发明的构建体、受体-抗体 或￠-抗体，尤其是在所产生的缀合物用于治疗癌症的组合疗法中时。所述构建体将递送 附着的TNFa至肿瘤环境中，且在肿瘤中引起的血管通透性的增强将促进第二种抗癌剂渗 透入肿瘤中，因此扩大了全面的抗肿瘤效果。
[0329] 例如，IL-12可与构建体、受体_抗体或￠-抗体连接并用于重新指导宿主防御系 统，从而攻击肿瘤血管。趋化因子LEC (肝脏表达的趋化因子，也称为NCC-4、HCC-4或LMC) 是另一种优选的组分（Giovarelli等人，2000)。LEC对于树突细胞、单核细胞、T细胞、NK 细胞和嗜中性粒细胞是趋化性的，因此能增强宿主介导的抗肿瘤反应。
[0330] E3?凝血因子
[0331] 本发明的构建体、受体_抗体或￠-抗体可与能直接或间接刺激凝血的组分 连接形成凝血配体。为了进一步描述凝血剂的操作性附着形成凝血配体，将美国专利 6, 093, 399、6, 004, 555、5, 877, 289 和 6, 036, 955 特别引入本文作为参考。
[0332] 本发明的构建体、受体_抗体或P _抗体可以直接连接凝血剂或凝血因子，或者可 以连接可结合而后释放凝血剂或凝血因子的第二种结合区。如本文所用，术语"凝血剂"和 "凝血因子"都用于指在适当条件下，优选当到达特定体内环境（诸如肿瘤血管系统）时，能 够直接或间接刺激凝血的成分。
[0333] 优选的凝血因子是组织因子组合物，诸如截短的TF(tTF)、二聚体、多聚体、和突变 TF分子。"截短的TF"（tTF)指通过除去足够多的实现膜结合特性改变的氨基酸序列从而 变成膜结合缺陷型的TF构建物。本文中的"足量"指最初足以使TF分子进入膜或介导TF 蛋白质的功能性膜结合的跨膜氨基酸序列的量。通过除去"足够量的跨膜序列"产生了截 短的组织因子蛋白质或多肽，其结合磷脂膜的能力是缺陷的，使得该蛋白质是不显著结合 磷脂膜的基本上可溶的蛋白质。因此，截短的TF在标准TF测定法中基本上不能够将因子 VII转变成因子Vila，但是仍然保留所谓的催化活性，包括在存在因子Vila时激活因子X。
[0334] 美国专利 5, 504, 067、6, 156, 321、6, 132, 729 和 6, 132,730(特别引入本文作为参 考）进一步描述了这些截短的组织因子蛋白质。优选用于本发明这些方面的组织因子通常 不含该蛋白质的跨膜和胞质区（第220 - 263位氨基酸）。但是，也不需要将截短的TF分 子局限于长度恰好是219个氨基酸的分子。
[0335] 二聚体的组织因子组合物也是有用的。可以以二聚体的形式制备任何截短的、突 变的、或其他组织因子构建物以用于本发明。本领域普通技术人员可以理解，通过分子生物 学和重组表达的标准技术，在同一读码框中制备两个编码区并由表达载体进行表达，可以 制备这些TF二聚体。同样，可以将各种化学缀合技术用于制备TF二聚体。可以在缀合前 对各TF单体进行衍生化。本领域技术人员清楚的知道所有这些技术。
[0336] 如果需要，可以经生物学可释放键连接组织因子二聚体或多聚体，诸如可选择性 切割的接头或氨基酸序列。例如，可使用包含酶切割位点的肽接头，所述酶优先定位于肿瘤 环境或在肿瘤环境内有活性。这些肽接头的例示性形式是供尿激酶、纤溶酶、凝血酶、因子 IXa、因子Xa、或金属蛋白酶（诸如胶原酶、明胶酶、或溶基质素）切割的肽接头。
[0337] 在某些实施方案中，组织因子二聚体还可以包含受阻的疏水性膜插入部分，以便 日后促进组织因子与磷脂酶的功能性联合，但是这只发生于某些特定条件下。正如关于截 短的组织因子的内容中所述，疏水性膜联合序列通常是由于其疏水本质可驱动与磷脂环境 的联合的氨基酸段。同样，脂肪酸可以用于提供潜在的膜插入部分。
[0338] 这些膜插入序列可以位于TF分子的N末端或C末端，或者通常附着于该分子的任 何其他位点，只要它们的附着不阻碍TF构建物的功能特性即可。受阻插入部分的意图是在 TF构建物定位于肿瘤环境前保持无功能，并使得疏水性附着物能够接近并进一步促进与膜 的物理学联合。此外，预计生物学可释放键和可选择性切割序列在这方面特别有用，其中所 述键或序列只在定位于肿瘤环境内并暴露于特定酶或其他生物活性分子时才受到切割或 修饰。
[0339] 在其他实施方案中，tTF构建物可以是多聚体。在此内容中，"多聚体构建物"包含 3个或更多组织因子构建物。"多聚体TF构建物"指包含第一 TF分子或衍生物可操作附着 至少第二和第三TF分子或衍生物的构建物。多聚体可以包含大约3个一大约20个TF分 子。多聚体中的各TF单元也可以通过可选择性切割的肽接头或其他生物学可释放键相连。 此外，正如上文就TF二聚体所述，可以使用重组操作和表达或使用标准合成化学来生成 构建物。
[0340] 可用于本发明的其他TF构建物是激活因子VII的能力缺陷的突变体。本文通常 将这些"因子VII激活突变体"定义为可结合功能性因子VII/VIIa，通过蛋白水解激活因子 X，但是基本上不能通过蛋白水解激活因子VII的TF突变体。因此，这些构建物是缺乏因子 VII激活活性的TF突变体。
[0341] 这些因子VII激活突变体促进肿瘤特异性凝血的能力基于的是它们对肿瘤血管 系统的特异性递送和血浆中低水平存在的因子Vila。在施用了这些因子VII激活突变体缀 合物后,突变体将定位于血管化肿瘤的血管系统内。在定位前，由于TF突变体不能将因子 VII转变成因子Vila，因此它通常不能够在任何其他身体部位启动凝血。但是，在定位于肿 瘤区并积累后，突变体将遭遇来自血浆的足够因子Vila，从而起始外在凝血途径，导致肿瘤 特异性血栓症。也可以对患者施用外源因子Vila。
[0342] 可以制备多种组织因子VII激活突变体中的一种或多种，并用于本发明。现在有 了关于TF上因子VII/VIIa识别位点的充足科技知识。由此可以理解，因子VII活化区通常 位于TF分子的大约第157位一大约第167位氨基酸之间。但是，预计该区域外的残基也可 能与因子VII激活活性有关，由此可考虑在TF序列大约第106位一大约第209位氨基酸之 间的任何一个或多个残基处导入突变（W0 94/07515 ;W0 94/28017 ;引入本文作为参考）。
[0343] 如美国专利 6, 093, 399、6, 004, 555、5, 877, 289 和 6, 036, 955 中所述的，多种其他 凝血因子可以用于本发明，例示性药剂见下文。凝血酶、因子V/Va及其衍生物、因子VIII/ VIIIa及其衍生物、因子IX/IXa及其衍生物、因子X/Xa及其衍生物、因子XI/XIa及其衍生 物、因子Xll/XIIa及其衍生物、因子XIII/XIIIa及其衍生物、因子X激活剂、和因子V激活 剂可用于本发明。
[0344] Russell蝰蛇毒因子X激活剂预计可用于本发明。已生成了对Russell蝰蛇毒液 中存在的因子X激活剂具有特异性的单克隆抗体，并可作为双特异性结合性配体的一部分 用于特异性递送药剂。
[0345] 血栓烷A是由内过氧化物通过血小板微粒体中的环加氧酶和血栓烷合成酶的依 次反应形成的。血栓烷A 2是由血小板产生的，而且由于其能够引起血小板聚集，它还是有 效的血管收缩剂。血栓烷A2及其活性类似物预计可用于本发明。
[0346] 血栓烷合酶和合成激活血小板的前列腺素的其他酶也可在本文中作为"凝血剂" 使用。针对血栓烷合酶的单克隆抗体和血栓烷合酶的免疫亲和纯化是已知的，人血栓烷合 酶的cDNA也是已知的。
[0347] a 2-抗纤溶酶或a 2-纤溶酶抑制剂是人血浆中天然存在的蛋白酶抑制剂，能够有 效抑制由纤溶酶原激活剂诱导的纤维蛋白凝块的裂解。a 2-抗纤溶酶是特别有效的抑制 齐U，预计可用于本发明。
[0348] 由于可以获得a 2-抗纤溶酶的cDNA序列，因此优选重组表达和/或融合蛋白质。 还可以获得针对a 2-抗纤溶酶的单克隆抗体，可用于本发明的双特异性结合性配体实施方 案。这些抗体可用于将外源a2-抗纤溶酶递送至靶位点或储存内源Ci 2-抗纤溶酶，并使其 集中在靶区内。
[0349] E4.抗微管蛋白药物
[0350] 一系列药物可经干扰微管蛋白活性来展现其效果。由于微管蛋白的功能是有丝分 裂和细胞生存所必需的，所以某些"抗微管蛋白药物"是强有力的化疗剂。如本文中所使用 的，"抗微管蛋白药物"指任何这样的药剂、药物、药物前体或其组合，其抑制细胞有丝分裂， 优选地通过直接或间接抑制细胞有丝分裂所需的微管蛋白活性，优选微管蛋白聚合化或去 聚合化。
[0351] 目前了解得更清楚也更优选用于本发明的抗微管蛋白药物包括秋水仙碱；紫杉 烷类，诸如红豆杉醇；长春花生物碱，诸如长春花碱、长春花新碱、和长春碱酰胺；和考布他 汀。其他合适的抗微管蛋白药物是细胞松弛素（包括B、J、E)、多拉司他汀、auristatin PE、 紫杉醇、ustiloxin D、根霉素、1069C85、秋水仙胺、阿苯达唑、阿扎毒素和诺考达唑。
[0352] 如美国专利5, 892, 069、5, 504, 074和5, 661，143 (本文特别引入作为参考）中所 述，考布他汀是通常抑制细胞有丝分裂的雌二醇衍生物。可用于本发明的例示性考布他汀 包括基于考布他汀A、B、和/或D的那些和美国专利5, 892, 069、5, 504, 074、和5, 661，143 中所述的那些。考布他汀A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6、B-1、B-2、B-3和B-4是上述类型的 范例。
[0353] 美国专利5, 569, 786和5, 409, 953 (引入本文作为参考）描述了考布他汀A-I、 A-2、A-3、B-l、B-2、B-3和B-4的分离、结构表征、和合成，以及使用这些考布他汀来治疗肿 瘤生长的制剂和方法。这些考布他汀中的一种或多种都可用于本发明。
[0354] 如美国专利 5, 892, 069、5, 504, 074、5, 661，143 和 4, 996, 237 (本特别引入文作为 参考）中所述，考布他汀A-4也可用于本文。美国专利5, 561，122 (引入本文作为参考）进 一步描述了合适的考布他汀A-4前药，预计可与本发明联合使用。
[0355] 美国专利4, 940, 726 (特别引入本文作为参考）特别描述了命名为考布他汀D-I 和考布他D-2的大环内酯，可与本发明的组合物和方法联合使用。美国专利5, 430, 062 (特 别引入本文作为参考）涉及具有抗癌活性、可与本发明联合使用的芪衍生物和考布他汀类 似物。
[0356] E5.抗血管发生剂
[0357] 抗血管发生剂可用于附着至本发明的构建体、受体_抗体或￠-抗体。许多抗癌 剂作用机制的一部分是具有抗血管发生效用。针对联合疗法所述的任何一种或多种这样的 药剂，包括表E中的药剂，都还可以按本文所述与本发明的构建体、受体-抗体或0 -抗体 缀合。已发现、设计或选择了某些其他药剂，它们的主要作用机制是具有抗血管发生效用。 所说药剂的实例描述如下，其中的任一种都还可以用于制备缀合物或分别用于本发明的联 合疗法中。
[0358] 现在已知大量的酪氨酸激酶抑制剂可用于治疗在多种疾病状态中出现的血管发 生，包括例如美国专利5, 639, 757 (特别引入本文作为参考）描述的4-氨基吡咯并[2, 3-d] 嘧啶，它也可以与本发明联合使用。能够调节经VEGFR2受体的酪氨酸激酶信号转导的有 机分子的其他范例是美国专利5, 792, 771的喹唑啉化合物和组合物，这项专利在此特别引 入，以便描述可以与本发明联合用于治疗血管发生性疾病的其他组合。
[0359] 其他化学类化合物也已经显示可抑制血管发生，而且可用于与本发明的联合。例 如，联合疗法中可以采用类固醇，诸如美国专利5, 972, 922(特别引入本文作为参考）中描 述的抑血管的4, 9 (11)-类固醇和C21-氧合类固醇。美国专利5, 712, 291和5, 593, 990 (特 别引入本文作为参考）描述了沙利度胺及相关化合物、前体、类似物、代谢物和水解产物， 它们也可以与本发明联合用于抑制血管发生。美国专利5, 712, 291和5, 593, 990中的化合 物可以口服施用。表B列出了可用于联合疗法的其他例示性抗血管发生剂，其中列出的每 一种药剂都只是例示而绝非限制。
[0360] 表B.血管发生的抑制剂和负调控剂
【权利要求】
1. 构建体，其包含可操作地附着至至少第一种磷脂酰丝氨酸结合蛋白的抗体Fc区。
2. 权利要求1的构建体，其中所述抗体Fc区可操作地附着至两个β 2GPI多肽，所述两 个β 2GPI多肽各至少包含β 2GPI的结构域V。
3. 权利要求2的构建体，其中所述抗体Fc区可操作地附着至两个β 2GPI多肽，所述 两个β 2GPI多肽各至少包含β 2GPI的结构域V，并且其中所述β 2GPI多肽在附着至所述 Fc区时形成二聚体。
4. 任何前述权利要求的构建体，其中所述抗体Fc区是人抗体Fc区。
5. 任何前述权利要求的构建体，其中所述构建体进一步可操作地附着至至少第一种生 物学试剂。
6. 权利要求5的构建体，其中所述构建体进一步可操作地附着至至少第一种治疗剂。
7. 任何前述权利要求的构建体，其中所述构建体包括在药物组合物中。
8. 权利要求7的构建体，其中所述药物组合物进一步包括至少第二种治疗剂。
9. 权利要求1 一 8中任一项的构建体在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。
10. 权利要求1 一 8中任一项的构建体在制备用于治疗或预防病毒感染的药物中的用 途。
【文档编号】C07K19/00GK104277117SQ201410333397
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2006年1月24日 优先权日:2005年1月24日
【发明者】P·E·斯奥比, T·A·鲁斯特, S·W·金 申请人:得克萨斯大学体系董事会, 派瑞格恩医药公司